高職藥學專業教材中色譜分析的實驗設計研究
——以《板藍根分離及鑒定的薄層色譜》為例

龐 鍵，吳 陵，程 正，鄭如程

（1.銅陵職業技術學院，安徽 銅陵 244000；2.銅陵市食品藥品檢驗中心，安徽 銅陵 244000）

高職院?！斗治龌瘜W》（人民衛生出版社）[1]教材中薄層色譜法的實驗是對磺胺類藥物進行分離及鑒定。 因實驗過程中需使用到三氯甲烷和丙酮等有毒化學品， 具有較高的安全風險， 且實驗步驟較為繁瑣， 導致最終實驗重現效果不理想。 所以自行設計一個便捷高效， 效果明顯的薄層色譜法實驗非常有必要。

板藍根（Radix Isatidis）為臨床上常用的傳統中藥，為十字花科植物菘藍（Isatisindigotica Fort）的干燥根， 具有清熱解毒、 涼血消腫利咽、 抗鉤端螺旋體、抗菌、抗炎和增強免疫力等作用。 板藍根中化學成分主要含有靛玉紅、靛藍、蒽醌類、β-谷甾醇、γ-谷甾醇及多種氨基酸等， 其中靛玉紅、 靛藍為其主要的有效、 有色成分。 靛玉紅為雙吲哚類抗腫瘤藥物，對宮頸癌、肝癌、淋巴瘤、肝門膽管癌及早幼粒白血病均具有顯著的抑制作用[2]。 靛藍具有抗菌抗氧化的作用，主要用于溫病熱盛，斑疹，咯血，咽痛口瘡，小兒驚癇，瘡腫，丹毒，蛇蟲咬傷等。 研究表明，靛藍和靛玉紅是同分異構體， 兩者既是外源性又是內源性的芳烴受體(AHR)配體，AHR 廣泛表達于腸道免疫和非免疫細胞，在炎癥、免疫、組織修復中發揮重要作用[3]。

薄層色譜法是一種將固定相均勻涂鋪在光潔表面的玻璃、金屬板等上面形成薄層，在此薄層上進行色譜分離的平面色譜方法。 其具有設備簡單、 速度快、分離效果好、靈敏度高、直觀、經濟等特點，且可同時分離多個樣品，是一種微量的分離分析方法。薄層色譜鑒別作為中藥尤其是中成藥鑒別的首選方法。 在 2020 年版《中國藥典(一部)》[4]的應用研究較多， 在非法添加化學藥品的篩查方面也有著不可或缺的地位。 近年來，隨著新材料、新技術的應用，薄層色譜技術已由傳統的普通薄層色譜發展到高效薄層色譜（HPTLC）、微乳薄層色譜（METLC）[5-7]、膠束薄層色譜（MTLC），并逐步向聯用檢測方向發展如薄層色譜-質譜聯用等有效的定性分析手段，從而實現優勢互補。隨著新技術的應用，中藥薄層色譜鑒別方法指向的鑒別成分也將更加明確， 質量控制模式更加綠色環保[8]。

本實驗以板藍根為研究對象， 以薄層色譜法對板藍根中的靛藍和靛玉紅進行分離和鑒定。 通過本實驗確定最佳分離條件，使之具有簡便高效、安全低毒等特點， 為高職院校學生實驗教材的編寫提供了參考和實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XSE205 型電子天平 (瑞士梅特勒- 托利多集團，0.1mg/0.01mg)，Linomat5 型半自動點樣儀 (瑞士卡瑪)，Goodlook-2000 薄層成像儀 (上?？普?，H 型薄層層析板 （煙臺德信生物科技有限公司,10*10cm），H 型薄層層析板 （德國默克，10*10cm），KH5200B 型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司），IKA A11 研磨粉碎機。

1.2 試藥

板藍根 (安徽宏坤藥業有限公司， 批號為210201)，靛藍對照品(上海安譜璀世標準技術服務有限公司，批號為 2252186，含量為98.8%)，靛玉紅對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號為110717-202106，含量為99.1%)，其余試劑均為分析純，試驗用水由Milli-Q 系統制備。

2 方法與結果

2.1 實驗流程

溶液配制→點樣→展開顯色→斑點定位→定性鑒別。 《中國藥典(四部)》（2020 年版）[9]中，以比移值Rf作為薄層色譜法系統適用性試驗的考察指標，通過計算比移值Rf(原點到斑點中心的距離與原點到溶劑前沿的距離的比值) 并比較供試品與對照品的Rf值，從而進行定性鑒別。比移值Rf應在0-1 之間，可用范圍是0.2-0.8，最佳范圍是0.3-0.5。

2.2 溶液制備

供試品溶液：稱取板藍根10g，粉碎，加乙酸乙酯40mL，超聲處理(功率 250W，50kHz)30min，靜置，取上清液，水浴蒸干，殘渣加乙酸乙酯1mL，微熱使溶解，放冷。

對照品溶液： 分別稱取靛玉紅對照品和靛藍對照品適量，加乙酸乙酯溶解，稀釋成每1mL 分別含靛玉紅和靛藍各0.2mg 的溶液，即得。

2.3 展開劑條件優化

《中國藥典(四部)》（2020 年版）[9]中明確說明：展開劑的選擇是薄層分離結果優劣的重要條件之一。 展開劑選擇和優化主要考慮溶劑的極性和溶劑的選擇性兩個方面， 以達到比移值Rf在0.2-0.8 范圍內的要求，并達到最佳分離效果。展開劑均需預飽和20min，同時盡可能選擇較小容積的層析缸，缸口需磨砂蓋面密封，置陰涼處，避免產生邊緣效應。 本實驗依據展開劑的極性大小，分別采用石油醚（60-90℃）、乙酸乙酯、丙酮-無水乙醇-鹽酸(10:6:1)、石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(15:6:0.05)為展開劑，在相似的溫度與濕度條件下，分別進行薄層色譜實驗，點樣量均為10μL，點樣順序為供試品溶液、供試品溶液、供試品溶液、靛玉紅對照品溶液和靛藍對照品溶液，結果見圖1-4。

圖1 (展開劑：石油醚（60-90℃）)

圖2 (展開劑：乙酸乙酯)

圖3 (展開劑：丙酮-無水乙醇-鹽酸(10:6:1))

圖4 (展開劑：石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(15:6:0.05))

由色譜圖可知；采用石油醚（60-90℃）為展開劑時，供試品溶液和對照品溶液均無斑點；采用乙酸乙酯為展開劑時， 供試品溶液中靛玉紅和靛藍特征斑點Rf偏高，靛玉紅對照品有拖尾現象；采用丙酮-無水乙醇-鹽酸(10:6:1)為展開劑時，靛藍對照品溶液特征斑點不清晰，且在靛玉紅特征斑點處有干擾，靛玉紅對照品有拖尾現象， 靛玉紅和靛藍特征斑點Rf偏高；采用石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(15:6:0.05)為展開劑時，供試品溶液中靛藍和靛玉紅特征斑點均有拖尾現象， 靛藍對照品溶液的特征斑點較清晰；故在展開劑的選擇上仍需進一步優化。采用石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(20:50:0.2)為展開劑時， 供試品及靛藍對照品溶液中靛藍和靛玉紅特征斑點清晰，靛玉紅對照品拖尾現象不明顯，靛玉紅特征斑點Rf在0.5-0.58 之間， 靛藍特征斑點Rf在0.72-0.75 之間，結果見圖5，故展開劑采用石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(20:50:0.2)時分離效果最佳。

圖5 (展開劑：石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(20:50:0.2))

2.4 點樣量條件優化

點樣是薄層色譜分析的重要環節，尤其是在定性鑒別中，點樣量的大小對檢測結果具有直接影響。點樣量太小，不能檢出清晰的斑點影響判斷；點樣量太多，展開劑不能全部負載，容易產生拖尾現象。 本實驗以石油醚 (60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(25:50:0.2)為展開劑，點樣量分別為 20μL、10μL、5μL，在相似的溫度與濕度條件下，分別進行薄層色譜實驗，考察點樣量對色譜結果的影響， 點樣順序為供試品溶液、供試品溶液、供試品溶液、靛玉紅對照品溶液和靛藍對照品溶液，結果見圖6-8。

圖6 （點樣量 20μL）

圖7 （點樣量 10μL）

圖8 （點樣量 5μL）

由色譜圖可知：點樣量為20μL 時，供試品溶液及靛玉紅對照品溶液特征斑點均出現拖尾現象；點樣量為10μL 時，靛玉紅對照品溶液出現拖尾現象，比移值 Rf值在 0.5-0.7 之間； 點樣量為 5μL 時，特征斑點不夠清晰，且同樣存在拖尾現象。故選擇點樣量為 10μL 較為合理。

2.5 溫濕度條件優化

在薄層色譜鑒定過程中， 溫度和濕度是影響薄層色譜鑒定效果的重要因素。 在其他條件相同的情況下， 實驗環境的相對濕度對薄層板的活性有直接影響，對色譜質量影響明顯。 薄層板常常需在105-110℃活化，使水合硅醇基變為游離硅醇基[10]。 大多數成分對相對濕度有較寬適應性， 但有部分樣品在不同濕度環境中，分離效果有較明顯變化[11]；當溫度較高時，薄層色譜的特征斑點的Rf值較高，檢查準確性降低。因在展開的過程中，較高的溫度也會造成展開劑中的有機溶劑蒸發加速， 導致展開缸中的多元溶劑蒸氣比例發生轉變，造成展開效果出現差異。以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(25:50:0.2)為展開劑，點樣量分別在不同的溫濕度條件下進行薄層色譜實驗，考察溫濕度對色譜結果的影響，點樣順序為供試品溶液、供試品溶液、供試品溶液、靛玉紅對照品溶液和靛藍對照品溶液，結果見圖9-13。

圖9 (溫度 4℃，濕度 40%)

圖10 (溫度 15℃，濕度 60%)

圖11 (溫度 22℃，濕度45%)

圖12 (溫度 20℃，濕度40%)

圖13 (溫度 20℃，濕度45%)

由色譜圖可知： 在溫度4℃， 濕度40%條件下時，各特征斑點Rf值均較好，但靛藍對照品溶液特征斑點不夠明顯， 且存在干擾和拖尾現象； 在溫度15℃，濕度60%條件下時，各特征斑點清晰，靛玉紅特征斑點Rf值小于0.7， 靛藍特征斑點Rf值稍高；溫度22℃，濕度45%時，靛玉紅特征斑點Rf值大于0.65，靛藍特征斑點Rf值大于0.8，溫濕度條件仍需進一步優化。當溫度20℃，濕度40%時，靛玉紅特征斑點Rf值小于 0.6，靛藍特征斑點Rf值小于0.8；當溫度20℃，濕度45%時，靛玉紅特征斑點Rf值小于0.6，靛藍特征斑點Rf值接近0.72。 可見溫度偏高對比移值Rf或有影響， 溫度偏低對分離效果或有影響；而從圖9、圖11、圖12 中的比移值 Rf表征，有效成分對相對濕度有較寬適應性。 故選擇溫度在溫度15-20℃，濕度40%-60%較為合理。

2.6 薄層層析板的選擇

由于不同組分在不同薄層層析板上的吸附和解吸能力不同，因此它們在移動過程中會出現不同程度的分配過程，從而實現分離。 而不同品牌的薄層層析板因所用硅膠的粒度和粘合度不同，薄層色譜行為和分離效果也會存在一定的差異。本實驗分別采用煙臺H 型和德國默克H 型薄層層析板進行實驗， 以石油醚 (60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(25:50:0.2)為展開劑，點樣量為 10μL，溫度 15℃，濕度60%，點樣順序為供試品溶液、供試品溶液、供試品溶液、靛玉紅對照品溶液和靛藍對照品溶液，結果見圖14-15。

圖14 (煙臺H 型薄層板)

圖15 (德國默克H 型薄層板)

由色譜圖可知，采用煙臺H 型薄層板時，靛藍特征斑點較為模糊， 靛玉紅特征斑點Rf值偏高；采用德國默克H 型薄層板時，各特征斑點清晰，靛玉紅特征斑點Rf值小于0.6，靛藍特征斑點Rf值約為0.7。 故以使用德國默克H 型薄層板為宜。

2.7 最終優化色譜條件

綜上所述，當溫度為15-20℃，濕度40-60%時，以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(25:50:0.2)為展開劑，點樣量10μL，采用德國默克H 型薄層板，點樣順序為供試品溶液、供試品溶液、供試品溶液、靛玉紅對照品溶液和靛藍對照品溶液， 進行薄層色譜實驗。 結果見圖16。 供試品溶液與對照品溶液各特征斑點清晰、無拖尾現象，Rf值均在在0.5-0.7 范圍內，具有較好的分析效果。

圖16

2.8 結果

綜上所述，所采用的實驗方法專屬性強、靈敏度高，簡便高效，安全低毒。 板藍根中的靛玉紅和靛藍的薄層色譜具有鑒別特征， 用于板藍根中的靛玉紅和靛藍的定性鑒別是切實可行的。 本項研究也為高職院校學生實驗教材的編寫提供參考數據和扎實可靠的實驗依據。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

待分離鑒定成分在提取溶劑中的溶解度大小會對薄層色譜結果造成一定影響。溶解度過大，點樣時原點會變成空心圓，影響隨后的線性展開；溶解度過小，濃度過低，展開后薄層色譜圖不夠清晰。 所以原則上應選擇對待分離鑒定成分可以溶解但溶解度適中的溶劑。石油醚作為極性較小的有機溶劑，若選擇石油醚(30-60℃)，則易揮發，損失較大；靛玉紅溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、乙醚，不溶于水，微溶于乙醇；靛藍微溶于水、乙醇、甘油、乙酸乙酯和丙二醇，不溶于油脂[4]；少量三乙胺通過實驗表征起著防拖尾的作用。 故在本實驗中對板藍根中的靛玉紅和靛藍進行提取時，選擇石油醚(60-90℃)、乙酸乙酯和三乙胺組合的多元展開劑作為提取溶劑。

3.2 點樣方式與方法的選擇

薄層色譜分析中的點樣方式分為手動點樣和自動點樣。手動點樣主要器具為微量毛細管、微量注射器等，點樣方法為接觸式點樣。自動點樣采用半自動或全自動點樣儀，按預設程序自動點樣，點樣方法以噴霧點樣較為多見。手動點樣靈活方便，常用于各種薄層色譜鑒別中，點樣器具以微量毛細管為主；儀器的自動點樣準確性高， 常用于薄層掃描法的含量測定。 因本實驗是對板藍根中的靛玉紅和靛藍進行定性鑒別， 且考慮到在日常的高校實驗教學中采用全自動或半自動點樣儀會降低實驗效率， 難以對學生的動手能力進行考查等因素， 故本實驗大多采用了接觸式的手動點樣方法， 同時考慮到提取溶劑的揮發性，一般采用洗耳球輕吹，反復手動點樣。

3.3 薄層板的選擇

本實驗中分別采用了煙臺H 型薄層板和德國默克H 型薄層板對靛玉紅和靛藍進行分離鑒定。 實際完成的薄層色譜圖中，煙臺H 型薄層板上靛藍特征斑點Rf較大， 且靛玉紅特征斑點存在一定的拖尾， 但靛藍與靛玉紅已實現完全分離。 考慮到德國默克H 型薄層板成本較高，故在日常的高校實驗教學中也可使用煙臺H 型薄層板。

3.4 與磺胺類藥物的薄層色譜分離及鑒定實驗的比較

在高職院?！斗治龌瘜W》（人民衛生出版社）教材《磺胺類藥物的薄層色譜分離及鑒定》 的實驗中，使用了丙酮作為磺胺類特征成分的提取溶劑， 在展開劑中使用了三氯甲烷作為展開溶劑。 根據 《危險化學品安全管理條例》 和 《易制毒化學品管理條例》，丙酮和三氯甲烷分別屬于易制毒第三類和第二類化學品，受公安部門管制，且三氯甲烷已被世界衛生組織國際癌癥研究機構列入2B 類致癌物清單[12]。 兩者的存放場所必須安全可靠， 且有專人保管。 故在日常的實驗教學中， 實驗過程中嚴格按照操作程序和要求進行操作， 對實驗試劑的使用保管以及學生的管理提出較高的要求。 本實驗過程中使用的溶劑為石油醚(60-90℃)、乙酸乙酯和三乙胺，均不屬于易制毒化學品，且毒性較低，整個實驗過程更加安全環保。