葛花解酲方作用于CCL2、BIRC5調控自噬治療肝細胞癌的研究

王 羿，張學武，林登梅，安明宇，李 軍*

(1.貴州中醫藥大學 基礎醫學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學 藥學院，貴州 貴陽 550025)

0 引言

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的惡性腫瘤，占所有肝癌患者的85%，其發病率和死亡率分別在全球排第六和第三位，其中，2020年約有新發病例90.6萬、死亡病例83萬[1]。據臨床報道，HCC的危險因素有乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、吸煙、飲酒、肥胖、黃曲霉素和代謝異常等[2]。目前，HCC治療手段主要有肝移植或切除、經導管動脈化療栓塞(TACE)、射頻消融(RFA)、免疫治療、抗血管靶向治療等[3-7]。 雖然手術治療被認為是最有效的手段，但因該病發病隱匿、潛伏期長、進展迅速、惡性程度高等原因，確診時已屬中晚期，不但死亡率較高，術后5年的復發率高達60%以上[8-9]。

自噬是一種在自噬相關基因的調控下引發細胞程序性死亡的一種方式，細胞將其受損的細胞器和大分子物質運送到溶酶體進行消除和降解[10]。這一過程最終抑制癌細胞凋亡或誘發癌細胞死亡，自噬和誘導的程度(又稱自噬通量)與腫瘤進展所處的階段有關[11]。在一些研究中，自噬可以在腫瘤形成的早期階段通過消除基因組不穩定性、受損細胞器和突變細胞來抑制腫瘤的發生[11-12]。

GHJCF是傳統的經典藥方，出自李東垣的《脾胃論》，是治療“飲酒過傷”之劑。該方由葛花、人參、茯苓、木香、白術、干姜、豆蔻等藥物組成，全方具有分消酒濕、溫中健脾、消補兼施之效。課題組前期研究發現，GHJCF對HCC有一定的抑制作用[13-14]，但其發揮抗腫瘤作用的活性成分以及作用機制尚未闡明。研究運用網絡藥理學結合生物信息學知識，探究GHJCF通過介導自噬進而干預肝細胞癌進展的潛在機制，以期為GHJCF的藥物開發以及臨床應用提供理論證據。

1 材料與方法

1.1 GHJCF活性成分及靶標的獲取

檢索TCMSP[15](http://tcmspw.com/tcmsp.php)數據庫，收集GHJCF中葛花、人參、茯苓、木香、白術、干姜、豆蔻的活性成分的相關信息，并提取相關活性成分作用的蛋白靶點。接著在Uniprot[16](https：//www.uniprot.org)蛋白數據庫將化合物作用的靶點蛋白轉化為靶點基因名。

1.2 HCC疾病和潛在自噬基因獲取

從GEO[17](https://www.ncbi.nlm. nih.gov/geo)數據庫獲取HCC數據集GSE87630和GSE45267。GSE87630分別包含HCC患者組織樣本64例，癌旁組織樣本30例，GSE45267數據集包含HCC患者樣本41例和健康對照(HCC)樣本46例。GSE87630與GSE45267芯片研究類型為 expression profiling by array, 種屬為 homo sapiens，平臺分別為GPL6947、GPL570。通過GEO2R在線分析工具分析芯片數據，設置P<0.05，|logFC|>1 為篩選條件，獲得肝癌差異表達基因。人類自噬數據庫(Human autophagy database, HADb)收錄了222個與人類自噬密切相關的基因/蛋白信息。此外，基因的信息包括DNA序列、mRNA序列和已知的各種轉錄本等等。

1.3 構建“藥物-成分-靶點-HCC-自噬”網絡

將獲取到的GHJCF活性成分對應的靶點與HCC差異基因以及自噬相關基因，導入到Venny2.1.0[18](https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線工具取交集以獲取交集基因。再將交集靶點與藥物、成分、疾病一一對應后導入Cytoscape 3.9.0軟件構建“藥物-成分-靶點-HCC-自噬”網絡圖。

1.4 蛋白與蛋白相互作用網絡構建

將交集靶點導入該STRING[19](https://string-db.org)數據庫，構建交集靶點蛋白的相互作用網絡圖。

1.5 基因差異表達分析

使用R 3.6.3語言進行統計分析，其中ggplot2包用于可視化。涉及的統計方法有Mann-Whitney U檢驗(Wilcoxon rank sum test)。 Mann-Whitney U檢驗是一個非參數的假設檢驗方法，一般用于2組不滿足正態性的情況。疾病為肝細胞肝癌，數據來源于TCGA[20](https://portal.gdc.cancer.gov/ ) LIHC(肝細胞肝癌)項目中 level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq數據。

1.6 免疫組化學分析

利用基于人蛋白質圖譜[21](THPA) (www.proteinatlas.org)的免疫組織化學來驗證關鍵基因及其診斷價值。THPA 提供對 32 種人體組織及其蛋白質表達譜的訪問，并使用抗體譜來準確評估蛋白質定位。此外，THPA 還提供 RNA 水平的測量。

1.7 臨床相關性分析

使用R 3.6.3語言的ggplot2對關鍵基因的臨床相關信息進行可視化處理。涉及的統計方法有Kruskal-Wallis test。Kruskal-Wallis test是利用多個樣本的秩和來推斷各樣本分別代表的總體的位置有無差別。 一般用于多組樣本不滿足正態性的情況。

1.8 生存預后分析

進行K-M生存分析[22](http://kmplot.com/analysis/)分析關鍵基因表達與HCC患者生存天數之間的關系。將關鍵基因輸入該數據庫以獲得K-M生存曲線圖。計算對數秩P值和風險比。P值<0.05 被認為具有統計學意義。

1.9 分子對接

從PDB[23](https://www.pdbus.org/)數據庫中獲取上述分析后關鍵基因的人源蛋白，然后通過TCMSP[15](https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數據庫獲取GHJCF中關鍵基因對應化合物的3D結構，將蛋白及化合物的3D結構導入Discovery Studio 2016 Client軟件進行分子對接檢驗其蛋白與活性成分的親和性。

2 結果

2.1 差異基因篩選結果

R語言軟件對GSE45267和GSE87630基因表達數據進行標準化處理的結果見圖1(A)和圖1(B)。GSE45267數據集有1 305個差異基因，其中上調基因486個，下調基因819個。GSE87630數據集有1 250個差異基因，其中上調基因359個，下調基因891個。2組數據集差異基因的可視化結果見圖 1(C)和圖1(D)。

圖1 A:GSE45267數據集的標準化處理結果;B:GSE87630數據集的標準化處理結果; C:GSE45267差異基因火山圖;D:GSE87630差異基因火山圖Fig.1 A:Normalization results of GSE45267 dataset;B:Normalization results of GSE87630 dataset;C:GSE45267 differential gene volcano map;D:GSE87630 differential gene volcano map

2.2 靶點基因篩選結果及蛋白交互PPI網絡的構建

在HADb數據庫中篩選出222個基因組與自噬相關。用韋恩圖可視化其與GHJCF的靶點及HCC數據集的差異基因的交集，篩選得到3組數據的共同差異基因5個，見圖2(A)。將差異基因導入至STRING數據庫得到一個含6條邊和5個節點的PPI網絡圖，用Cytoscape3.9.0軟件構建蛋白交互網絡圖(PPI)。根據每個靶點degree值大小確定每個靶點大小，見圖2(B)。

圖2 A:GHJCF-自噬-HCC交集基因的韋恩圖;B:PPI網絡圖Fig.2 A: Venn diagram of GHJCF-autophagy-HCC intersection genes; B: PPI network diagram

2.3 “藥物-活性成分-靶點-HCC-自噬”網絡構建

將7味中藥、74個成分、13個靶點在Cytoscape中進行分析、作圖(圖3)。

圖3 藥物-成分-靶點-疾病-自噬作用網絡圖Fig.3 Drug-component-target-disease-autophagy action network diagram注：GH,葛花；RS,人參；FL,茯苓；MX，木香；BZ，白術；GJ，干姜；DK，豆蔻。

2.4 關鍵基因的表達差異分析

結果顯示，與癌旁正常組織相比，腫瘤患者CCL2基因的mRNA表達顯著下調，而NFE2L2、FAS和BIRC5基因的mRNA表達顯著上調(圖4)。

圖4 4個顯著差異關鍵基因在正常組織和腫瘤組織表達情況Fig.4 Expression of 4 significantly different key genes in normal and tumor tissues注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.5 人類蛋白質圖譜分析

使用人類蛋白質圖譜(THPA)網站分析了HCC樣品中NFE2L2、FAS、CCL2和BIRC5表達的免疫組織化數據，免疫組織化數據顯示肝癌樣品中的NFE2L2、CCL2和BIRC5高表達；FAS中表達(圖5)。

圖5 4個關鍵基因在肝癌組織中的免疫組織化圖Fig.5 Immunohistochemical map of 4 key genes in liver cancer tissue

2.6 臨床因素相關性分析

分析了CCL2和BIRC5在具有不同臨床特征的HCC中的表達水平。結果如圖6所示，發現CCL2在患者性別、不同癌癥分期和淋巴結轉移狀態的正常組表達水平顯著高于腫瘤組。而BIRC5在患者性別、不同癌癥分期和淋巴結轉移狀態的正常組表達水平顯著低于腫瘤組。

圖6 根據患者性別A、個體癌癥分期B和淋巴結轉移狀態C 3個關鍵基因在HCC中的表達情況Fig.6 Expression of 3 key genes in HCC according to patients' gender A, individual cancer stage B and lymph node metastasis status C注：P≥0.05，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.7 生存預后分析

通過Kaplan-Meier繪圖儀數據庫分析了CCL2和BIRC5在HCC中的預后價值，見圖7。發現CCL2的過表達與HCC患者較差的總生存(OS)和無進展生存期(PFS)有關。而BIRC5的低表達與HCC患者較差的總生存(OS)和無進展生存期(PFS)有關。

圖7 2個顯著差異關鍵基因高、低表達與總生存率的曲線(A1、B1), 2個顯著差異關鍵基因高、低表達與無進展生存期的曲線(A2、B2)Fig.7 Curves of 2 significantly different key genes with high and low expression versus overall survival (A1、B1), and 2 significantly different key genes with high and low expression versus progression-free survival (A2、B2)

2.8 分子對接

分子對接的結果如表1所示，LibDock 評分越高，親和力越高。結果表明，相應的化合物可以與CCL2和BIRC5相互結合，并且最高的6個LibDock 評分對接模型顯示在圖8。

表1 分子對接LibDock評分Tab.1 Molecular docking LibDock scores

圖8 活性化合物與核心靶點的分子對接示意圖Fig.8 Molecular docking of active compounds with core targets注：A:葛根素與BIRC5的分子對接；B:[6]-姜酚與BIRC5的分子對接；C:木犀草素與BIRC5的分子對接；D:槲皮素與BIRC5的分子對接；E:染料木素與BIRC5的分子對接；F:槲皮素與CCL2的分子對接。

3 討論與結論

HCC是原發性肝癌的常見組織學類型之一，在發展過程中，一系列漸進的事件與多種蛋白質或途徑有關，其特點是死亡率高[24-25]。與西藥“一藥一靶”不同，由于中藥成分的復雜性，多種成分和靶點之間具有協同作用，故在治療 HCC 方面顯示出一定優勢[26]。隨著生物信息學的快速發展，基于大型數據庫的新興網絡藥理學已成為從分子水平到路徑水平詳細描述復雜藥物系統作用機制的常用工具，是研究中醫藥作用機制和開發新藥前期高效的一種預測方法[27]。研究基于網絡藥理學和生物信息學，初步確定了GHJCF通過調節自噬干預肝細胞癌的作用機制。

通過GSE87630、GSE45267數據集分別獲得1 250、1 305個差異表達基因，收集GHJCF 治療HCC的活性成分27個，靶點452個，以及自噬相關基因222個，最后獲得藥物、疾病、鐵死亡的共同靶點5個。通過生物信息學分析，我們確定了4個靶點作為GHJCF干預HCC機制的潛在靶標，差異表達分析結果顯示，CCL2的表達水平顯著低于正常組，而NFE2L2、FAS和BIRC5表達水平顯著高于正常組。THPA驗證NFE2L2、CCL2和BIRC5蛋白在癌癥組織中的表達水平高，FAS在癌癥組織中的表達水平中等。臨床相關性研究表明，CCL2和BIRC5都與性別、個體癌癥分期、淋巴結轉移狀況等臨床指標相關。生存分析表明，CCL2的低表達與HCC患者的不良預后有關，BIRC5的高表達與HCC患者的不良預后有關。

此外，利用分子對接將CCL2和BIRC5與GHJCF有效成分進行分子對接。結果顯示，BIRC5蛋白與GHJCF中的染料木素、槲皮素、葛根素和木犀草素成分結合分數較高，CCL2與槲皮素成分結合分數較高。研究表明，染料木素可有效降低患者的HCC風險，通過觸發細胞凋亡來抑制胃癌和肝癌細胞的生長、通過調控AMPK防止HCC的發生并抑制其發展等作用[28-30]。槲皮素通過細胞自噬或凋亡誘導抑制肝細胞癌的生長[31]。葛根素可通過干預MAPK途徑促進HCC的凋亡發生[32]。木犀草素可通過調控TGF-β1通路、p53通路、Fas/Fas-配體通路、內質網應激和AKT/OPN通路的多種信號通路抑制HCC細胞的生長[33-35]。通過綜合分析，最終我們確定CCL2和BIRC5是GHJCF調控自噬干預HCC的最佳靶點。

研究表明，CCL2與腫瘤的發生密切相關，并與HCC的不良預后有關[36]。據報道，BIRC5在HCC中的表達增加會抑制細胞凋亡，促進腫瘤細胞增殖，并增加HCC細胞對放療的抵抗力[37]。

綜上，通過以上生物信息學分析，結合臨床數據相關性，GHJCF可能通過染料木素、槲皮素、葛根素和木犀草素作用于BIRC5、CCL2，調節HCC的自噬，進而對HCC有抑制作用。