碎片印跡聚合物的制備及其對薯蕷皂苷的分子識別

肖真儀,鄧 文,楊城城,劉美君,周小輝,彭雨婷,簡宇軒,李 輝

(吉首大學化學化工學院,中國 吉首 416000)

由于環境及生物樣品的復雜性,常規分離方法難以高效完成目標藥物及生物質的分離檢測,迫切需要高選擇性的分離方法[1-3]。分子印跡技術在分析領域無疑極具吸引力,因為這種技術創造了選擇性結合位點,將目標分子的特征通過印跡而保留[4-6]。但該項技術仍有一些局限性,如高毒物質不能用作模板制備印跡材料[7,8],模板泄露則導致無法正確定量測定及模板凈化[9,10]。碎片印跡技術不是采用目標分子作模板,而是使用目標化合物的部分結構或片段作為模板制備印跡聚合物,這樣就可消除分子識別中的模板殘留[11-14]。

薯蕷皂苷(Dioscin)是一種具有廣闊生物活性的天然產物[15],常存在于一些藥用植物的根莖中,具有抗骨質疏松、抗癌、抗炎、抗神經變性、抗感染及抗衰老[16-19]等藥理活性,對心血管疾病、過敏性疾病、2型糖尿病、神經退行性疾病、皮膚老化及更年期癥狀有較好的預防和治療效果[20-22]。從植物中提取并分離薯蕷皂苷是獲取該化合物的主要來源,但薯蕷皂苷水溶性差[23]、生物利用度低[24,25],大大限制了薯蕷皂苷的提取和應用?；诜肿佑≯E材料的高選擇吸附性能,將這種具有特異識別能力的印跡聚合物作為固相萃取吸附劑以實現對薯蕷皂苷的分離和富集是一種低成本、高效率且操作簡單的分離分析技術。本工作以葡萄糖及齊墩果酸為模板碎片,采用沉淀法制備印跡聚合物,探討這種碎片印跡聚合物對目標化合物薯蕷皂苷的吸附及提取分離效能。

1 實驗部分

1.1 試劑及材料

薯蕷皂苷(99%,質量分數,下同)、4-乙烯基吡啶(98%)、N-異丙基丙烯酰胺(98%)及交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(98%)均購自河南省萬家標準物質研發中心有限公司;偶氮二異丁腈(98%)購自美國阿拉丁工業公司;色譜純的正硅酸乙酯、乙腈及甲醇購自成都金山化學試劑有限公司;分析純的乙酸、乙醇及甲苯購自天津市永大化學試劑有限公司。葡萄糖(98%)和齊墩果酸(97%)購自中國醫藥生物制品檢定所。

薯蕷皂苷樣品溶液:稱取20 g干燥的盾葉薯蕷莖[26],粉碎,浸入200 mL含30%鹽酸的乙醇-水溶液(體積比7∶3)中,超聲處理2 h,過濾,濾渣再用同樣的溶劑重復提取2次,合并提取液。減壓蒸餾除去大部分溶劑后,用少量乙酸-乙腈混合溶液(體積比2∶8)溶解,過濾除去固體物,所得溶液即為薯蕷皂苷樣品溶液,備用。

1.2 設備及儀器

S-3400N掃描電鏡(日本);WGH-30A 傅里葉紅外光譜儀(中國天津儀器有限公司);LC-40D 高效液相色譜儀和UV-2550 紫外可見光譜儀(日本島津公司);TD-3500 X射線衍射儀(上海第二光學儀器廠);高速臺式離心機TGL-16(金壇大地儀器廠);電子天平FA2104N(上海菁海儀器公司);真空干燥箱DZ-1AII(天津泰斯特儀器公司);超聲波清洗器KQ250E(昆山市超聲儀器廠);恒溫水浴鍋GSY-Ⅱ(北京市永光明醫療儀器廠)。

1.3 薯蕷皂苷印跡聚合物的制備

將一定量的模板分子加入到10 mL甲苯-甲醇(體積比為4∶1)混合溶劑中,超聲處理5 min,加入0.3 mmol 4-乙烯基吡啶、0.3 mmol N-異丙基丙烯酰胺、10.0 mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯及20.0 mg偶氮二異丁腈。再用超聲波處理5 min,通入氮氣處理15 min,密封,反應體系置于333 K油浴鍋中反應24 h后,將混合物加入到50.0 mL 20%乙酸-甲醇混合溶液中,靜置4 h后,除去上層清液,再用同樣體積的乙酸-甲醇混合溶液重復浸泡2次,過濾,固體置于真空干燥箱中干燥12 h,即得薯蕷皂苷印跡聚合物。制備非印跡聚合物(NIP)時,除不加模板分子外,其他步驟與印跡聚合物的制備步驟相同。各印跡聚合物模板的類型及用量參見表1。當用葡萄糖或齊墩果酸為模板時,分子印跡聚合物的命名為GL-MIP或OL-MIP。

表1 碎片印跡聚合物的制備a

1.4 紅外光譜分析

樣品置于373 K真空干燥箱中干燥4 h,然后測試分子印跡聚合物和非印跡聚合物的紅外光譜圖。

1.5 電鏡分析

測試分子印跡聚合物和非印跡聚合物的電鏡圖,觀察顆粒大小和表面形貌。

1.6 吸附測試

1.6.1 吸附動力學 在20 mL 0.10 g·L-1薯蕷皂苷的乙腈溶液中,加入20 mg分子印跡聚合物,吸附開始后,每間隔0.5 h后,取少量上清液,用HPLC測定上清液中薯蕷皂苷的質量濃度,按方程(1)計算不同時間下分子印跡聚合物的吸附量Qt(mg·g-1)。平行測定3次,取其平均值。

(1)

式中,c0和ct分別為薯蕷皂苷的初始質量濃度和吸附t時間后的質量濃度,g·L-1;V為溶液的體積,mL;m為吸附劑的質量,g。

1.6.2 吸附等溫線 在5.0 mL濃度不同的薯蕷皂苷-乙腈溶液中,分別加入5 mg分子印跡聚合物,吸附4 h后,用HPLC法測定各溶液中薯蕷皂苷濃度。按方程(2)—(4)計算(Qe,mg/g)、分布系數KD(mL·g-1)及選擇因子α。

(2)

(3)

(4)

其中c0和ce分別為薯蕷皂苷的初始濃度和平衡濃度,g·L-1;V為溶劑體積,mL;m為吸附劑質量, g。KD(template)和KD(analogue)分別為模板及類似物的分布系數。

1.7 分子印跡固相萃取

1.7.1 萃取柱的制備 取一根底端裝有篩板的萃取用空柱管,用甲醇和去離子水洗凈,晾干,稱取1.5 g薯蕷皂苷印跡聚合物,均勻裝填到柱中,在裝填過程中邊裝填邊輕輕敲打柱管,使聚合物填充均勻、緊實。然后,依次用10 mL甲醇及10 mL乙腈溶液流過固相萃取柱,去除聚合物中雜質,使萃取柱活化,備用。

1.7.2 上樣和洗脫 取3.0 mL樣品溶液上樣,下端用真空抽吸,收集流出液。上樣后依次用2×1 mL 乙腈、2×1 mL 乙酸乙酯、5×1 mL H2O-C2H5OH(體積比1∶1)混合液、5×1 mL H2O-CH3OH(體積比1∶1)混合液、5×1 mL甲醇、3×1 mL甲醇-乙酸(體積比8∶2)進行洗滌和洗脫,分別收集各淋洗與洗脫步驟的流出液,進行HPLC分析。

1.8 高效液相色譜分析

高效液相色譜分析在C18柱上進行,以乙腈-水(體積比9∶1)混合溶劑為流動相,流速為1.0 mL·min-1,檢測波長203 nm,進樣體積為10 μL。采用標準曲線法進行定性和定量。薯蕷皂苷標準曲線方程為:

Y=9 332.3c-12.24,R2=0.999 0。

式中:Y為峰面積;c為底物濃度,g ·L-1;R2為相關系數。

2 結果與討論

2.1 分子印跡聚合物的制備和表征

根據薯蕷皂苷的分子結構(如圖1所示),葡萄糖及齊墩果酸為目標分子中的部分結構或具有部分相似的結構,以這兩種碎片分子作為模板,采用沉淀聚合法制備了分子印跡聚合物。4-乙烯基吡啶和N-異丙基丙烯酰胺為混合功能單體,二者均可與模板分子中的羥基形成氫鍵復合物。為了考察碎片印跡聚合物對目標化合物薯蕷皂苷的分子識別能力,在制備時,其他單體及用量與制備條件均固定不變,僅改變模板的類型及用量。

圖1 幾種化合物的分子結構

分別以葡萄糖或齊墩果酸為模板,考察不同模板用量下分子印跡聚合物的分布系數KD (Dioscin)。為便于比較,將非印跡聚合物的分布系數也列入其中。從表1中的結果可以看出,無論是以葡萄糖還是齊墩果酸為模板,也不管模板用量的多少,制備的分子印跡聚合物的分布系數明顯高于非印跡聚合物。這表明以葡萄糖或齊墩果酸為模板時,在印跡聚合物基體中形成了可對薯蕷皂苷具備選擇作用的識別位點。在制備過程中,當模板分子葡萄糖或齊墩果酸的用量增加時,分子印跡材料的分布系數增加,但當葡萄糖用量超過0.3 mmol,齊墩果酸用量超過0.4 mmol時,分子印跡聚合物的分布系數變化不大。顯然,當模板用量過低時,在聚合物基體中形成的印跡位點過少,不利于印跡聚合物的分子吸附。但印跡聚合物的分布系數也并非完全與模板用量成正比,這可能是由于當模板濃度較高時,易形成模板分子低聚物,從而改變印跡空穴的大小和形狀,引起印跡空穴-薯蕷皂苷分子間的適應性降低所致。由于葡萄糖分子及齊墩果酸分子均含有與目標化合物薯蕷皂苷分子相似的分子碎片,于是,使用二者的混合物為模板制備印跡材料。采用因子設計,考察在不同葡萄糖用量及齊墩果酸用量間的交互作用下,所得分子印跡材料的分布系數。結果顯示,在齊墩果酸用量固定時,印跡材料的分布系數與葡萄糖用量呈現了一定的正相關性。當二者用量均為0.6 mmol時,所得印跡材料的分布系數并非最高,而當葡萄糖和齊墩果酸的用量分別為0.6和0.1 mmol時,分子印跡聚合物(GL-OL-MIP4)的分布系數最大,其值為368.2 mL·g-1。采用混合碎片作為模板,由于此方式增加了識別位點類型,有助于提高印跡材料的吸附性能。但值得注意的是,這種交互作用也顯示了兩種碎片對印跡材料的分子識別具有不同程度的影響。

圖2 分子印跡聚合物(GL-OL-MIP4)及非印跡聚合物(NIP)的紅外光譜

圖3 分子印跡聚合物(GL-OL-MIP4)及非印跡聚合物(NIP)的掃描電鏡圖

2.2 分子印跡聚合物的吸附性能

2.2.1 等溫吸附 設定溫度為30 ℃,測試分子印跡聚合物(GL-OL-MIP4)對目標化合物薯蕷皂苷的等溫吸附能力。如圖4所示,碎片印跡聚合物對薯蕷皂苷具有較強的吸附能力,其飽和吸附量約為34.67 mg·g-1,遠高于非印跡材料NIP(其飽和吸附量約為14.59 mg·g-1)。當底物濃度相同時,印跡材料的吸附能力均強于非印跡聚合物,這可能源于碎片分子的印跡孔穴對目標化合物有分子識別作用。這也顯示了目標分子碎片在分子印跡識別應用中的可能性。

圖4 分子印跡聚合物(GL-OL-MIP4)的吸附等溫線

為了探討碎片印跡材料中結合位點特征,對所得碎片印跡聚合物的吸附等溫值進行Scatchard分析,以研究其結合位點分布。采用方程(5)對等溫吸附數據進行線性擬合,得到如圖5所示的直線圖,其中分子印跡聚合物(GL-OL-MIP4)的Scatchard分析線圖表明該印跡基體中主要存在兩類吸附位點,根據直線的斜率和截距可以計算出最大表觀位點數目(Qmax)及平衡離解常數(Kd)。而非印跡聚合物基體中主要存在一類吸附位點。表2給出了印跡及非印跡材料基體中各類吸附位點的Qmax和Kd。對于GL-OL-MIP4印跡聚合物基體中的高親和位點,Qmax和Kd分別為1.762×10-4mol·g-1和1.970×10-4mol·L-1,而低親和位點,其值分別為9.441×10-5mol·g-1和3.782×10-5mol·L-1;對于NIP,Qmax和Kd分別為5.501×10-5mol·g-1和1.763×10-4mol·L-1。

表2 吸附等溫值的Scatchard分析

(5)

2.2.2 吸附選擇性 考察印跡材料對模板薯蕷皂苷及相關化合物薯蕷皂苷元、重樓皂苷及重樓皂苷元(分子結構示于圖1)的靜態吸附,測試碎片印跡聚合物GL-OL-MIP4的吸附選擇性,得到表3。薯蕷皂苷提取物中常含有這些化合物,測定印跡聚合物對目標的選擇性可為提取分離目標化合物提供基礎。從表中結果可以看出,印跡材料對目標化合物薯蕷皂苷具有一定的選擇性,最高選擇因子為1.356。選擇性不夠高的原因在于這些相關化合物的分子結構中都含有與碎片模板的類似結構。但印跡材料仍對目標化合物具有較高的吸附選擇性。

表3 分子印跡聚合物(GL-OL-MIP4)對目標化合物薯蕷皂苷的選擇性

2.3 分子印跡固相萃取

2.3.1 模擬樣品溶液的固相萃取 以分子印跡聚合物GL-OL-MIP4為固相萃取吸附劑,考察其對含0.1 g·L-1的薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元、重樓皂苷及重樓皂苷元模擬混合溶液中目標化合物薯蕷皂苷的提取分離效能。取一定體積(3.0 mL)的模擬樣品溶液上樣,收集流出液,測定流出液中薯蕷皂苷濃度,計算裝載量。依次用2×1 mL 乙腈、2×1 mL 乙酸乙酯、5×1 mL H2O-C2H5OH(體積比1∶1,下同)混合液、5×1 mL H2O-CH3OH(1∶1)混合液、5×1 mL甲醇、3×1 mL甲醇-乙酸(8∶2)進行洗滌和洗脫,提取過程中,分別收集各淋洗與洗脫步驟的流出液,而后進行HPLC分析,計算各步驟中薯蕷皂苷回收率。結果如表4所示?？梢园l現,當使用分子印跡聚合物萃取時,用2×1 mL 乙腈和2×1 mL乙酸乙酯進行洗滌,主要洗滌雜質化合物,僅有少量的目標化合物脫出。而用5×1 mL H2O-C2H5OH(1∶1)混合液和5×1 mL H2O-CH3OH(1∶1)混合液進行洗脫時,可以回收大部分目標化合物(薯蕷皂苷回收率達86.01%),薯蕷皂苷得到了有效富集和分離。而非印跡聚合物富集和分離效能較低。另外,分子印跡固相萃取的總回收率達99.66%,顯示了較好應用效能。

表4 分子印跡聚合物固相萃取

2.3.2 實際樣品的固相萃取 取5.0 mL的樣品溶液上樣,收集流出液,靜置3 min后,按照模擬樣品溶液的萃取方式,依次用2×1 mL 乙腈、2×1 mL 乙酸乙酯、5×1 mL H2O-C2H5OH(1∶1)混合液、5×1 mL H2O-CH3OH(1∶1)混合液、5×1 mL甲醇、3×1 mL甲醇-乙酸(8∶2)進行洗滌和洗脫,提取過程中,分別收集用5×1 mL H2O-C2H5OH(1∶1)和5×1 mL H2O-CH3OH(1∶1)混合液洗脫時的流出液,合并流出液,減壓蒸餾除去大部分溶劑后,再用少量乙醇溶解,HPLC法測定產品中薯蕷皂苷含量。圖6給出了樣品溶液及分子印跡固相萃取提取液的高效液相色譜圖。保留時間為17.85 min的色譜峰為薯蕷皂苷?？梢园l現,對于成分較為復雜的樣品溶液(顯示多色譜峰,見圖6a)經分子印跡固相萃取和分離后,產品中雜質峰大幅減少(圖6b)。粗提物中的薯蕷皂苷得到了較好的分離和純化,顯示了分子印跡聚合物提取樣品溶液中的薯蕷皂苷時,具有較好的提取分離應用效能。

圖6 盾葉薯蕷粗提液及分子印跡固相萃取產物的HPLC圖

2.4 重現性測試

為了測定分子印跡聚合物的重復使用性能。將1.0 g分子印跡聚合物加入到5.0 mL質量濃度為0.6 g·L-1的薯蕷皂素標準溶液中,吸附4 h后,過濾,計算吸附量。固體用甲醇-乙酸(9∶1)混合溶液洗凈吸附在聚合物上的目標化合物,過濾后將固體重新加入到5 mL等濃度的模板溶液中,吸附、過濾,測定吸附量。重復操作10次。每次使用后,印跡聚合物的吸附量標示于圖7中。結果發現吸附量改變不大,可以重復使用。

圖7 分子印跡聚合物使用重現性

3 結論

以葡萄糖及齊墩果酸為模板碎片,4-乙烯基吡啶-N-異丙基丙烯酰胺為共同功能單體,制備了一種可用于選擇提取薯蕷皂苷的碎片印跡微球。當兩種模板碎片(葡萄糖和齊墩果酸)用量分別為0.6和0.1 mmol時,所得印跡聚合物GL-OL-MIP4的分布系數最大(其值為368. 2 mL·g-1)。該印跡微球平均粒徑約11.3 μm,對薯蕷皂苷具有較強的吸附能力,飽和吸附量約34.67 mg·g-1。Scatchard分析表明這種碎片印跡材料(GL-OL-MIP4)主要有兩類親和位點,其中,高親和位點的表觀鍵合位點數目Qmax和吸附離解常數Kd分別為1.762×10-4mol·g-1和1.970×10-4mol·L-1;對于低親和位點,其值分別為9.441×10-5mol·g-1和3.782×10-5mol·L-1。印跡材料對目標化合物薯蕷皂苷具有一定的選擇性,選擇因子為1.356。當使用該印跡聚合物為吸附劑固相萃取分離盾葉薯蕷中的薯蕷皂苷時,在洗脫步驟中用5×1 mL H2O-C2H5OH(1∶1)混合液和5×1 mL H2O-CH3OH(1∶1)混合液洗脫時,可以回收86.01%的目標化合物,薯蕷皂苷得到了有效富集和分離,總回收率達99.66%。薯蕷皂苷經分子印跡萃取和分離后,產品中雜質大幅減少,薯蕷皂苷得到了較好的分離和純化。另外,該種印跡聚合物可重復使用,吸附量改變不大。