樂都紫皮大蒜4種病毒多重RT-PCR檢測技術的建立

張 超，董怡衡，岳 苗，衛 唯，張 謙，王 樂，尹 衛，王煜偉，梁 健

(青海大學 省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海 西寧 810016)

大蒜(AlliumsativumL.)屬百合科蔥屬植物，其主要生殖方式為無性繁殖，通常采用鱗莖繁殖。但無性繁殖會使病毒在大蒜營養器官中積累，并通過母體鱗莖垂直傳染給子代，導致大蒜種性退化,產量下降。

大蒜病毒常呈復合性侵染出現，侵染后的鱗莖發育遲滯、品質變差，嚴重影響大蒜的經濟價值。本課題組通過對青海樂都紫皮大蒜進行全長轉錄組測序發現，樂都紫皮大蒜被洋蔥黃矮病毒(onion yellow dwarf virus,OYDV)、大蒜潛隱病毒(garlic latent virus,GLV)、大蒜D病毒(garlic virus D,GarVD)和大蒜X病毒(garlic virus X,GarVX)4種病毒復合侵染。目前，已報道的侵染蔥屬植物的病毒性病原主要有3大類，其中洋蔥黃矮病毒屬于第一大類馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，由Giddings和Henderson等于1916年在洋蔥植株上發現，主要表現為植株矮化和葉片黃化[1-2]，此后該病毒在世界范圍內廣泛傳播[3]。大蒜潛隱病毒屬于第二大類香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)，最早由van Dijk[4]在1993年發現，該病毒主要由蚜蟲以非持久方式傳播，其為單鏈正義RNA 病毒，基因組RNA包裹在長610～690 nm 的線狀病毒粒子中，在荷蘭、中國、德國和日本等都有報道[5-7]；大蒜X病毒和大蒜D病毒屬于第三大類青蔥X病毒屬(Allexivirus)。1995年Arshava等[8]確定了青蔥X病毒屬的成員，其中大蒜X病毒(GarVX)是一種單鏈正義RNA病毒，侵染范圍很廣，危害超過65種農作物和觀賞植物[9-13]；陳炯等[14]研究發現，大蒜X病毒與大蒜D病毒的序列相似性較高，且我國境內已鑒定的大蒜X病毒與大蒜D病毒均具有較高的相似性。

大蒜病毒的檢測方法有多種，包括傳統的指示植物法、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，以及現有的病毒血清學鑒定、電鏡法和分子生物學方法等相關技術。在分子生物學方法中，聚合酶鏈式反應法因其靈敏度高、特異性強，被廣泛應用于病毒的檢測和鑒定[15-17]。在本研究所涉及的4種病毒中，洋蔥黃矮病毒的檢測多通過RT-PCR和ELISA方法進行[18]；大蒜潛隱病毒檢測則采用較為傳統的指示植物法和DAS-ELISA法，但需使用RT-PCR進一步提高檢測的特異性與靈敏度，避免假陽性[19]；大蒜X病毒(GarVX)與大蒜D病毒(GarVD)，可使用反轉錄環介導等溫擴增技術( RT-LAMP) 進行檢測。前期部分研究已針對大蒜病毒開展了多重檢測體系的開發工作，如許蕊等[20]在甘肅‘成縣遲蒜’上針對GLV、LYSV、OYDV 3種病毒所建立的多重檢測方法；汪沛[21]在湖南長沙、茶陵感病大蒜上針對OYDV、 LYSV、SLV、Allexiviruses 4種病毒建立了檢測方法。相較于單一RT-PCR，多重RT-PCR實現了一次反應多目標同時檢測，可提高效率，降低檢測成本。為此，本研究通過優化引物設計和反應條件，建立了一種可同時檢測樂都紫皮大蒜OYDV、GLV、GarVD和GarVX 4種病毒的多重RT-PCR技術體系，以期為樂都紫皮大蒜病毒快速檢測、脫毒效果判定等實際需求提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究以青海樂都紫皮大蒜，以及從重慶(CQ)、云南(YN)、安徽(AH)、新疆(XJ)、內蒙古(NMG)、張掖(ZY)、四川(SC)、山東(SD)、天津(TJ)、海南(HN)、遼寧(LN)和貴州(GZ)12個地區引入青海樂都種植的大蒜品種為試驗材料。于生長盛期采集大蒜葉片，迅速置于液氮中速凍，帶回實驗室后轉入-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 樂都紫皮大蒜葉片總 RNA 提取

采用天根RNAprep 總RNA抽提試劑盒提取樂都紫皮大蒜葉片總RNA，吸取2 μL用于凝膠電泳，檢測RNA完整性。測定濃度后分裝備用。

1.3 RT-PCR檢測

1.3.1 RT-PCR引物設計 根據NCBI中收錄的OYDV病毒外殼蛋白基因序列[20]，以及通過全長轉錄組測序獲得的病毒(GLV、GarVD和GarVX)序列[22]，利用Oligo 6.0 軟件設計引物。GLV病毒有6條相關序列(2760、21764/1564、2396、2186、2817、2810)，設計7對引物；GarVD有1條相關序列(3228)，GarVX有1條相關序列(3916)，各設計3對引物。以上序列提交至GenBank，序列號為：OM304365～OM304372，序列引物信息詳見表1。

表1 本研究所用引物信息

1.3.2 單一RT-PCR反應體系及反應程序 單一RT-PCR反應體系：cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，EX-taq酶(TaKaRa公司)12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，共25 μL。反應程序:95 ℃預變性 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。電泳檢測PCR產物。

1.3.3 多重 RT-PCR反應條件的優化 多重RT-PCR體系先篩選引物，退火溫度設置為54，55，57，59 ℃；cDNA模板體積設置為1.5，2.0，2.5，3.0 μL；先等量混合上下游8條引物，向PCR體系中分別加0.5，1.0 μL。根據以上參數優化反應條件。

1.3.4 多重RT-PCR反應體系及反應程序 將最優GLV引物、GarVD引物、GarVX引物及OYDV引物共4對多重RT-PCR引物，按體積比1∶1混合得到混合引物(表1)。多重RT-PCR反應體系：模板體積2.5 μL(分別為樂都紫皮大蒜cDNA和12個不同品種大蒜資源的cDNA)，混合上下游引物各1 μL，EX-taq酶12.5 μL，ddH2O補充至25 μL。多重RT-PCR反應程序與單一RT-PCR基本相同，唯一不同的是延伸環節為72 ℃延伸90 s。電泳檢測PCR產物。

單一RT-PCR和多重RT-PCR的擴增產物亞克隆至pMD20-T載體，挑選陽性克隆測序后進行序列分析。

1.3.5 多重RT-PCR的靈敏度測定 取1 μL樂都紫皮大蒜cDNA,按10倍稀釋度逐級稀釋成5個濃度梯度(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5)，每個濃度取1 μL cDNA為模板分別進行單一和多重RT-PCR擴增，電泳檢測PCR產物，測定反應靈敏度。

2 結果與分析

2.1 樂都紫皮大蒜葉片總RNA的提取

提取的樂都紫皮大蒜葉片總RNA電泳后可見28S、18S、5.8S 3條清晰條帶。經OD260/OD280檢測，樂都紫皮大蒜葉片RNA的質量濃度為5 114.3 ng/μL，OD260/OD280為2.0，可用于后續試驗。

2.2 樂都紫皮大蒜4種病毒的單一RT-PCR

以樂都紫皮大蒜cDNA為模板，用單一RT-PCR擴增OYDV、GLV、GarVD和GarVX病毒。OYDV引物擴增產生的目的條帶單一明亮，條帶大小為1 232 bp(圖1)，可作為后續多重PCR的引物。GLV病毒的電泳結果顯示，條帶均單一、明亮、清晰，條帶大小為750～1 000 bp(圖2)。從GLV的6條電泳結果中選取全長轉錄組測序號2186的引物進行后期的多重PCR。用GarVD和GarVX引物進行擴增(每個3對，共6條)，GarVD的D-1為287 bp，D-2為506 bp，D-3為763 bp；GarVX的X-1為116 bp，X-2為503 bp，X-3為778 bp，條帶單一明亮，均可作為后續多重PCR的備選引物(圖3)。

M.DNA Marker；1～2.OYDV病毒單一RT-PCR

M.DNA Marker；1.GLV 2760；2.GLV 21764/1564；3.GLV 2396；4.GLV 2186；5.GLV 2817；6.GLV 2810；7.GarVD 3228；8.GarVX 3916

M.DNA Marker；D-2.GarVD-SMPCR-3228引物單一RT-PCR；D-1.GarVD-SPCR-3228-1引物單一RT-PCR；X-1.GarVX-SMPCR-3916引物單一RT-PCR；X-2.GarVX-SPCR-3916-1引物單一RT-PCR；D-3.GarVD-SPCR-3228-2引物單一RT-PCR；X-3.GarVX-SPCR-3916-2引物單一RT-PCR

2.3 樂都紫皮大蒜4種病毒的多重RT-PCR

用單一RT-PCR驗證后，選取GLV病毒的GLV-SMPCR-2186引物，同時加入GarVD病毒的GarVD-SMPCR-3228引物、GarVX病毒的GarVX-SMPCR-3916引物和OYDV病毒的OYDV-SMPCR 引物進行4種病毒的多重PT-PCR，模板為樂都紫皮大蒜cDNA。條件優化結果顯示：在同一體系下改變模板濃度與PCR的退火溫度進行體系優化，在54～59 ℃中，55 ℃下條帶最明顯，故選定55 ℃為多重RT-PCR反應的退火溫度(圖4)；cDNA模板使用量為1.5～3.0 μL進行優化時，差異不明顯，經多次對比，選定2.5 μL為最優濃度(圖5)；引物濃度從0.5 μL至1.0 μL間最優的為1.0 μL(圖6)。因此，最終確定多重RT-PCR的最佳反應條件為：退火溫度55 ℃，模板用量2.5 μL，引物用量各1.0 μL。

M.DNA Marker

M.DNA Marker

M.DNA Marker

在此條件下，在一個反應體系中穩定擴增獲得了條帶大小分別為1 232 bp(OYDV)，831 bp(GLV)，506 bp(GarVD)和116 bp(GarVX)的PCR產物，成功構建了樂都紫皮大蒜4種病毒的多重RT-PCR體系(圖7)。

2.4 樂都紫皮大蒜4種病毒多重RT-PCR的靈敏度檢測

對梯度稀釋的樂都紫皮大蒜樣品cDNA進行單一和多重RT-PCR的靈敏度檢測。結果(圖8)顯示，單一PCR反應中，OYDV的檢測限為10-2稀釋梯度，GLV的檢測限為10-4稀釋梯度，GarVD的檢測限為10-3稀釋梯度，GarVX的檢測限為10-1稀釋梯度。多重RT-PCR反應中，OYDV、GLV、GarVD和GarVX的檢測限分別為10-2，10-3，10-2，10-1稀釋梯度，可見多重RT-PCR檢測的靈敏度略低于單一RT-PCR。

M.DNA Marker;A、B、C、D分別是OYDV、GLV、GarVD和GarVX的單一PCR擴增；E是4種病毒的多重PCR擴增

2.5 12份大蒜種質資源的多重RT-PCR檢測

為驗證本試驗所構建多重PCR檢測方法的有效性，本研究選取從省外引進的12種大蒜資源進行了病毒多重PCR檢測，結果見圖9和圖10。

M.DNA Marker;HN.海南；NMG.內蒙古；XJ.新疆；LN.遼寧；AH.安徽；YN.云南；CQ.重慶；GZ.貴州；TJ.天津；SC.四川；SD.山東；ZY.張掖

M.DNA Marker;HN-O.海南OYDV病毒；HN-L.海南GLV病毒；CQ-D.重慶GarVD病毒；CQ-O.重慶OYDV病毒；CQ-L.重慶GLV病毒；SC-X.四川GarVX病毒；SC-L.四川GLV病毒；SC-O.四川OYDV病毒；NMG-L.內蒙古GLV病毒；NMG-X.內蒙古GarVX病毒；NMG-O.內蒙古OYDV病毒；GZ-L.貴州GLV病毒；GZ-X.貴州GarVX病毒；LN-L.遼寧GLV病毒；LN-O.遼寧OYDV病毒；LN-X.遼寧GarVX病毒;YN-L.云南GLV病毒；YN-O.云南OYDV病毒；YN-X.云南GarVX病毒

圖9顯示，XJ、AH、TJ、SD、ZY引種大蒜出現4條明顯條帶，表示以上5種資源同時存在OYDV、GLV、GarVD和GarVX 4種病毒侵染；HN、LN和YN大蒜出現2條明顯條帶，均是GarVX和GarVD病毒；GZ大蒜出現2條明顯條帶，分別是OYDV和GarVD病毒；NMG、CQ、SC大蒜僅出現1條明顯條帶，表示這3種引種大蒜只存在1種病毒侵染，其中NMG資源被OYDV病毒侵染，CQ資源被GarVX病毒侵染，SC資源被GarVD病毒侵染。

對于沒有同時出現4種病毒的7種資源，再針對未出現條帶的病毒進一步做單一RT-PCR檢測。結果表明，除多重PCR結果外，顯示NMG資源也可能存在GarVX病毒；其他資源中，在多重PCR中未檢出的病毒在單一PCR中均未檢測出來(圖10)。對LN和YN 2種資源中是否存在GarVX病毒也進行了驗證，確認這2種資源存在該病毒，證實了多重PCR的有效性和準確性。

3 討 論

以鱗莖作為繁殖體的無性繁殖方式易導致種性退化，且退化問題的產生與病毒的代際傳播密切相關，隨著繁殖代數增加，病毒在鱗莖中不斷累積，進而導致病害蔓延和種性弱化[23]。病毒引發的種性退化問題不僅對大蒜有影響，也對馬鈴薯[24]、百合[25]、山藥[26]、紅薯[27]等地下莖作物有重要影響。加之生產中存在“賣大留小”的不良留種習慣，使得種性好、抗性強的“種子”進入消費流通，而賣相差、病毒多的鱗莖被用于生產種植[28]。因此，大蒜種性退化是無性繁殖方式導致病毒積累和不良留種習慣綜合作用的結果。

病毒對大蒜的危害嚴重，病毒感染可導致大蒜產量損失高達20%，嚴重時超過50%。蔥屬植物受病毒侵染的情況非常普遍，病毒侵染后引起大蒜產量和品質下降的問題是農業生產中的一個重要難題。大蒜為無性繁殖，常常由于鱗莖母體受到病毒感染，并能垂直傳遞到子代，因此一旦大蒜受到病毒感染便難以脫毒，最終導致毀種[29]。大蒜病毒因其多樣性，故在不同地區侵染的程度也是不一致的，大蒜病毒侵染的復雜性及多樣性在不同地區存在差異，侵染的病毒種類隨地區和品種變化也表現出差異性。侵染甘肅大蒜的病毒主要為GLV和OYDV[20]；侵染湖南大蒜的病毒主要為Allexiviruses、OYDV、LYSV、SLV 4種[30]；侵染河南大蒜的病毒主要為LYSV[31]。從種類上看，GLV和OYDV是危害我國大蒜的主要病毒[32-35]，而GarVX和GarVD的出現頻次相對較低。本研究通過對樂都紫皮大蒜全長轉錄組測序中篩選得到的病毒序列進行分析，確認了侵染樂都紫皮大蒜的X病毒和D病毒。這2種病毒通常以復合形式侵染植株，具有較高的相似性和相同的寄主范圍，常規方法難以區分[36-38]，用多重RT-PCR方法有效解決了這一難題。本研究還發現，包括樂都紫皮大蒜在內的共13種大蒜資源中，GarVD侵染的頻率最高，為85%；其次為OYDV和GarVX，頻率為69%；GLV侵染頻率最低，為46%；說明青蔥X病毒屬和OYDV對樂都紫皮大蒜的影響比GLV的侵染性更為廣泛。

馴化栽培過程中，連作所造成的病毒累積影響了大蒜品質和產量，因此大蒜病毒的檢測尤為重要。多重 RT-PCR能夠在同一體系中同時特異性擴增多個片段，但加入體系的多對引物之間也會產生配對、競爭性擴增等問題[39]，因此引物是影響多重RT-PCR檢測體系建立最為重要的因素[40-45]。體系構建時，要充分考慮引物間的不同退火溫度和引物間的作用，防止非特異性擴增和引物二聚體的出現。相較于單一RT-PCR，多重RT-PCR不管是在時間還是在準確性方面，都是最為有效、成本更低的技術選項[46]。目前常見的多重RT-PCR可同時檢測2種或3種病毒[47-51]。本研究采用單一RT-PCR及多重RT-PCR對GLV、GarVX、GarVD和OYDV 4種病毒進行檢測和驗證，可進一步提高檢測效能。

本研究根據樂都紫皮大蒜RNA全長轉錄組測序結果，得到病毒外殼蛋白序列并設計篩選了引物進行多重RT-PCR體系開發，通過靈敏度試驗，確定了每種病毒的檢測限。本試驗建立的4種病毒多重RT-PCR體系，可準確、穩定、有效地進行病毒的單一和復合侵染檢測，為大蒜病原鑒定、發病率統計、脫毒效果驗證和檢測提供技術支持。