mRNA 疫苗技術和產業發展概況

劉財旺

玉溪沃森生物技術有限公司

龍新華

玉溪沃森生物技術有限公司

包嫄

云南沃森生物技術股份有限公司

李薇*

云南沃森生物技術股份有限公司

1989年，有研究者發現在脂質包裹下mRNA 可以在真核細胞內轉染和表達，mRNA 作為藥物的概念被提出[1]。1990年，研究者成功完成了體外轉錄mRNA 在小鼠體內的表達，證明了mRNA作為藥物的可行性[2]。1995年，又有研究者用小鼠模型開發了第一種編碼癌胚抗原（CEA）的mRNA 腫瘤疫苗，證明mRNA疫苗在腫瘤治療領域具有較好前景[3]。然而，由于mRNA 穩定性差、先天免疫原性高、體內遞送效率低下，mRNA 藥物開發在很長一段時間內受到限制[4]。近年來，mRNA 修飾技術和遞送技術不斷進步。2005年有研究者發現使用修飾尿苷合成的mRNA可以避免被免疫系統識別和降解，有效解決了mRNA 在體內的不穩定性和高免疫原性問題；非翻譯區的優化和poly（A）尾優化技術提高了mRNA 的穩定性和翻譯效率；純化方法的改進有效去除了雙鏈RNA 雜質，從而減少先天免疫的非特異性激活；通過將mRNA 配制成納米顆粒，如脂質納米顆粒（LNP）、聚合物納米顆粒和脂質-聚合物雜化納米顆粒，mRNA 技術逐漸成為傳染病和腫瘤防治領域的焦點[4-17]。2023年諾貝爾生理學或醫學獎授予了科學家Katalin Karikó 和Drew Weissman，以表彰他們在核苷堿基修飾方面的發現，推動了mRNA 疫苗在抗擊COVID-19大流行過程中發揮巨大作用；同時，mRNA 疫苗也在此期間取得了快速發展[12,18-21]。mRNA 藥物技術開發過程中的部分關鍵節點見圖1[22]。

圖1 mRNA 藥物技術開發過程部分關鍵節點[22]

1 mRNA 疫苗簡介

1.1 mRNA疫苗的作用機制

如圖2 所示，接種mRNA疫苗后，體外轉錄（IVT）mRNA 通過遞送載體進入靶細胞的細胞質中，通過靶細胞的表達系統合成具有特定藥理活性的抗原蛋白，翻譯的抗原蛋白被蛋白酶降解為抗原肽，然后被轉運到內質網中，并通過主要組織相容性復合體（MHC）Ⅰ途徑呈遞給CD8+T 細胞，以誘導細胞介導的免疫反應。部分抗原蛋白由宿主細胞分泌并被附近的抗原呈遞細胞（APC）吸收，通過MHC Ⅱ途徑呈遞給抗原特異性CD4+T細胞，分泌細胞因子引發細胞免疫反應，并激活B 細胞產生抗體?？乖鞍滓部梢酝ㄟ^一種交叉呈遞的機制被處理，并通過MHCⅠ途徑激活抗原特異性CD8+T細胞，從而殺死腫瘤細胞或病毒感染的細胞，以達到預防和治療疾病的目的[16,23-27]。

圖2 mRNA 疫苗作用機制示意圖[28]

1.2 mRNA 疫苗的結構

目前用于疫苗研究的mRNA主要有3 種類型：非復制mRNA、自擴增RNA（saRNA）和環狀RNA（circRNA）。其中，非復制mRNA 最為常用。環狀mRNA 模仿了病毒感染過程，其復制機制可以大幅降低疫苗劑量；環狀mRNA 的閉環結構保護其免受核酸外切酶降解，穩定性更好。mRNA 含有幾個必要的結構，包括帽子結構（Cap）、5'非翻譯區（5'UTR）、編碼抗原蛋白的開放閱讀框（ORF）、3'非翻譯區（3'UTR）和poly（A）尾結構。自擴增mRNA 疫苗的開放閱讀框還包括編碼細胞內RNA 擴增所需的非結構蛋白，環狀mRNA 則是一個沒有5'UTR 和3'UTR 的閉環結構[29]。不同類型mRNA的結構和翻譯過程見圖3。

圖3 不同類型mRNA 的結構和翻譯過程[29]

如前文所述，mRNA 疫苗必須被輸送到人體的靶細胞才能引發免疫反應，但是mRNA 進入人體后很容易被核酸酶降解，且難以透過細胞膜屏障到達細胞質，因此mRNA 疫苗還需要合適的遞送載體。另外，mRNA 疫苗通常需要冷凍儲存，需要冷凍保護劑保護遞送系統不被破壞。因此，mRNA 疫苗的主要組成部分包括編碼抗原蛋白的mRNA，用于包埋、遞送mRNA 的脂質載體（最常用的是LNP），緩沖溶液（如PBS buffer 或Tris buffer），冷凍保護劑（如蔗糖）。以新冠mRNA 疫苗為例，輝瑞（Pfizer）與BioNTech 公司合作開發的BNT162b2 以及莫德納公司開發的mRNA-1273 這兩款疫苗的結構組成見圖4。

圖4 新冠mRNA 疫苗BNT162b2 和mRNA-1273 的結構組成[30]

其中，mRNA 制劑依靠陽離子脂質在低pH 環境下有效地復合帶負電荷的mRNA，形成LNP 的核心[31-33]。磷脂在LNP中發揮結構作用，有助于脂質雙分子層的形成和破壞，以促進內體逃逸[34-35]。膽固醇在LNP 中起穩定作用，在細胞轉染中至關重要[36-37]。聚乙二醇（PEG）脂質在LNP 表面充當屏障，在空間上穩定LNP 并減少與蛋白的非特異性結合[38]。

1.3 mRNA疫苗生產方式

基于目的mRNA 的特性及臨床應用，其合成方式主要有化學合成、重組生產、酶法合成等，其中體外轉錄（酶法）被認為是大規模生產mRNA 金標準[39]。mRNA 疫苗制備流程如圖5 所示，在上游，疫苗靶序列被導入質粒中，DNA 模板被生成、擴增、純化和線性化；在中游，使用T7 RNA 聚合酶在體外轉錄反應后合成RNA，并使用5'帽類似物共轉錄（或轉錄后加帽）實現RNA的5'加帽，再通過純化得到高純度的mRNA；在下游，將獲得的高純度mRNA 配制在LNP 中，并裝入小瓶或容器中，用于大規模接種或使用[5,40-41]。

圖5 mRNA 疫苗制備流程[42]

上述方法幾乎適用于生產任何mRNA 序列，批次間變異性低，與其他平臺相比，有助于節省時間并降低經濟成本。對mRNA原料藥和制劑藥物產品進行測試和過程分析，以評估鑒別、外觀、含量、純度、RNA 完整性、殘留DNA、包封率、粒徑、生物活性內毒素污染和無菌性[5,43]。對于特定的mRNA，制備mRNA 藥物的程序可能會稍作調整，包括修飾核苷，以及采用加帽策略或純化策略等。

生產mRNA 所需的所有設備均符合良好生產規范（GMP）級別，在有限的工業規模的生產設施內，每年可生產數千萬劑基于RNA 的產品[5]。

1.4 mRNA 疫苗優勢

首先，mRNA 疫苗是一種無感染、安全的平臺，沒有感染或插入基因組突變的潛在風險性[11,44]。其次，mRNA 體內半衰期可以通過使用mRNA 修飾和遞送方法來調節[45]。再次，mRNA 疫苗允許同時遞送多種抗原，特別是對于腫瘤疫苗，可以覆蓋各種腫瘤相關抗原（TAA）、腫瘤特異性抗原（TSA）或細胞因子，以引發體液和細胞介導的免疫反應，從而增強抗腫瘤功效[46]。最后，如前文所述，mRNA 疫苗具有可擴展性，可以通過無細胞的體外轉錄（IVT）獲得高產量的mRNA，且一旦建立了成熟的mRNA 疫苗平臺，就可以通過該平臺快速開發不同的mRNA 疫苗。

2 mRNA 疫苗產業發展狀況

2.1 mRNA疫苗研發進展

目前，大量mRNA 疫苗正在研制中，部分已應用于臨床治療各種疾病，包括新冠mRNA 疫苗、其他傳染病mRNA 疫苗和腫瘤mRNA 疫苗。此外，mRNA 疫苗也會與其他療法（如化學療法和免疫療法）聯合使用。

2.1.1 新冠mRNA 疫苗

新冠病毒（SARS-CoV-2）感染引起的COVID-19 大流行仍在持續，對人類健康和全球經濟造成巨大影響，疫苗是抗擊COVID-19 大流行的主要途徑。2023年1月24日世界衛生組織發布的數據顯示，全球有300 多種新冠候選疫苗，其中176 種已進入臨床試驗階段?；趍RNA疫苗在預防傳染病方面的優勢，新冠mRNA 疫苗在COVID-19大流行期間得以快速開發及迭代，并為抗擊COVID-19 作出了重要貢獻。輝瑞/BioNTech 公司聯合開發的BNT162b2（Comirnaty）于2020年12月在美國獲得緊急使用授權（EUA），其生物制品許可證申請（BLA）亦于2021年8月在美國獲批，是全球第一個上市的mRNA 疫苗；莫德納（Moderna）公司的mRNA-1273（Spikevax）于2020年12月在美國獲得EUA，BLA 于2022年2月1日在美國獲批，是全球第二個上市的mRNA 疫苗；我國軍事醫學科學院、蘇州艾博生物和云南沃森生物共同研發 的AWcorna 于2022年9月在印度尼西亞獲得EUA，這也是我國在海外獲得的第一個EUA；石藥集團的SYS6006 于2023年3月在我國獲得EUA，為國內首款[47]。部分針對COVID-19的代表性mRNA 疫苗見表1。

莫德納公司的mRNA-1273 和輝瑞/BioNTech 公司的BNT162b2 均于2020年1月開始研發，并在12 個月內獲得EUA，目前仍在全球范圍內使用，證明了mRNA 疫苗預防病毒感染的有效性。臨床結果表明，BNT162b2 和mRNA-1273 都可以誘導產生高水平的中和抗體，并引發強大的T 輔助因子1 細胞反應，因此在預防野生型病毒感染方面具有較好的效果（～95% ）[30]。

COVID-19 暴發以來，參考SARS-CoV-2序列（hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019）觀察到超過12 000 個突變，大約每11 天發生一次核苷酸替換[48-49]。SARS-CoV-2 的特定突變引發不同的表型改變，其中一些由于可能導致病毒的傳播性或毒力增強，通過自然感染或疫苗接種獲得的中和抗體減少，使治療或疫苗接種的有效性降低，被歸為關注變體（VOC）[50-51]。截至目前，已經確定了5 種VOC，包括 Alpha、Beta、Gamma、Delta 和Omicron 變體[51]。莫德納公司的mRNA-1273 和輝瑞/BioNTech 公司的BNT162b2對于上述5 種VOC 的保護效果均出現了不同程度的下降，尤其是對于突變位點達30 多個的Omicron 變體的保護效果下降更為顯著[52]。目前，已有多種針對SARS-CoV-2 VOC，尤其是Omicron 變體的mRNA 疫苗正在開發中，包括云南沃森生物與上海藍鵲生物合作開發的RQ3013、RQ3033 疫苗，并有數種已被授權使用[51-53]。

2.1.2 其他傳染病mRNA疫苗

基于mRNA 疫苗在傳染病預防方面的優勢以及在COVID-19預防中取得的效果，近年來，預防其他傳染病病毒[如流感病毒、寨卡病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、帶狀皰疹病毒]的mRNA 疫苗也成為研發熱點，且部分已進入臨床試驗階段（表2）。其中，莫德納公司研發的針對巨細胞病毒（CMV）的mRNA-1647、針 對RSV 的mRNA-1345 以及針對流感病毒的mRNA-1010 進度較快[29]。

表2 部分臨床試驗階段的傳染病預防mRNA 疫苗[29]

2.1.3 腫瘤mRNA 疫苗

基于可編碼多種腫瘤抗原、安全給藥和誘導強大T 細胞反應的高免疫原性等優點，mRNA疫苗已成為一種越來越受歡迎的腫瘤治療方法。腫瘤疫苗的開發主要針對TAA 和TSA。其中，TAA 是由正?；蚍g而來的蛋白質，在腫瘤細胞表面異?；蜻^度表達，但同時也存在于正常組織中，特異性較低。TSA 在正常組織中不存在，但在個體腫瘤細胞中表達，具有高度特異性，因此被認為是理想的腫瘤疫苗抗原。目前，腫瘤mRNA 疫苗大多仍處于Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗階段（表3）[29,54-55]。

表3 部分臨床試驗階段的腫瘤mRNA 疫苗[29]

2.2 mRNA 疫苗的GMP生產

2.2.1 國內外對于mRNA疫苗GMP 生產的要求及差異

我國對疫苗生產實施嚴格的準入制度，疫苗上市許可持有人自身應當具備疫苗生產能力，一般情況下不允許委托生產。因此，在我國預防用mRNA 疫苗上市許可持有人必須自建GMP 生產線，具備生產和檢驗放行的能力；但若不是預防用mRNA 疫苗，則不受此限制，可以委托生產。國外藥品監管機構對于自建生產線無具體限制要求。因此，我國mRNA 疫苗企業普遍選擇自建生產線；而國外相關企業更多的是基于企業自身發展戰略選擇自建生產線、與其他企業合作或委托生產。

預防傳染病用mRNA 疫苗的質粒DNA（pDNA）是否能委托生產，也是一個值得關注的問題。歐盟相關指南（Questions and Answers on the Principles of GMP for the Manufacturing of Starting Materials of Biologicalorigin Used to Transfer Genetic Material for the Manufacturing of ATMPs）把pDNA 作為起始物料進行監管，允許企業委托醫藥合同生產組織（contract manufacture organization，CMO）生產pDNA。在我國，根據《疫苗管理法》《新型冠狀病毒預防用疫苗研發技術指導原則（試行）》等相關規定，pDNA 模板定義為原液的生產工藝，企業應當自主生產pDNA[47]。

2.2.2 國內外mRNA 疫苗GMP 生產基地概況

疫苗生產必須通過GMP 符合性檢查，每個工廠都必須具備符合資質要求的人員和基礎設施，因此大規模集中生產是mRNA 疫苗生產現狀?；趪鴥韧庖呙绫O管要求的差異，國外mRNA 疫苗企業主要通過與有生產能力的企業合作或委托生產，以快速擴大產能，同時啟動新建生產基地，可能用于生產質粒、mRNA 原液、LNP（DP ）或者進行灌裝和分發；而我國的大部分mRNA 疫苗企業在項目早期就啟動建設GMP 生產基地，大多涵蓋從質粒生產到最終灌裝和分發的功能。

莫德納公司和輝瑞/BioNTech 公司的新冠mRNA疫苗生產工廠幾乎都分布在歐美地區。為了更好地實現疫苗的全球供應，莫德納公司、輝瑞/BioNTech 公司與包括我國、澳大利亞、加拿大、新加坡、南非和韓國在內的幾個國家或地區的企業建立了合作關系，并在部分國家和地區布局了生產基地建設計劃。

mRNA 疫苗企業三巨頭之一CureVac，在德國總部擁有自己的GMP 級別臨床樣品生產車間和產業化工廠，其產業化工廠面積達8800m2，設計年產能為3000 萬劑。此外，CureVac 還與諾華（Novartis）公司合作，計劃在位于奧地利的工廠生產mRNA 原液和制劑，年產能可達2 億劑[53]。

云南沃森生物是國內最早布局mRNA 疫苗產業化的企業，早在2021年9月就在云南省玉溪市高新區疫苗產業園建成mRNA疫苗模塊化工廠，原液年產能可達10 億劑，制劑產能可達2.4 億劑。石藥集團的SYS6006 由其子公司巨石生物負責生產，巨石生物的mRNA 生產廠房產能可達15 億劑，其中新冠mRNA 疫苗10 億劑。此外，國藥中生復諾健位于上海嘉定的GMP 生產基地，設計最高年產能為20 億劑；云頂新耀位于浙江嘉善的GMP 生產車間年產能預計可達7 億劑次；啟辰生生物在珠海金灣國際健康港的GMP 生產車間，建筑面積超1300m2，能實現全鏈條生產；還有成都威斯津位于成都天府國際生物城的在建生產基地，規劃年產能1 億劑；藍鵲生物在上海寶山規劃了10 000m2GMP 生產基地；康希諾在上海臨港規劃了約17 000m2生產廠房[53]。

現階段，由于新冠疫苗的需求大幅下降，mRNA 生產基地的發展目標由快速擴大產能轉變為與mRNA 疫苗企業自身戰略相適應?；趍RNA 疫苗高度平臺化的特點，這些生產基地可以迅速用于其他mRNA 疫苗的開發。

3 mRNA 疫苗供應鏈概況

3.1 國內外mRNA 疫苗供應鏈概況

隨著新冠mRNA 疫苗的發展，基于傳統生物藥物的供應鏈，mRNA 疫苗供應鏈也愈發成熟。mRNA 疫苗供應鏈主要包括主要設備、原材料及關鍵耗材，其中比較關鍵的是酶、核苷酸底物、帽子結構類似物、脂質輔料、分離純化設備與耗材、LNP 包封設備與質控設備等。

已上市的新冠mRNA 疫苗中，莫德納公司的mRNA-1273 和輝瑞/BioNTech 公司的BNT162b2 的原材料成本占比分別為55.9% 和 41.7%（表4），可見原材料在mRNA 疫苗生產中的重要性。其中，帽子結構類似物（46%）、酶類（約30%）占據了大部分原材料成本（表5）[47]。

表4 新冠mRNA 疫苗mRNA-1273（莫德納公司）和BNT162b2（輝瑞/BioNTech 公司）的生產成本分布情況[47]

表5 新冠mRNA 疫苗mRNA-1273（莫德納公司）和BNT162b2（輝瑞/BioNTech 公司）的原材料成本分布情況[47]

mRNA 疫苗生產各關鍵鏈點的主要供應商詳見表6。從表中可以看出，mRNA 疫苗生產所需原材料和設備等已基本實現國產替代，進步巨大。部分原輔料和耗材由于生產工藝和質量的局限性和穩定性，目前仍難以實現國產替代。尤其是mRNA 合成純化及后續制劑工藝中的關鍵耗材，由于色譜填料和中空纖維柱等生產用高值耗材研發周期較長，且涉及材料學、流體動力學、工程力學及精細化工等多學科交叉，尚存在國產化水平較低、產品質量有待提高等情況；基于對檢測儀器的高精度要求，大部分檢驗儀器仍依賴進口。另外，遞送系統、核苷酸修飾、帽子結構類似物、LNP 制備設備還存在一些專利問題。因此，為了實現國產mRNA疫苗的國際化，開發具有自主知識產權的國產物料將成為未來我國mRNA 疫苗產業化的重點之一。

表6 mRNA 疫苗生產各關鍵鏈點的主要供應商[47]

許多國內mRNA 疫苗研發企業出于降低供應鏈風險的考慮，正積極開展關鍵原材料的國產化替代研究工作，如對限制性內切酶（Bsa Ⅰ）、DNA 核酸酶（DNase Ⅰ）開展了全面的質量標準和工藝對比研究。結果表明，國產物料質量標準在一定程度上比進口物料的質量標準更加完善；對于同一物料，國產供應商和進口供應商來源對產品質量的影響無明顯差異。

目前，從mRNA 疫苗物料供應商調研和審計情況來看，大部分原輔料均可實現國產替代。極少部分原輔料的純度對于LNP結構穩定非常重要，國產物料純度尚不能滿足產品工藝質量需求，仍然采用進口物料。

4 總結與展望

mRNA 疫苗因具有靈活、安全、可調控以及快速開發等特點，成為生物制藥領域的一顆冉冉升起的新星。其不僅在抗擊COVID-19 大流行中發揮了巨大作用，也將在腫瘤免疫和傳染病領域成為應用熱點。相關研產管線及供應鏈也將更加成熟，同時已建成或在建的平臺化mRNA 疫苗研產管線將推動mRNA 疫苗產業高速發展。此外，個體化醫療也有望成為mRNA 疫苗研產管線布局的重要方向之一。但需要關注的是，目前mRNA 疫苗生產成本尤其是原材料成本仍較高，降低原材料成本可大大提高疫苗的產品可及性。開發自擴增RNA（saRNA）疫苗以降低mRNA疫苗的劑量要求可能是前景較好的方法之一，另外也有報道采用類似重組蛋白的方式基于細菌/細胞系統生產mRNA，從而在保證mRNA 疫苗質量的同時有效降低生產成本。目前，mRNA 疫苗的專利壁壘仍較多，為了實現國產mRNA 疫苗的國際化，具有自主知識產權的國產物料的開發力度需要進一步加強。