正相–高效液相色譜法測定菜籽油中菜籽多酚Canolol的研究

李昕陽，李貴友?，楊 微，楊 軍

（四川省糧油中心監測站，四川 成都 610041）

大宗商品油料中，油菜籽產品中的多酚類化合物含量顯著高于其他相應的油料作物種子[1]，油菜籽和菜籽粕中的酚酸總量是豆粕中的5倍，是其他油料作物中的10～30倍[2]。油菜籽中的多酚分為酚酸和單寧，酚酸又包括游離酚酸和酯化酚酸，其中游離酚酸占總酚的9%～16%，芥子酸是主要游離酚酸，占游離酚酸總量的70%～85%[1,3]。Koski[4]等報道：油菜籽中天然存在的芥子酸在高溫高壓下脫酸轉化而成另外一種多酚，即2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酚（2，6-dimethoxv-4-vinylphenol，vinylsyringol）。Wakamatsu[5]等在 2005 年從加拿大低芥酸油菜籽中提取出該物質，經分離提純后鑒定確認，結果顯示該化合物的分子質量為180，結構為C10H12O3，并命名為Canolol。與芥子酸及其他常見抗氧化物如生育酚和抗壞血酸及其衍生物相比，Canolol具有更優越的抗氧化活性及抗誘變、抗癌、抗病原微生物，抑菌等生理活性，因此具有重要的醫藥和營養價值[5-7]。

我國是油菜籽生產和消費大國，產量位居世界前列，每年提供優質食用油約 520萬 t，約占國產油料作物產油量的50%，是我國第一大油料作物[8]。其中濃香型壓榨菜籽油已占菜籽油三分之一的市場份額，在四川地區需求穩定，價格和利潤總體較高，這種以濃郁風味為特點的壓榨濃香型菜籽油，是在高溫高壓下壓榨出油，沒有經過精煉的菜籽油。已有研究表明[4,9-10]未經精煉的植物油中酚類化合物顯著高于經過精煉的植物油，而四川的濃香型壓榨菜籽油中的 Canolol含量更是遠遠高于其他類型菜籽油的多酚含量。為促進實現四川地區菜籽油整體價值的提升，加大影響力，為全產業鏈綜合經濟效益的提升提供強力技術體系支撐，從而促進油菜產業的高質量發展，因此研究開發準確高效地檢測菜籽油中菜籽多酚 Canolol含量的測定方法具有非常重要的應用及經濟價值。

許多分析技術已被報道用于鑒定和定量多酚化合物，報道最常見的技術有薄層色譜法、氣液色譜法、氣相色譜–質譜法和毛細管電泳法，此外，高效液相色譜（HPLC）是應用最廣泛的定量方法之一[11-12]。紙色譜，薄層色譜法操作簡便，成本低廉，但能分離的多酚組分不多且定量不準確，因此較少使用；GC法靈敏度高、分離成分多，但一般用于分離弱極性、易揮發、熱穩定性高的有機化合物；植物多酚是強極性、不易揮發且結構復雜的有機物，故HPLC法在多酚的分離純化上應用較多[13]。Khattab[14]等采用高效液相色譜–二極管陣列檢測法測定了油菜籽中包括芥酸衍生物在內的總酚含量。對10種加拿大西部油菜籽，6種其他商品油菜籽及其對應的菜籽餅粕進行了分析。采用水–甲醇–o–磷酸溶液梯度洗脫分離多酚化合物，流速為0.8 mL/min。芥子堿（SP）和芥子酸（SA）的檢出限和定量限分別為 0.20～0.40 μg/mL和0.50～0.80 μg/mL，回收率均超過98.0%。油菜提取物中總酚、SP和 SA含量分別為9.16～16.13 mg/g、6.39～12.28 mg/g 和 0.11～0.59 mg/g，品種間差異顯著。Wakamatsu[5]等從加拿大低芥酸油菜籽Canola中提取出Canolol，采用薄層色譜法結合高效液相色譜法進行分離提純，用高分辨率的大氣壓力化學電離質譜（APCI）以及液質聯用（LC/MS）進行鑒定確認，結果顯示該化合物的分子質量為180，結構為C10H12O3。并得出當甲醇用量為 70%時，可最大限度地提取油菜籽中的酚類化合物。

目前國內的文獻報道[3,10,15-17]基本僅限于對菜籽多酚的提取、分離純化和活性評價的綜述，檢測方法有行業標準 LS/T 6119—2017《糧油檢驗 植物油中多酚的測定分光光度法》[18]，該標準測定的多酚總量，樣品提取需要經過繁瑣的固相萃取凈化，分析周期長并且消耗的試劑較多，不利于環境保護。而國外對于測定菜籽多酚的文獻報道大多為油菜籽和菜籽粕，樣品提取過程繁瑣，如甲醇氨水處理菜籽粕[19]，甲醇回流提取菜籽和菜籽粕[11]，硅膠柱層析分離提取物[5,7]，固相萃取凈化提取物[4]等，采用反相色譜柱分離測定，同樣存在上述問題。本文側重于研究測定Canolol的方法，旨在挖掘四川地區濃香型菜籽油的價值，體現其區別于其他菜籽油的優點，因此提出測定Canolol這一特征物質。本文采用正相–高效液相色譜法（NP-HPLC）測定菜籽油中菜籽多酚Canolol含量的方法，該方法可直接溶解樣品上機，簡單易操作，溶劑使用少，檢測周期短，準確度高，重現性好。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽多酚標準溶液，0.2 mg/mL：四川普西奧標物科技有限公司；正己烷，色譜純：Kewell科威；異丙醇，色譜純：上海安譜公司；甲醇，色譜純：MREDA。

稱取10 mg（精確至0.01 mg）2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酚（CAS：28343-22-8，純度大于99.0%）于50 mL容量瓶中，用正己烷溶解、定容，混勻。于2～8 ℃保存，有效期1個月。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜儀（Thermo UltiMate 3000 UHPLC），配熒光檢測器：賽默飛世爾科技公司；二醇基硅膠柱（Athena Diol，長250 mm，內徑4.6 mm，粒徑 5 μm）、0.45 μm微孔濾膜：上海安譜公司；萬分之一分析天平（型號ME204，精度0.000 1 g）：梅特勒公司；25 mL棕色容量瓶、50 mL容量瓶：天玻公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 試樣溶液的制備

稱取(0.25±0.1) g（精確至1 mg）試樣于25 mL棕色容量瓶中，先加入一定量的正己烷溶解試樣，再用正己烷稀釋到刻度，混勻。如果溶液不清澈，用0.45 μm微孔濾膜過濾，避光保存，并在當天完成分析。

1.3.2 標準品的配制

將 1.1中配制好的菜籽多酚標準溶液稀釋成一系列梯度濃度：200、500、1 000、1 500、2 000 ng/mL，臨用前現配。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：二醇基硅膠柱（長 250 mm，內徑4.6 mm，粒徑5 μm）；檢測儀器為熒光檢測器，激發波長：298 nm；發射波長：325 nm；流動相：正己烷+異丙醇=96+4，v/v；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.4 數據分析

在儀器的最佳條件下，分別取標準系列溶液和試樣溶液上機測定。以保留時間定性，色譜峰面積多點校正定量，外標法計算試樣中菜籽多酚Canolol的含量。實驗數據用變色龍軟件（Chromeleon software，Version 7.2 SR4）和Excel進行分析。

2 結果與分析

2.1 儀器分析條件的選擇

2.1.1 檢測器和波長的選擇

熒光檢測器靈敏度非常高，其檢出限可達到10–9g/mL，同時具有選擇性好的優勢。本文采用熒光檢測器作為檢測器。文獻[5]報道菜籽多酚的結構為2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酚，紫外光譜表明該化合物具有苯甲酸特征，最大吸收峰在275 nm，同時還表現較強的熒光，本文采用的激發波長為298 nm，發射波長325 nm，實驗結果見2.2，結果表明在此條件下檢測菜籽多酚具有較高信噪比。

2.1.2 色譜分析條件的優化

本文采用正相色譜的方法對樣品進行測定，正相液相色譜以非極性或弱極性溶劑為流動相，溶質與流動相的相互作用較弱，通常是在飽和烷烴（如正庚烷、正己烷）中加入一種極性較大的溶劑（如異丙醚、異丙醇等）作為極性調節劑構成的混合溶劑，可以保持溶劑的低黏度，以降低柱壓和提高柱效，以及提高選擇性，改善分離。國標GB/T 26635—2011《動植物油脂生育酚及生育三烯酚含量測定高效液相色譜法》[20]也采用正相液相色譜分離和檢測生育酚及生育三烯酚含量，其流動相為正庚烷和四氫呋喃，正庚烷價格較高，四氫呋喃毒性較大，因此本文采用的流動相為正己烷和異丙醇。

考慮到待測菜籽油中含有各種酚酸、生育酚和生育三烯酚，按實驗方法1.3改變流動相正己烷和異丙醇的比例，對生育酚、生育三烯酚和Canolol進行分離實驗，結果見圖1～2，樣品測定譜圖見圖3。從圖1～3可以看出：在熒光檢測器激發波長298 nm，發射波長325 nm的條件下，生育酚、生育三烯酚和 Canolol均有響應，菜籽油基質對生育酚、生育三烯酚和 Canolol的測定均沒有干擾；在流動相正己烷+異丙醇=98+2，v/v的條件下，Canolol與δ-生育酚的色譜峰重合；在流動相正己烷+異丙醇=96+4，v/v的條件下，Canolol與生育酚及生育三烯酚的色譜峰完全分離。因此本文采用流動相條件為正己烷+異丙醇=96+4，v/v。

圖1 流動相：正己烷+異丙醇=98+2，v/v的標準溶液色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the volume ratio 98:2 of hexane to isopropanol as the mobile phase

圖2 流動相：正己烷+異丙醇=96+4，v/v的標準溶液色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the volume ratio 96:4 of hexane to isopropanol as the mobile phase

圖3 壓榨濃香型菜籽油色譜圖Fig. 3 HPLC chromatogram of pressed rapeseed oil

2.2 方法的線性范圍和檢出限

按照實驗方法1.3，在相同的色譜條件下測定其峰面積，以濃度x（ng/mL）為橫坐標，色譜峰面積（y）為縱坐標得到標準曲線，并求出相應的線性回歸方程及相關系數，結果見圖4。結果表明：菜籽多酚在濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數r為0.999 5。按照3倍信噪比計算得到的檢出限為15 ng/mL，說明本文方法對菜籽多酚具有較高的檢測靈敏度。

圖4 菜籽多酚標準工作曲線Fig. 4 Standard working curve of Canolol

2.3 方法回收率和精密度測定

按實驗方法 1.3在樣品中添加三個不同濃度水平的菜籽多酚標準溶液，采用同樣的色譜檢測條件重復測定7次，實驗結果見表1，表1表明本文方法的加標回收率在96%～110%之間，精密度在1.5%～2.9%之間。

表1 方法回收率和精密度測定Table1 The recovery rate and precision of the method

2.4 樣品測定

按照實驗方法，我們同時測定了一級菜籽油、浸出菜籽油、壓榨濃香型菜籽油、大豆油、花生油、玉米油中Canolol的含量，結果見表2，其中壓榨濃香型菜籽油為成都市農林科學院收集全國不同地區不同品種的油菜籽采用壓榨工藝生產的菜籽油，共計90個樣品，濃香型菜籽油測定譜圖見圖3。結果表明：一級菜籽油、浸出菜籽油、大豆油、花生油、玉米油中菜籽多酚 Canolol含量為未檢出，濃香型菜籽油菜籽多酚 Canolol含量在190～2 246 mg/kg之間，不同地區的不同品種的油菜籽生產的菜籽油的菜籽多酚含量差異很大，本方法適用于多種植物油的測定。

表2 樣品測定Table 2 Sample determination

3 結論

本文采用正相-高效液相色譜法（NP-HPLC）測定菜籽油中菜籽多酚 Canolol的含量。方法的線性相關系數為0.999，加標回收率在96%～ 110%之間；儀器檢出限為15 ng/mL，精密度優于3%。該方法具有操作簡便、分析時間短、準確度高、環境污染少的特點，本方法的建立對挖掘濃香型菜籽油營養價值和油菜籽品種育種的優選提供技術支撐，對促進實現四川地區油菜籽產業整體價值的提升，加大濃香型菜籽油影響力具有重要意義。