微小RNA-196a-2、心房鈉尿肽在原發性高血壓合并心力衰竭患者血清中表達及其臨床意義

黃 輝，邱煒煒，袁 彬，馮 凱

（江蘇省江陰市中醫院心內科，江蘇江陰 214400）

原發性高血壓（essential hypertension，EH）是由遺傳、環境等多種因素引起的心血管綜合征，是心力衰竭（heart failure，HF）發生的重要危險因素［1］。HF 的臨床表現缺乏特異性，容易漏診、誤診，影響預后甚至危及患者生命［2］。因此，尋找能早期診斷HF 的血清標記物顯得至關重要。微小RNA-196a-2（microRNA-196a-2，miR-196a-2）可通過結合3'端非翻譯區并于轉錄水平調控該基因的表達，廣泛參與機體的各種病理、生理過程［3］。心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）是一種肽類激素，主要由心房肌細胞合成并釋放，具有調節血壓及心血管功能的作用［4］。黃穎等［5］研究報道，EH 合并HF 患者血漿微小RNA-196 表達上調，其水平升高與HF 嚴重程度及氨基末端腦鈉肽前體濃度明顯相關。鑒于此，本研究通過檢測血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度，分析其與HF 患者發病及病情嚴重程度的關系，以期為個體化治療及改善患者預后提供理論依據。結果如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2019 年3 月至2020 年9 月江陰市中醫院收治的180 例EH 患者作為研究對象，其中男97 例，女83 例；年齡（56.21±15.80）歲。納入標準：（1）均符合EH 相關診斷標準［6］；（2）臨床資料完整；（3）患者及家屬均知情同意，并簽署《知情同意書》。排除標準：（1）合并有先天性心臟??；（2）嚴重肝、腎功能障礙；（3）有精神疾??；（4）合并惡性腫瘤、急慢性感染等可能影響miR-196a-2表達水平、ANP 濃度的疾病。根據HF 診斷標準［7］，將180 例患者分為HF組（n=74）和非HF組（n=106）。另選取性別、年齡匹配的同期健康體檢者90 名作為對照組，其中男51 名，女39 名；年齡（57.04±16.11）歲。根據美國紐約心臟病協會（New York Heart Associ?ation，NYHA）心功能分級，HF 組患者Ⅱ級23 例，Ⅲ級29 例，Ⅳ級22 例。本研究經本院醫學倫理委員會批準。

1.2 臨床資料收集

收集3 組受試者的臨床資料，包括性別、年齡、體質量指數、EH 病程、吸煙史（吸煙≥3 支/d且持續1 年）、飲酒史（折合飲酒量≥0.04 kg/d 且持續1 年）、EH 分級、心率、左心室射血分數（left ven?tricular ejection fractions，LVEF）、左心室舒張末期容積（left ventricular end diastolic volume，LVEDV）及左心室收縮末期容積（left ventricular end systolic volume，LVESV）情況。體質量指數=體質量（kg）/身高（m）2；EH 分 級［6］：收 縮 壓140～159 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒張壓90～99 mmHg，即為1 級；收縮壓160～179 mmHg 和（或）舒張壓100～109 mmHg，即為2 級；收縮壓≥180 mmHg 和（或）舒張壓≥110 mmHg，即為3 級；采用ACUSON X300 型彩色多普勒超聲診斷儀（德國西門子）進行心動圖檢查，記錄LVEF、LVEDV 及LVESV。

1.3 標本收集

收集EH 患者入院次日及對照組健康體檢時空腹肘靜脈血5 mL，以3 000 r/min 的速度離心10 min，分離血清，分為2 管，1 管用于檢測miR-196a-2 表達水平，另1 管用于檢測ANP 濃度。

1.4 血清miR-196a-2 表達水平檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測血清miR-196a-2 表達水平。采用TRIzol 試劑盒（購自無錫百泰克生物技術有限公司）提取血清中總RNA，并使用cDNA 反轉錄試劑盒（購自江蘇楚天生物科技有限公司）對A260/A280在1.8～2.0 的總RNA 行逆轉錄，合成cDNA產物。miR-196a-2 上游引物：5'-CGTCAGAAGG?AATGATGCACAG-3'，下游引物：5'-ACCTGCGTA?GGTAGGTTTCATGT-3'；內參U6 上游引物：5'-CT?CGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCT?TCACGAATTTGCGT-3'。反應條件為94℃、2 min，94℃、20 s，60℃、34 s，共40 個循環。重復3 次，采用2-ΔΔCt標準化法計算miR-196a-2 相對表達量。

1.5 血清心房鈉尿肽濃度檢測

采用酶聯免疫吸附法檢測血清ANP 濃度，人ANP 酶聯免疫吸附法試劑盒購自泉州市九邦生物科技有限公司，檢測方法參照試劑盒說明書。

1.6 統計學分析

采用SPSS 22.0處理數據。計數資料以［n（%）］表示，行卡方（χ2）檢驗。計量資料均符合正態分布，以（）表示，兩組間比較行t檢驗，三組間比較行單因素方差分析（有差異時以SNK-q法進行兩兩比較）。采用Pearson 檢驗分析EH 合并HF 患者血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度與心功能指標的相關關系。采用多因素Logistic 回歸模型分析影響EH 患者發生HF 的危險因素。以雙側P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組受試者臨床資料比較

3組受試者性別、年齡、體質量指數、吸煙史、飲酒史、心率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；3 組受試者LVEF、LVEDV、LVESV 比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；非HF 組和HF 組患者EH 病程比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；非HF 組和HF 組患者EH 分級、LVEF、LVEDV、LVESV 比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 3 組受試者臨床資料比較 ［n（%），±s］

表1 3 組受試者臨床資料比較 ［n（%），±s］

注：與對照組相比，*P＜0.05；與非HF 組相比，1）*P＜0.05

2.2 3 組受試者血清miR-196a-2 表達水平、ANP濃度比較

非HF 組和HF 組患者血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；HF 組患者血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度均明顯高于非HF 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 3 組受試者血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度比較 ［±s］

表2 3 組受試者血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度比較 ［±s］

注：與對照組相比，*P＜0.05；與非HF 組相比，1）*P＜0.05

2.3 不同心功能分級EH 合并HF 患者血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度及心功能指標比較

心功能Ⅲ級、Ⅳ級EH 合并HF 患者血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度及LVEDV、LVESV 均明顯高于Ⅱ級患者，LVEF 明顯低于Ⅱ級患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；心功能Ⅳ級患者血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度及LVEDV、LVESV 均明顯高于Ⅲ級患者，LVEF 明顯低于Ⅲ級患者，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同心功能分級EH 合并HF 患者血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度及心功能指標比較 ［±s］

表3 不同心功能分級EH 合并HF 患者血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度及心功能指標比較 ［±s］

注：與心功能Ⅱ級比較，*P＜0.05；與心功能Ⅲ級比較，1）*P＜0.05

2.4 EH 合 并HF 患者血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度與心功能指標的相關性

EH 合并HF 患者血清miR-196a-2 表達水平、ANP濃度分別與LVEF呈負相關（r=-0.464、-0.640，P＜0.05），分別與LVEDV 呈正相關（r=0.482、0.661，P＜0.05），分別與LVESV 呈正相關（r=0.478、0.652，P＜0.05），見圖1。

圖1 EH 合并HF 患者血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度與心功能指標的相關性散點圖

2.5 影響EH 患者發生HF 的危險因素分析

將EH 患者是否發生HF 作為因變量，將有統計學意義的指標：EH 分級、LVEF、LVEDV、LVESV、miR-196a-2、ANP 作為自變量行多因素Logistic 回歸分析。結果發現EH 3級、LVEF降低及血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度升高是影響EH 患者發生HF 的獨立危險因素（P＜0.05），見表4。

表4 影響EH 患者發生HF 的危險因素分析

3 討論

EH 患者由于長期的血管外周阻力增加，左心室的負擔加重，導致左心室肥大，最終誘發HF，HF 發生與血壓控制情況及EH 病情嚴重程度密切相關［8-9］。本研究結果也提示HF 發生與EH 病情嚴重程度有關。同時超聲心動圖檢查結果發現，非HF組和HF組患者LVEF較對照組降低，LVEDV、LVESV 較對照組升高，HF 組患者變化更明顯，且心功能分級越高，心功能指標異常越嚴重，提示合并HF 的患者心功能已受到損害。

微小RNA（microRNA，miRNA）可通過抑制蛋白質翻譯或其目標mRNA 的降解這兩種方式參與調控基因表達，在生長發育、代謝等方面發揮關鍵性的生物學作用［10-11］。已有研究證實［12-13］，miRNA與EH、心臟病等心血管疾病發生、發展密切相關。miR-196a-2 是miRNA 家族中重要一員，近年來在心血管疾病中的作用受到越來越多的關注［14］。有研究表明，微小RNA-196a-2 基因多態性與冠狀動脈疾病易感性相關［15］。本研究結果顯示，非HF組和HF 組患者血清miR-196a-2 表達水平較對照組升高，且HF 組患者升高更明顯，提示血清miR-196a-2 表達水平升高可能參與HF 發病。進一步研究發現，心功能Ⅳ級患者血清miR-196a-2 表達水平最高，其次為心功能Ⅲ級患者，心功能Ⅱ級患者血清miR-196a-2 表達水平最低，且血清miR-196a-2 表達水平與LVEF 呈負相關，與LVEDV、LVESV 呈正相關，提示血清miR-196a-2 表達水平越高，EH 合并HF 患者心功能受損可能越嚴重。

ANP的主要作用是降壓，使血管外周阻力減小，當中心靜脈壓升高、血量過多等心房壁受牽拉時，可刺激心房肌細胞釋放ANP［16-18］。Banaszak等［19］研究報道，EH 和腎性高血壓兒童血清N 末端ANP 前體濃度較血壓正常兒童升高，且腎性高血壓兒童血清N 末端ANP 前體濃度較EH 兒童高。還有研究表明，ANP 與心臟壓力和容量負荷的增加有關，其濃度變化可作為評估心肌肥厚和HF 的有效指標之一［20］。本研究結果顯示非HF 組和HF 組患者血清ANP 濃度明顯升高，且HF 組患者血清ANP濃度明顯高于非HF 組患者，提示血清ANP 濃度升高可能與HF 發生有關。同時對HF 組患者心功能進行分級，結果發現不同心功能分級患者血清ANP 濃度從高到低為Ⅳ級、Ⅲ級、Ⅱ級，且與心功能指標LVEF 呈負相關，與LVEDV、LVESV 呈正相關，提示EH 合并HF 患者血清ANP 濃度升高可能與心功能受損程度密切相關。此外，本研究結果還發現，血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度升高是影響EH 患者發生HF 的獨立危險因素，提示臨床檢測血清miR-196a-2 表達水平、ANP 濃度，可能有利于評估EH 患者HF 發生情況，對及時采取措施防治HF 具有一定指導意義。

綜上所述，EH 合并HF 患者血清miR-196a-2表達水平、ANP 濃度升高，且兩者均與心功能指標LVEF、LVEDV 及LVESV 密切相關，同時也是影響HF 發生的獨立危險因素，有望成為防治HF 的血清標記物。但本研究樣本量較少，結果具有一定局限性，尚需擴大樣本深入研究。