不同市售品牌咖啡渣中抗氧化成分的提取及活性分析

王寒怡，胡煒敏，孫楊瑩，胡奕然，周 銓，周 婷

(杭州師范大學生命與環境科學學院農產品質量安全控制技術研究杭州市重點實驗室， 浙江 杭州 311121)

0 引言

咖啡是世界三大飲料之一，根據國際咖啡組織的統計，2020年全球咖啡消費量超過99億 kg，是世界上交易量最大的商品之一，它為世界帶來巨大經濟效益的同時，也給環境造成了極大的負擔.科學合理飲用咖啡對人體的健康有益.一些研究發現，咖啡消費量與心臟病和癌癥的患病率呈負相關[1]，這也是咖啡越來越受消費者喜愛的原因之一.咖啡渣(SCG)是咖啡飲料及速溶咖啡生產過程中的副產物之一，據統計世界范圍內SCG年產量達600萬 t.此外，我國的咖啡消費市場正處于快速成長期，據產業研究院的報告顯示，消費量正以15%的速度飛漲.然而目前國內SCG主要在垃圾填埋廠中處理，尚未被人們利用起來[2].

大部分SCG具有相似的組成成分，即使經過煮制，SCG依舊富含多糖、木質素、蛋白質、脂質和其他高價值化合物，具有轉變為各種高價值生物產品的潛力[3].像大多數植物原料一樣，SCG組成成分因受很多因素的影響而存在很多差異，比如咖啡豆的自身性質、烘焙工藝[4]等.與許多其他有機廢物不同的是，SCG碳氮比、苯酚含量和酸度很高，直接施用到土壤中并不有利于所有植物生長[5]，因此需要更加科學經濟的處理方式.

SCG中抗氧化成分含量很高，包括酚類化合物、生物堿、黃酮類化合物等，其中酚類化合物是SCG抗氧化性的主要貢獻者.近年來從咖啡渣中提取生物活性成分備受關注，提取方法包括傳統的固液提取、超臨界流體萃取、超聲波或微波輔助提取、生物發酵法等，從咖啡渣中提取酚類抗氧化物質最普遍的提取劑為有機溶劑，其中最常用的為醇類[6-8].

最近有研究表明，采用超分子溶劑進行萃取，得到的SCG提取液總酚含量最高，而且此方法操作快速、簡便、成本低，并且可以在低液料比下有效提取咖啡渣中的抗氧化活性物質[9].還有一些研究表明，SCG提取之前脫去油脂可以提高酚類物質的產率[10]，此外，SCG在提取抗氧化物質之后，還可以用于生產生物乙醇[11]，故SCG的綜合利用很有研究價值.目前國內對于咖啡渣的研究較少，未有針對市售不同品牌咖啡渣展開研究，通常是采用一種SCG為原料進行抗氧化成分的提取，對提取方法展開討論研究.

在此背景下，本研究以5種常見市售品牌的SCG為材料，采用超分子溶劑萃取法提取其活性成分，并對SCG提取液的主要抗氧化物質含量及抗氧化能力進行測定，旨在為SCG的綜合利用提供一定的理論支持，有助于更好地選擇適合提取抗氧化活性物質的原料，為實現分類處理不同來源咖啡渣提供幫助，使SCG的處理方式更科學合理、有針對性.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

從杭州當地各門店收集5種常見市售品牌的咖啡渣，裝入密封袋標記好相應品牌，于-18℃冰箱中冷凍保存以備后續提取.DPPH、TPTZ、綠原酸標準品及主要液體試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，其他主要固體試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司.

1.2 咖啡渣中抗氧化活性成分的提取

根據文獻的提取條件稍加改變[9]，用超分子溶劑萃取法提取SCG中的活性成分.提取分為兩步：第一步為提取劑的制備，提取劑組成為24%正己醇、30%乙醇和46%超純水，按上述體積比將正己醇和乙醇混合后加入超純水靜置.第二步是SCG活性成分的萃取，精確稱取2.1 g咖啡渣，倒入制備好的6 mL提取劑中，3 000 r/min渦流振蕩5 min，6 826 r/min離心20 min，用一次性注射器吸取最上層液體并測量體積，經有機系微孔濾膜過濾后于-18 ℃冷凍保存以待后續測定.

1.3 咖啡渣提取液中抗氧化酚類物質含量測定

1.3.1 不同市售品牌咖啡渣提取液中總酚含量的測定

參考Mussatto等人所使用的福林酚比色法，利用96孔酶標板測定SCG提取液中酚類化合物的總含量，同一樣品平行測定3次，實驗結果取其平均值[12].準確吸取5 μL 0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0、1.5 g/L標準溶液或樣液、60 μL 7.5%(w/v)的碳酸鈉溶液、15 μL福林酚試劑、200 μL蒸餾水至96孔酶標板中，在60 ℃下加熱5 min后冷卻至室溫，在700 nm處測吸光度值.最后以吸光度值為縱坐標，以沒食子酸標準溶液的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，將測得SCG提取液的吸光度值代入沒食子酸的標準曲線，得到其酚類化合物的濃度，SCG的總酚含量以沒食子酸當量(μg/gwetSCG)表示，計算公式如下：

注：C指SCG提取液中酚類化合物的質量濃度，單位為g/L；V指SCG提取液的總體積，本實驗為1.5 mL；m指處理樣品的質量，本實驗為2.1 g.

1.3.2 不同市售品牌咖啡渣提取液中綠原酸、原兒茶酸含量的測定

采用高效液相色譜-紫外分光光度法進行測定，同一樣品連續進樣3次，結果取平均值.用流動相配制50、100、250、500、750、1 000 mg/L質量濃度的綠原酸及原兒茶酸的標準溶液，參考Mussatto等人的色譜條件[12]，對上述綠原酸及原兒茶酸的標準溶液及SCG提取液進行測定.

色譜條件：紫外檢測器波長設置為276 nm，液相色譜柱柱溫為室溫，流動相由體積比1∶8的乙腈和水、10 g/L的醋酸組成，用磷酸調節流動相的pH至2.5，采取等度洗脫的方式，流速設定為0.9 mL/min，進樣量設定為10 μL.

以峰面積為縱坐標，以標準溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，將樣品對應出峰時間下的峰面積代入標準曲線的線性方程，確定SCG提取液的綠原酸及原兒茶酸濃度，SCG中原兒茶酸含量(μg/gwetSCG)及綠原酸含量(μg/gwetSCG)的計算公式如下：

注：式中X指酚酸含量(綠原酸或原兒茶酸)，單位為μg/g wet SCG；C指SCG提取液中被測物質的質量濃度，單位為mg/L；V指SCG提取液的總體積，本實驗為1.5 mL；m指處理樣品的質量，本實驗為2.1 g.

1.4 咖啡渣提取液抗氧化活性的測定

1.4.1 不同市售品牌咖啡渣提取液DPPH清除率的測定

SCG提取液先用甲醇1∶10稀釋，準確吸取各組SCG提取液10 μL至96孔酶標板中，然后加入200 μmol/L的DPPH溶液(現配現用)200 μL，空白對照組用甲醇代替SCG提取液，樣品對照組用甲醇代替DPPH溶液，每組設置3個平行對照，在室溫下黑暗反應30 min后在517 nm處測定其吸光值.按下式計算SCG提取液對DPPH的清除率：

注：式中A1指SCG提取液的吸光值；A2指樣品對照組的吸光值；A0指空白對照組的吸光值.

1.4.2 不同市售品牌咖啡渣提取液清除ABTS+能力的測定

SCG提取液先用甲醇1∶10稀釋，準確吸取各組稀釋后的SCG提取液或Trolox標準溶液(0、0.40、0.60、0.80、1.0、1.2 mmol/L，溶劑為甲醇)50 μL，加入圓底的離心管中，然后加入1 450 μL ABTS+自由基儲存液(現配現用)，每組設置3個平行對照，渦流震蕩1 min后在室溫下黑暗反應30 min，然后在732 nm處測定其吸光值.

以吸光度改變值為縱坐標，以Trolox標準溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線.將樣品體系吸光度改變值代入標曲得到提取液中的Trolox當量，按下式計算TEAC值(mmol/gwetSCG)：

注：式中TEAC指Trolox當量值，單位為mmol/gwetSCG；CTrolox指SCG提取液相當于Trolox標準液的濃度，單位為mmol/L；V指SCG提取液的總體積，本實驗為1.5 mL；m指處理樣品的質量，本實驗為2.1 g.

1.4.3 不同市售品牌咖啡渣提取液Fe3+還原能力的測定

SCG提取液先用甲醇1∶10稀釋，準確吸取150 μLFRAP工作液、15 μL超純水至96孔酶標板中，室溫黑暗下靜置5 min后，吸取5 μL各組稀釋后的SCG提取液或FeSO4標準溶液(2.0、1.0、0.80、0.50、0.20、0 mol/L)，每組設置3個平行對照，室溫黑暗下靜置30 min后在595 nm處測定其吸光度值.

以吸光度值為縱坐標，以FeSO4溶液的濃度為橫坐標，繪制FeSO4標準曲線.將SCG提取液反應后測得的吸光值代入FeSO4標準曲線中，計算出對應的FeSO4濃度后，按下式計算SCG提取液的三價鐵還原能力，以FRAP值表征其抗氧化能力.

FRAP(mmol/L)= 10 CFeSO4

1.5 數據統計與分析

用Excel軟件作標準曲線及樣品各個參數的柱形圖，更加直觀地對各品牌抗氧化物質含量及抗氧化性進行比較，結果均是3次平行實驗的平均值.用SPSS20.0統計軟件對數據進行差異性顯著分析，數據分析結果中各變量P<0.05表示差異顯著，有統計學意義，P<0.01則表示差異達到極顯著水平.

2 結果與分析

2.1 不同市售品牌咖啡渣主要抗氧化成分含量的比較

本實驗采用的材料是5種市售品牌的SCG，SCG富含抗氧化活性物質，包括酚類化合物、生物堿、黃酮類化合物等，其中酚類化合物是SCG抗氧化性的主要貢獻者.綠原酸和原兒茶酸是酚酸，屬于酚類化合物，含有多個酚羥基，普遍存在于SCG提取液中，具有良好的抗氧化活性[9].故本實驗選擇對SCG中的總酚、綠原酸和原兒茶酸通過外標法進行定量分析，實驗結果如下所述.

2.1.1 總酚含量結果分析

除了L品牌與S品牌、L品牌與T品牌無顯著差異外，其余品牌之間總酚含量的差異都比較顯著(P<0.05).T品牌、L品牌、S品牌的SCG中總酚含量相當，均在600 μg/gwetSCG附近，明顯高于K品牌與M品牌，K品牌與M品牌的SCG中總酚含量分別為439、398μg/gwetSCG，約為T品牌、L品牌、S品牌的三分之二(圖1).

圖1 不同市售品牌咖啡渣的總酚含量Fig.1 The TPC in SCG of different commercially available brands

2 不同市售品牌咖啡渣的綠原酸含量Fig.2 The content of 3-CQA in SCG of different commercially available brands

2.1.2 綠原酸含量結果分析

M品牌與L品牌的綠原酸含量相近，兩者差異性不顯著，其余各品牌的綠原酸含量差異均達極顯著水平(P< 0.01).T品牌SCG的綠原酸含量遠高于其他幾個品牌，剩下4個品牌SCG中綠原酸含量由高到低依次為K品牌、M品牌、L品牌、S品牌、T品牌的綠原酸含量為其余4個品牌的2～18倍，為K品牌的2.8倍，S品牌的18倍多(圖2).

2.1.3 原兒茶酸含量結果分析

各品牌SCG的原兒茶酸含量差異均極為顯著(P< 0.01).L品牌、S品牌、T品牌SCG中原兒茶酸含量在80μg/gwetSCG附近，遠高于M品牌與K品牌，約為M品牌的4倍，K品牌的2倍(圖3).

圖3 不同市售品牌咖啡渣的原兒茶酸含量Fig.3 The content of PCA in SCG of different commercially available brands

圖4 不同市售品牌咖啡渣提取液的DPPH清除率Fig.4 The DPPH radical scavenging capacity of SCG extracts of different commercially available brands

結合圖2、3的數據，可以發現，原兒茶酸含量接近綠原酸含量的10倍，所以綠原酸的含量相對原兒茶酸來說較小.此外，結合圖1、圖2數據對總酚含量及原兒茶酸含量進行比較，可以得出結論：原兒茶酸占總酚含量的16% 左右，還含有其他酚類物質.本實驗色譜條件下，綠原酸在13 min出峰，原兒茶酸在8 min出峰，兩者皆峰形好、保留時間適中，并且通過觀察各品牌SCG提取液的色譜圖可以發現它們峰的種類及數量均有不同，由此可以得出各品牌SCG的活性物質組成差異較大，這可能與各品牌所用咖啡豆的品種、產地、收獲后的加工工藝不同有關.

2.2 不同市售品牌咖啡渣提取液抗氧化能力的比較

評價植物提取物的抗氧化活性的方法有很多，本實驗用體外總的抗氧化能力評價SCG提取液的抗氧化活性，依據抗氧化物質具有捕獲自由基及還原氧化態物質的原理進行SCG提取液抗氧化活性的測定分析.具體采用的方法是DPPH自由基清除法(DPPH法)、ABTS自由基清除法(ABTS法)、鐵離子還原法(FRAP法)，這3種方法較為廣泛地應用于天然提取物的抗氧化能力測定，并且多種方法結合可以較為全面分析一種物質的抗氧化能力，實驗結果如下所述.

2.2.1 DPPH清除率結果分析

各品牌SCG提取液DPPH清除率差異顯著(P<0.05)，除了T品牌與S品牌，其余各品牌之間的差異均達極顯著水平(P<0.01).S品牌、T品牌和L品牌的SCG提取液DPPH清除率大于40%，其中清除率最高的是S品牌，清除率約為K品牌的2.5倍，M品牌的SCG提取液DPPH清除率略高于K品牌，但與其余3種相差較大，S品牌、T品牌和L品牌的SCG提取液抗氧化能力明顯強于M品牌和K品牌(圖4).

2.2.2 ABTS+捕獲能力結果分析

5種市售品牌SCG的Trolox當量介于7～8mmol/gwetSCG之間，均表現出較好的抗氧化活性[13]，但各品牌SCG提取液的ABTS+捕獲能力仍差異顯著(P<0.05)，由高到低為L品牌、S品牌、T品牌、K品牌、M品牌(圖5).

圖5 不同市售品牌咖啡渣提取液捕獲ABTS+能力Fig.5 The ABTS+ radical scavenging capacity of SCG extracts of different commercially available brands

圖6 不同市售品牌咖啡渣提取液FRAP值Fig.6 The Fe3+ reducing capacity of SCG extracts of different commercially available brands

2.2.3 Fe3+還原能力結果分析

T品牌和S品牌的FRAP值相近，兩者的Fe3+還原能力差異不顯著，其余各品牌SCG提取液Fe3+還原能力差異顯著(P<0.05)，各品牌SCG提取液的Fe3+還原能力由高到低為S品牌、T品牌、L品牌、M品牌、K品牌(圖6).

總的來看，T品牌、M品牌、K品牌、S品牌、L品牌這5個品牌SCG的DPPH清除率與FRAP值趨勢一致，結論是S品牌>T品牌>L品牌>M品牌>K品牌，其中S品牌與T品牌的差異并不明顯，故S品牌SCG中可清除DPPH自由基、還原Fe3+的活性成分含量與T品牌的咖啡渣活性成分含量相當，并列第一，L品牌咖啡渣有效成分含量次之，M品牌SCG的活性成分含量排名第四，而K品牌中活性成分的含量最少.此外，各品牌咖啡渣TEAC值的高低順序與以上兩者稍有不同，L品牌最高，其余順序保持不變，不過從其數值上分析可捕獲ABTS+能力的活性成分含量均比較可觀.

2.3 SCG提取液的抗氧化能力與抗氧化物質含量的相關性分析

通過對5種市售品牌咖啡渣主要抗氧化活性成分酚類物質含量與其提取液的抗氧化能力的統計分析可知，SCG總酚含量因其品牌不同而有很大差異，不同市售品牌SCG的抗氧化活性存在差異，其中T品牌、S品牌及L品牌的SCG提取液抗氧化能力優于M品牌和K品牌.S品牌、T品牌、L品牌的SCG總酚含量也較高，使用它們作為原料，采用相同的提取方法所獲得的SCG提取液抗氧化活性較高，說明SCG提取液抗氧化活性與SCG總酚含量有一定的相關性，這與藥食兩用植物的抗氧化活性及其與總酚的相關性分析及漿果類多酚類物質與抗氧化活性的研究結果相符合[14-15].用SPSS進行相關性分析的結果為顯著相關.

3 總結與討論

采用醇類為提取劑提取并測定植物原料中的抗氧化物質，SCG的總酚含量可達20～30 mg/gdry SCG，與其他重要的抗氧化物質原料的總酚含量進行比較，如成熟樹莓(12.0～15.3 mg/g干物質)、黑莓(12.1～14.8 mg/g干物質)[16]和杏仁殼(22.0 mg/g干物質)[17]，可以發現SCG的總酚含量較高.將在本實驗提取條件下得出的實驗結果與上述報道值比較，顯然，此提取方法的提取率還不夠高，這主要是因為實驗采用的原料是濕基SCG.但此提取方法的液料比低、操作簡便、提取時間短，故其時間及經濟成本低且此法提取得到的SCG提取液活性成分的質量濃度是其他常見方法的2～3倍，高達0.9 mg/mL.

另外，通過比較各品牌SCG中綠原酸及原兒茶酸含量，觀察其數值大小，并結合SCG提取液的抗氧化能力進行分析可得，其綠原酸含量與抗氧化能力變化趨勢不一致，推斷出綠原酸不是SCG中抗氧化活性的主要貢獻者.原因可能是咖啡豆中的綠原酸在烘焙過程中發生裂解損失掉大部分，且在煮制過程中被萃取到咖啡中，最終SCG中綠原酸含量較其他抗氧化物質低.不過本實驗未對SCG中其他酚類抗氧化物質進行研究，若要明確SCG中各酚類單體與其抗氧化活性的關系及其對總抗氧化能力的貢獻率，還要進行深入研究.

Abbasi-Parizad等人采用HPLC、HPLC-DAD和LC-ES-MS對葡萄渣、咖啡渣、番茄渣和紅玉米芯4種農產品加工廢棄物的乙醇提取物中的酚酸、黃酮類化合物和花青素進行了完整的表征， 并且圍繞其清除DPPH自由基的能力和抗炎能力展開了研究，結合各副產品的相關信息，得出咖啡渣的再利用最適宜進行開發達到工業化水平.該研究還對SCG中的酚類物質進行了進一步表征，其實驗結果為芹菜素、表兒茶素、山奈酚和柚皮苷查爾酮是清除DPPH的主要成分[18].故采用咖啡渣再利用工業化具有一定的可行性，且上述明確貢獻率的深入研究已存在供參考的方法.

最后若要在這5種市售品牌SCG中選擇抗氧化酚類物質的提取原料，推薦選擇S品牌、T品牌、L品牌.考慮到本實驗提取方法提取率及反應體系較小的局限性，只適用于實驗室進行前期工作的初步研究，后續研究工作需要對此法進行優化并擴大反應體系后與其他方法結合，使其適用于工廠實際生產，實現食品加工廢棄物SCG的資源化.