胎兒頸項透明層厚度檢測聯合母體血漿miR-22-3p、RIPK1濃度對胎兒先天性心臟病的診斷價值

侯廣霞，臧鵬程，趙 麗，董曉菁

（1.北部戰區總醫院婦產科，沈陽 110016；2.遼寧中醫藥大學附屬第二院電檢科，沈陽 110034）

先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）是先天畸形最常見的類型之一，我國CHD 的發病率約為1%，是出生缺陷引起胎兒死亡的最重要原因之一，嚴重影響患兒生存質量，給家庭造成負擔，因此，對胎兒CHD 做出早期診斷，及時干預治療對于改善不良妊娠結局具有重要意義［1-2］。研究顯示，妊娠早期胎兒頸項透明層（nuchal translu?cency，NT）增厚與胎兒心臟畸形、染色體異常、唐氏綜合征等不良妊娠結局發生密切相關，彩色多普勒超聲（彩超）檢測胎兒NT 厚度在篩查胎兒CHD 中具有重要應用價值［3］，但單一檢測靈敏度不高，聯合其他血液學指標檢測可提高檢測準確性。母體血循環中的微小RNA（microRNA，miR）在胎兒生長受限、子癇、胎兒畸形等妊娠相關疾病中異常表達，可作為其產前診斷的標志物［4-5］。MiR-22-3p 為miR 其中之一，研究顯示，miR-22-3p 與慢性心力衰竭患者不良預后有關［6］。受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（receptor-inter?acting serine/threonine protein kinase 1，RIPK1）是程序性壞死中關鍵的蛋白質分子，參與心肌缺血再灌注損傷、冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑榷喾N心血管疾病的發生、發展［7］。研究表明，冠心病患者血漿RIPK1 濃度升高，對患者預后的評估具有一定價值［8］。目前miR-22-3p、RIPK1 在胎兒CHD 中的報道不多。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測孕婦血漿miR-22-3p 濃度，酶聯免疫吸附法檢測孕婦血漿RIPK1 濃度，超聲檢查胎兒NT 厚度，探討NT 厚度聯合血漿miR-22-3p、RIPK1 濃度對胎兒CHD 的預測價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2018 年3 月至2020 年10 月在北部戰區總醫院產科確診懷有CHD 胎兒的孕婦57 例為觀察對象（CHD 組），年齡為（28.50±5.80）歲，孕周為11～13+6 周。本組孕婦產后經病理或超聲結果證實法洛四聯癥14 例、右位主動脈弓10 例、瓣膜畸形7 例、大動脈轉位6 例、室間隔缺損10 例、單心室3 例、主動脈弓離斷4 例、左旋心3 例。納入標準：（1）產后經病理或超聲結果證實心臟畸形；（2）均為自然妊娠且為單胎的孕婦，11～13+6 周；（3）接受早孕期胎兒NT 厚度測量；（4）隨訪至妊娠結束。排除標準：（1）胎兒合并其他部位畸形；（2）有CHD 家族史、既往存在原發性高血壓（高血壓）、肝和腎疾病、心腦血管疾病及糖尿病等；（3）孕婦不能按照規定時間產檢或不配合隨訪，孕期有陰道大出血或急性胎兒宮內窘迫等；（4）孕婦早孕期服用抗驚厥、高血壓等致畸性藥物或食物；（5）臨床資料不全。選擇同期懷有健康胎兒的孕婦60 名為對照組，且接受早孕期胎兒NT 厚度測量，無CHD 家族史，年齡為（28.70±6.10）歲，孕周11～13+6 周。本研究樣本采集均經過本院倫理委員會批準（倫理批號：20180315），受試對象簽署知情同意書。另收集胎兒性別等資料。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol reagent 購自美國Invitrogen 公司，逆轉錄試劑盒（miScript II RT Kit）、miScript SYBR Green PCR Kit 購自德國QIAGEN 公司，人RIPK1 ELISA Kit 購自上海信裕生物科技有限公司，Applied Bio?systems ABI 7500 型定量PCR 儀購自ABI 公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 采集所有孕婦外周靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，低溫下3 000 r/min，離心10 min后收集血漿，置于-80℃冰箱保存備用。

1.3.2 血漿受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1濃度檢測 采用酶聯免疫吸附方法檢測血漿RIPK1 濃度，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

1.3.3 血漿微小RNA-22-3p濃度檢測 使用TRIzol試劑提取血漿總RNA，使用miScriptⅡRT Kit 逆轉錄得到cDNA，置于-20 ℃保存備用。采用實時熒光定量PCR 檢測miR-22-3p 的表達。反應結束后，以U6 為內參，miR-22-3p 濃度采用2-ΔΔCT分析法進行計算。MiR-22-3p 上游引物序列（5'-3'）：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAG?TTGAACAGTTCT，下游引物序列（5'-3'）：ACAC?TCCAGCTGGGAAGCTGCCAGTTGAAGAA；U6 上游引物序列（5'-3'）：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物序列（5'-3'）：AACGCTTCACGAATTTGC?GT。

1.3.4 胎兒頸項透明層厚度檢查 兩組觀察對象在妊娠11～13+6 周時采用超聲檢測胎兒NT 厚度，采用美國GE 公司的GE-E8 彩色多普勒超聲診斷儀，檢測探頭頻率為3.5 MHz，檢查時孕婦取仰臥位，首先對胎兒進行常規超聲檢測，檢查胎兒生長情況，取胎兒面部正中矢狀切面，測量頭臀長與胎兒NT的厚度。胎兒NT厚度≥2.5 mm則為NT增厚，連續測量3 次，取最大值。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0 進行統計學分析。計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗。計數資料以［n（%）］表示，兩組間比較采用卡方（χ2）檢驗。以Pearson 法 分析miR-22-3p、RIPK1 的相關性。以受試者工作特性曲線（receiver operating charac?teristic curves，ROC）分析胎兒NT 厚度聯合血漿miR-22-3p、RIPK1 在妊娠早期診斷胎兒CHD 的價值。若P＜0.05，則差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組觀察對象的一般資料比較

兩組孕婦年齡、孕周及胎兒性別比較，差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 兩組觀察對象一般資料比較 ［n（%），±s］

表1 兩組觀察對象一般資料比較 ［n（%），±s］

2.2 兩組觀察對象頸項透明層檢查結果比較

結果顯示，與對照組比較，CHD 組胎兒NT 厚度增加，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表2。

表2 兩組觀察對象NT 檢查結果比較 ［±s］

表2 兩組觀察對象NT 檢查結果比較 ［±s］

2.3 兩組觀察對象血漿RIPK1、miR-22-3p 濃度比較

與對照組比較，CHD 組血漿RIPK1 濃度顯著升高，miR-22-3p 濃度顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表3。

表3 兩組觀察對象血漿RIPK1、miR-22-3p 濃度比較 ［±s］

表3 兩組觀察對象血漿RIPK1、miR-22-3p 濃度比較 ［±s］

2.4 miR-22-3p、RIPK1 的相關性分析結果

相關性分析顯示，CHD 組血漿miR-22-3p 與RIPK1 濃度呈負相關性（r=-0.448，P＜0.05），詳見圖1。

圖1 CHD 組血漿miR-22-3p 與RIPK1 的相關性散點圖

2.5 NT 厚度聯合血漿miR-22-3p、RIPK1 對胎兒CHD 的預測價值

NT 厚度預測胎兒CHD 的敏感度為85.96%，特異度為78.33%，截斷值為2.37 mm，曲線下面積為0.836。血漿miR-22-3p 預測胎兒CHD 的敏感度為85.96%，特異度為81.67%，截斷值為0.860，曲線下面積為0.823。血漿RIPK1預測胎兒CHD 的敏感度為80.70%，特異度為85.00%，曲線下面積為0.832，截斷值為3.12 ng/mL。NT 厚度、血漿miR-22-3p、RIPK1 聯合預測胎兒CHD 的敏感度為89.47%，特異度為85.00%，曲線下面積為0.933，敏感度及曲線下面積均高于NT 厚度及血漿miR-22-3p、RIPK1 單獨檢測，詳見圖2。

圖2 NT 厚度聯合血漿miR-22-3p、RIPK1 對胎兒CHD 的預測的ROC 圖

3 討論

CHD 可由多種因素引起，在胚胎發育過程中導致心血管畸形，胎兒出生后會出現生長發育差，引發呼吸急促、心力衰竭等嚴重癥狀甚至胎兒死亡，影響患兒生活質量及生存年限［9］。胎兒在發育過程若染色體異常和循環系統異常，NT 厚度會增加，孕婦常在妊娠10～14 周采用超聲檢測胎兒NT，以排除胎兒生長發育畸形［10］。研究表明，CHD 胎兒NT 厚度增加，其診斷CHD 的靈敏度、特異度分別為84.13%、78.46%，可作為診斷胎兒CHD 的良好指標［11］。本研究結果顯示，與對照組比較，CHD 組胎兒NT 厚度增加，且NT 厚度預測胎兒CHD 的敏感度為85.96%，特異度為78.33%，表明NT 厚度可提示心臟發育異常，對胎兒CHD 具一定預測價值，與先前報道結果類似。

MiRNA 可通過胎盤屏障進入孕婦血循環，與胎兒的生長發育關聯密切，當胎兒出現異常情況時，異常表達的miRNA 進入母體血液中，作為潛在妊娠相關疾病的生物標志物，多項報道顯示，多種miRNA 與胎兒CHD 的發生有關［12-13］。另有研究顯示，在使用血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）建立心肌梗死后心肌纖維化模型中，miR-22-3p 表達下調，過表達miR-22-3p 可靶向抑制血小板活化因子受體（platelet activating factor recep?tor，PTAFR）的表達，顯著抑制心肌纖維化［14］。國內學者朱莎莎等［15］通過對孕早期母體血清中miRNAs表達篩查胎兒CHD 結果顯示，miR-22具有篩查胎兒CHD 的價值，ROC 曲線下面積為0.671，95%CI 為0.525～0.816，其靈敏度88.90%和特異度85.20%均較高，其認為miR-22 可作為產前篩查胎兒CHD的生物標志物。本研究結果顯示，CHD組母體血漿中miR-22-3p 濃度比對照組顯著降低，血漿miR-22-3p 預測胎兒CHD 的敏感度為85.96%，特異度為81.67%，截斷值為0.860，曲線下面積為0.823，本研究與上述學者的研究結果基本一致，提示miR-22-3p 表達水平降低可能與胎兒心臟發育畸形有關，推測miR-22-3p 可能是影響心肌損傷，造成胎兒CHD 的關鍵的生物標志物。

RIPK1 是一類絲/蘇氨酸激酶，參與程序性壞死調節，而程序性壞死可參與心肌缺血、動脈粥樣硬化等多種疾病發生及發展過程，心肌缺血再灌注損傷發生過程中RIPK1 濃度升高，抑制RIPK1表達可顯著減少大鼠心肌缺血再灌注損傷［16］。還有研究表明，胎兒生長受限患兒母體胎盤組織中RIPK1 濃度升高，且主要定位于在合胞滋養層細胞以及細胞亞群，因此其推測RIPK1 可能是導致胎盤細胞程序性壞死的主要因素［17］。國外學者通過小鼠實驗結果顯示，小鼠胚胎成纖維細胞中RIPK1 突 變體D325V 和D325H 不僅增加RIPK1 激活介導的細胞凋亡和壞死性凋亡，同時也會造成促炎細胞因子增多，嚴重可導致小鼠發育過程中胚胎致死［18］。本研究結果顯示，與對照組相比，CHD 組母體血漿中RIPK1 濃度顯著升高，可能是RIPK1 調控程序性壞死而誘導炎癥細胞增多，造成胎兒生長受限，導致胚胎發育異常，最終造成心臟發育異常。相關性分析顯示，CHD 組血漿miR-22-3p 與RIPK1 濃度呈負相關性，表明miR-22-3p、RIPK1 可能存在負向調控關系，共同參與調控心臟發育過程中細胞的凋亡和炎癥因子的分泌，導致心臟畸形。

進一步分析顯示，NT 厚度、血漿RIPK1、miR-22-3p 聯合預測胎兒CHD 的敏感度為89.47%，特異度為85.00%，曲線下面積為0.933，敏感度及曲線下面積均高于NT 厚度及血漿miR-22-3p、RIPK1 單獨檢測，提示NT 厚度聯合血漿miR-22-3p、RIPK1 對胎兒CHD 有一定預測價值，對胎兒心臟病早期篩查具有一定臨床應用意義。

綜上所述，CHD 胎兒NT 厚度增加，母體血漿中miR-22-3p 濃度降低，RIPK1 濃度升高，超聲檢測胎兒NT 厚度聯合母體血漿miR-22-3p、RIPK1濃度檢測對胎兒CHD 具有較高診斷價值，具有一定臨床應用意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。