腦型肌酸激酶促進膠質瘤干細胞增殖

梁盼盼，朱秋泓，周文超

（中國科學技術大學生命科學與醫學部附屬第一醫院病理科，合肥 230036）

膠質母細胞瘤（glioblastoma, GBM）是一種常見的惡性原發性腦腫瘤[1,2]，患者中位生存期僅為12～16 個月[3,4]。GBM 中的膠質瘤干細胞（glioma stem cells, GSCs）具有很強的自我更新、多向分化和治療抵抗能力，與GBM 的惡性發展和治療抵抗密切相關，是GBM 中的關鍵惡性細胞群體，因此是GBM 治療的主要靶細胞[1,5]。

肌酸（creatine, Cr）是臨床上用于膠質瘤磁共振波譜（MRS）檢測的常用指標之一，與膠質瘤惡性程度有關[6‐8]，但其發揮促腫瘤作用的具體機制尚不清楚。在細胞中，Cr 主要作為肌酸激酶（creatine kinase, CK）的代謝底物發揮功能。CK 催化Cr 與磷酸肌酸（phosphocreatine, PCr）相互轉化，同時伴隨著ATP 的消耗或再生成，由此構成CK/PCr 系統，發揮能量緩沖功能，調控細胞能量穩態[9‐11]。腦型肌酸激酶（brain‐type creatine kinase, CKB）是腦組織中含量最豐富的CK 亞型[12]。研究表明，肌酸激酶/磷酸肌酸（creatine kinase/phosphocreatine, CK/PCr）系統對于一些具有高能量需要的細胞如神經元、精子和肌細胞等至關重要[11]，而腫瘤干細胞相比于非干性腫瘤細胞維持更高的細胞ATP 水平[13]，因此CK/PCr系統可能通過促進GSCs 維持進而助長GBM 惡性發展?；谝陨贤茰y，本文探討了CKB 催化的CK/PCr系統在GSCs 中的功能及其潛在的治療意義，為提供一種GSCs 的GBM 治療新方案提供實驗依據。

材料與方法

1 試劑

兔 抗CKB/CKM 多 克 隆 抗 體（15137‐1‐AP）和小鼠抗α‐tubulin 單克隆抗體（HRP‐66031）購自Proteintech 公司；小鼠抗CKB 抗體 B‐9（sc‐373686）購自Santa Cruz Biotechnology 公司；羊抗SOX2 抗體（AF2018）購自R&D Systems 公司；兔抗SOX2單克隆抗體（3579）購自Cell Signaling Technology公司；Alexa Fluor? 568 標記的驢抗兔熒光二抗（A‐10042）、Alexa Fluor? 488 標記的驢抗羊熒光二抗（A‐11055）、Hoechst 33342，三鹽酸鹽，三水合物（H3570）、HRP 偶聯的羊抗鼠二抗（A16072）、HRP 偶聯的羊抗兔二抗（65‐6120）均購自Invitrogen公司；RPMI 1640(C3010‐0500)、DMEM 高糖培養基（C3113‐0500）和Trypsin EDTA Solution A（C3530）均來自VivaCell 公司；胎牛血清（FB25015）來自CLARK 公司；Neurobasal?‐A Medium（12349‐015）和50×B‐27 補 充 劑（17504044）來 源 于Gibco 公司；丙酮酸鈉溶液（03‐042‐1B）、非必需氨基酸溶液（01‐340‐1B）、青鏈霉素溶液（03‐031‐1B）和L‐谷氨酰胺溶液（03‐020‐1A）均來源于BI 公司；Accutase（7922）來源于STEMCELL 公司；重組人表皮生長因子EGF（1150‐04‐1000）來源于GoldBio公司；重組人成纖維細胞生長因子FGF（100‐18B‐1000）來源于Peprotech 公司；CCK8‐試劑（A311‐02）來源于Vazyme 公司；環肌酸（377627）來源于Sigma‐Aldrich 公司；磷酸肌酸（19333‐65‐4）來源于阿拉丁公司。

2 細胞培養

H2S‐GSC 細胞系獲贈于美國匹茲堡大學的Jeremy N Rich 教授，懸浮生長于Neural Basal 完全培養基中。培養基配方為：500 mL Neurobasal?‐A Medium+10 mL B‐27 補充劑（50×）+5 mL 丙酮酸鈉溶液+5 mL 非必需氨基酸溶液+5 mL L‐谷氨酰胺溶液+500 μL 青霉素/鏈霉素溶液+10 μL 重組人表皮生長因子EGF（1 mg/mL）+10 μL 重組人成纖維細胞生長因子FGF（1 mg/mL），置于37 ℃ 5% CO2的恒溫細胞培養箱進行培養。H2S‐NSTC 細胞通過含有10%～20%胎牛血清的RPMI‐1640 培養基對H2S‐GSC 進行誘導分化7 ～10 d 獲得。

3 膠質瘤組織收集

本實驗所涉及的膠質瘤組織收集經過中國科學技術大學生物醫學倫理委員會批準，從中國科學技術大學附屬第一醫院手術室收集，包含3 例WHO IV級 GBM 樣本（患者女66 歲，男73 歲和男73 歲）。

4 生物信息學分析方法

膠質瘤靜脈和足背靜脈血漿代謝組學數據來源于Xiong N 等[14]發表的代謝組學數據，分別計算13個患者相應的膠質瘤靜脈/足背靜脈比值，對13 組比值求平均得到FC（Fold change），并計算log2FC，篩選出log2FC ＞ 1.5 且P ＜ 0.05 的代謝物認為其在膠質瘤靜脈中顯著上調，篩選出log2FC ＜ ‐0.2 且P＜ 0.05 的代謝物認為其在膠質瘤靜脈中顯著下調。GBM 單細胞測序數據來源于Neftel 等[15]發表的研究成果（GEO：GSE131928），使用PCA 對單細胞數據進行降維，使用原始Louvain 算法進行聚類，使用tSNE 進行可視化，降維、聚類和可視化算法均基于R 語言實現；通過單細胞拷貝數變異（CNV）分析區分惡性腫瘤細胞和非惡性細胞；進而通過特定細胞類型的分子標記物基因集合的綜合表達情況將非惡性細胞分群為巨噬細胞（CD14、AIF1、FCER1G、FCGR3A、TYROBP、CSF1R）、T 細 胞（CD2、CD3D、CD3E、CD3G）和少突膠質細胞（MBP、TF、PLP1、MAG、MOG、CLDN11）。分離出腫瘤細胞群，通過干性相關基因集（OLIG1、OLIG2、SOX2、SOX4、SOX9、SOX11、STMN2、STMN4、OMG、PLLP、DCX、DLX5、CD44 和PROM1）的綜合表達情況對單細胞的干性程度進行打分。

5 Western blot

收集細胞，加入適量裂解液裂解，4 ℃ 13000 r/min 離心10 min，取上清液，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液制備成一定濃度的蛋白樣，煮沸10 min，取10 μg 進行SDS‐PAGE 電泳，蛋白條帶轉移到PVDE 膜上，加5%脫脂牛奶封閉1 h，4℃一抗稀釋液（1 ∶1000 ～1 ∶2000）孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜3 次×5 min，孵育特超敏ECL 化學發光底物，使用Bio‐Rad 化學發光凝膠成像儀進行顯影。

6 qRT-PCR

RNA 抽 提、反 轉 錄cDNA 和qRT‐PCR 等 步驟中所用試劑分別為EZ‐10 柱式總RNA 抽提試劑 盒（BBI, B610583）、PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa，RR036A）和熒光定量PCR 試劑盒SYBR Green（Biosharp, BL705A），具體操作依據試劑商提供的標準說明書進行。引物序列：CKB 上游——5’‐TTCTCAGAGGTGGAGCTGGT，下 游 ——5’‐AGGCATGAGGTCGTCGAT；SOX2上 游——5’‐GCTGCGAACAGTCAGACAGA， 下游——5’‐ACCTCCCGTCCAAGGTAG；PRL13A 上游——5’‐CTCAAGGTCGTGCGTCTG，下游——5’‐TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC。

7 免疫熒光染色

組織切片使用磷酸鹽緩沖液（PBS）常溫潤洗5 min，4%多聚甲醛常溫固定15 min，PBS 洗片3 次×5 min，含1%牛血清白蛋白、0.3% TritonX‐100 的PBS 溶液透膜封閉1 h，PBS 洗片5 min，4 ℃一抗稀釋液（1 ∶200 ～1 ∶300）孵育過夜，PBS 洗片3 次×5 min，常溫熒光二抗稀釋液（1 ∶1000）和Hoechst 染料（0.00005%）避光孵育2 h，PBS 避光洗片3 次×5 min，封片劑封片，干燥1 h 以上即可使用熒光顯微鏡觀察。

8 慢病毒包裝與轉染

本實驗所用慢病毒包裝細胞為293T 細胞；慢病毒包裝質粒psPAX2（Plasmid #12260）和pCI‐VSVG（Plasmid #1733）來源于Addgene；敲低質粒shNT、shCKB‐1 和shCKB‐2 插 入 序 列 分 別 為5’‐CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTC‐GAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTT‐3’（shNT）、5’‐CCGGCGAGGAGTCCTACGAAGT‐GTTCTCGAGAACACTTCGTAGGACTCCTC‐GTTTTTTG‐3’（shCKB‐1）、5’‐CCGGC‐CCAGATTGAAACTCTCTTCACTCGAGTGAAGA‐GAGTTTCAATCTGGGTTTTT‐3’（shCKB‐2）。 利用磷酸鈣轉染法將質粒導入細胞，病毒包裝質粒與目的表達質粒比例為6 μg ∶6 μg ∶6 μg，質粒轉染24 h 后更換新鮮培養基，再48 h 后收集含病毒培養基上清。

9 CCK-8 實驗

將細胞制備成每毫升1.25×104個細胞的細胞懸液，接種于96 孔板中，每孔添加200 μL 的細胞懸液（2500 個細胞），空白對照組則添加200 μL 的培養基，每組4 重復。檢測時每孔加入20 μL CCK‐8 試劑，置于細胞培養箱中避光孵育2 h后，測定OD450。

10 統計學分析

本研究中所有柱狀圖、散點圖和折線圖均使用Graphpad prism 8.0 軟件繪制。柱狀圖和散點圖使用非配對t檢驗（非參數，雙尾檢驗）分析兩組數據間差異的顯著性；折線圖使用雙因素方差分析（多重比較檢驗，Tukey 法）分析差異的顯著性。*表示P＜ 0.05，**表示P＜ 0.01，***表示P＜ 0.001，P＜0.05 表示兩組數據間存在差異。

結 果

1 膠質瘤靜脈血中Cr 含量顯著上升

為了探究膠質瘤與正常組織的代謝差異，基于Xiong N 等[14]發表的代謝組數據分析13 例膠質瘤患者的膠質瘤靜脈與相對應足背靜脈血液樣本中存在差異的代謝物。通過熱圖（圖1A）展示膠質瘤靜脈相比于足背靜脈血液樣本中含量顯著升高或降低的代謝物。Cr 水平在所有膠質瘤靜脈相比于足背靜脈血液中均顯著上調（圖1B）。Cr 的主要功能是作為CK 的代謝底物參與到CK/PCr 系統中調控細胞能量穩態[16]（圖1C），而CKB 是主要存在于腦組織的CK 同工酶。

2 CKB 在干性樣腫瘤細胞群中高表達

基于Neftel 等[15]發表的GBM 單細胞轉錄組測序數據集分析Cr 代謝的催化酶基因CKB 在干性樣腫瘤細胞群和非干性腫瘤細胞群中的相對表達水平。首先從GBM 單細胞數據中分離出腫瘤細胞群（圖2A），并通過干性相關基因集的綜合表達情況對單細胞的干性程度進行打分（圖2B）。接著分析CKB 在腫瘤細胞群中的表達，結果顯示高表達CKB細胞在腫瘤細胞群中分布范圍基本與高干性細胞的分布范圍一致（圖2C）。將圖2B 中干性得分相對較高的細胞群定義為干性樣腫瘤細胞群，反之為非干性腫瘤細胞群，進而分析CKB 在干性樣腫瘤細胞群和非干性腫瘤細胞群中的表達，結果顯示CKB在干性樣腫瘤細胞群中有著更高和更廣泛的表達水平（圖2D）。最后，通過對Mario L. Suvà 等[17]發表的GSCs 和從GSCs 誘導分化而來的NSTCs 的混樣轉錄組測序數據進行分析，進一步驗證了CKB 在GSCs 相對于NSTCs 中表達上調（圖2E）。

3 膠質瘤干細胞CKB 較非干性腫瘤細胞顯著增高

通過Western blot 和qRT‐PCR 技術，分別從蛋白和mRNA 水平檢測CKB 在GSCs 和NSTCs 中的表達水平顯示：CKB 在GSCs 的表達水平顯著高于NSTCs（圖3A，3B）。接下來，收集3 例手術切除的GBM 冰凍切片，通過免疫熒光染色分析CKB 和SOX2 在GBM 組織內的分布情況，結果顯示CKB與干性標記物SOX2 呈現一種共標的染色模式。隨后，統計3 張免疫熒光染色圖中CKB+像素點分別在SOX2+和SOX2﹣區域所占的比例，結果顯示CKB+SOX2+的細胞比例顯著高于CKB+SOX2﹣的細胞，說明在人體內的GBM 組織中，CKB 也更傾向于在SOX2+細胞中高表達（圖3C）。

圖3 CKB 的蛋白和mRNA 水平在膠質瘤干細胞相比于非干性腫瘤細胞中的表達差異分析。A，Western blot 檢測CKB 的蛋白水平在GSCs 較NSTCs 中的表達。B，qRT‐PCR 檢測CKB 的mRNA 水平在GSCs 較NSTCs 中的表達（***P ＜ 0.001，n=4）。C，免疫熒光染色檢測CKB和SOX2 在GBM 組織冰凍切片中的共定位，并統計CKB+像素點分別在SOX2+和SOX2‐區域所占的比例（*P ＜ 0.05，n=3）。比例尺，25 μmFig. 3 Expression difference of CKB in glioma stem cells compared with non‐stem tumor cells. A, the protein level of CKB in GSCs and NSTCs was detected by Western blot. B, the mRNA level of CKB in GSCs and NSTCs was detected by qRT‐PCR (***P ＜ 0.001, n=4). C, the co‐localization of CKB and SOX2 in the frozen sections of glioblastoma tissues was detected by immunofluorescence staining, and the proportion of CKB+ pixels in SOX2+ and SOX2‐ regions was calculated (*P ＜ 0.05, n=3). Scale bar, 20 μm

4 敲低CKB 顯著抑制膠質瘤干細胞的增殖

為了探討CKB 在GSCs 中是否發揮功能，使用兩個靶向于CKB 的shRNA（shCKB‐1 和shCKB‐2）分別在GSCs 和NSTCs 中敲低CKB（圖4A），通過CCK‐8實驗檢測敲低CKB能否對GSCs和NSTCs的存活和增殖產生影響，結果顯示敲低CKB 明顯抑制GSCs 的增殖，而對NSTCs 影響較?。▓D4B），進一步通過體外成球實驗證明CKB 為GSCs 增殖所必須（圖4C）。

圖4 敲低CKB 對膠質瘤干細胞和非干性腫瘤細胞存活和增殖的影響。 A，Western blot 檢測靶向于CKB 的shRNA 在GSCs 和NSTCs 中敲低CKB 的程度。B，CCK‐8 實驗分析敲低CKB 對GSCs 與NSTCs 存活和增殖的影響（*/***P ＜ 0.05/0.001；ns 無統計學差異，n=4）。C，體外成球實驗檢測敲低CKB 對GSCs 成球能力的影響，細胞明場圖片于顯微鏡100×放大倍數下采集，細胞球數目為顯微鏡圖片中4 cm×4 cm方框內的細胞球個數，細胞球尺寸為單個細胞球的直徑（***P ＜ 0.001，n=5）。比例尺：50 μmFig. 4 Effects of knocking down CKB on survival and proliferation of glioma stem cells and non‐stem tumor cells. A, the effect of CKB knock‐down by CKB‐targeting shRNA in GSCs and NSTCs was detected by Western blot. B, cell survival and proliferation of the CKB knock‐down GSCs and NSTCs was detected by CCK‐8 assay (*/***P ＜ 0.05/0.001, ns statistically non‐significant, n=4). C, the sphere formation efficiency of CKB knock‐down GSCs in vitro. The bright field pictures of GSCs were collected under the microscope 100× magnification. The sphere number was the number of cell spheres in the box of 4 cm × 4 cm in the microscope pictures, and the sphere size was the diameter of a single spheroid (***P ＜ 0.001, n=5). Scale bar, 50 μm

5 CKB 在膠質瘤干細胞中的功能依賴于CK/PCr系統

為了探究CKB是否通過CK/PCr系統促進GSCs生存和增殖，本實驗使用一系列濃度梯度的環肌酸（cyclocreatine，CCr）分別處理GSCs 和NSTCs 48 h。CCr 是Cr 類似物，也可被CKB 磷酸化產生磷酸環肌酸（Phosphocyclocreatine，P‐CCr），但是P‐CCr 的轉化效率僅為PCr 的1/160，可在功能上阻斷CK/PCr 系統[18]（圖5A）。結果顯示CCr 以劑量依賴的效應降低GSCs 的細胞活力，而對NSTCs 的影響較?。▓D5B）。此外，在敲低CKB 的GSCs 中加入Cr 的代謝產物PCr，能在一定程度上挽救敲低CKB 導致的GSCs 細胞活力下降（圖5C）。以上實驗說明CKB 在GSCs 中所發揮的重要作用依賴于CK/PCr 系統。

圖5 環肌酸對膠質瘤干細胞和非干性腫瘤細胞增殖能力的影響以及磷酸肌酸對CKB 敲低膠質瘤干細胞細胞活力的挽救能力。A，肌酸、磷酸肌酸、環肌酸和磷酸環肌酸的分子結構（Cr：肌酸，PCr：磷酸肌酸，CCr：環肌酸，P‐CCr：磷酸環肌酸）。B，CCK‐8 實驗分析使用環肌酸抑制CKB 的代謝功能對GSCs 和NSTCs 細胞活力的影響（**/***P ＜ 0.01/0.001, ns 無統計學差異，n=4）。C，CCK‐8 實驗分析100 μM 磷酸肌酸對CKB 敲低的GSCs 細胞活力的挽救能力（*/***P ＜ 0.05/0.001, ns 無統計學差異，n=4）。Fig. 5 Effect of cyclocreatine treatment on the proliferation of glioma stem cells and non‐stem tumor cells and the rescue ability of phosphocreatine on CKB knock‐down glioma stem cells. A, the molecular structure of creatine (Cr), phosphocreatine (PCr), cyclocreatine (CCr) and phosphocyclocreatine(P‐CCr). B, effect of cyclocreatine treatment on the proliferation of glioma stem cells and non‐stem tumor cells was analyzed by CCK‐8 assay (**/***P＜ 0.01/0.001, ns statistically non‐significant, n=4). C, the rescue ability of 100 μM phosphocreatine on CKB knock‐down glioma stem cells (*/***P ＜0.05/0.001; ns statistically non‐significant, n=4)

討 論

GBM 是一種最惡性的原發性腦腫瘤[1,2]。在GBM 中存在一群關鍵惡性細胞GSCs，與GBM 的惡性發展[19‐21]、治療抵抗[22,23]和復發[24]等過程密切相關，是GBM 治療的潛在策略。據報道，GSCs與NSTCs 具有顯著不同的代謝特征[25]，代謝過程是腫瘤細胞用以維持自身存活和惡性增殖的核心機制，因此靶向抑制GSCs 特異的代謝過程可能對其產生強大的殺傷效應。本研究通過對Xiong N[14]等發表的代謝組學數據分析發現膠質瘤靜脈比足背靜脈血液樣本中存在更高水平的Cr。此外，在臨床膠質瘤MRS 診斷中，Cr 與其他一些顱內代謝物的定性和定量分析常被用于膠質瘤的鑒定、分級預測和腫瘤邊界描繪[6]，這進一步提示了Cr 可能與膠質瘤的惡性發展有關。Cr 是CK/PCr 系統中CK 的代謝底物，被催化與ATP 產生高能磷酸化合物PCr，后者負責在時間和空間層面傳遞能量，對于一些高能量和能量劇烈波動的細胞如神經元、精子和肌細胞等至關重要[11]。有研究表明，GSCs 比NSTCs 維持更高的細胞能量狀態[13]，因此推測CK/PCr 系統可能在GSCs 中發揮了重要作用?；诖送茰y，本文探討了CK/PCr 系統在GSCs 中的功能及其潛在的治療意義。

CK 是CK/PCr 系統關鍵的催化酶，而CKB 是腦組織中含量最為豐富的CK 亞型[12]，本研究首先對CKB 在GSCs 和NSTCs 中的表達情況進行檢測?；贜eftel 等[15]發表的GBM 單細胞轉錄組測序數據集進行單細胞分群，從中分離出腫瘤細胞，并使用一系列干性相關基因的綜合表達情況篩選出干性樣腫瘤細胞和非干性腫瘤細胞，通過分析CKB 在兩個細胞群中的表達情況發現CKB 在干性樣腫瘤細胞群中有著更高和更廣泛的表達水平，這提示CKB 可能在GSCs 相比于NSTCs 中具有更高的表達水平。緊接著基于Mario L. Suvà 等[17]發表的GSCs 和NSTCs的混樣轉錄組測序數據分析，進一步驗證了CKB 在GSCs 相對于NSTCs 中表達上調。隨后，本研究也在體外GSC 細胞系和分化的NSTCs 細胞中證實，CKB 的mRNA 和蛋白水平均在GSCs 較NSTCs 中顯著高表達。本研究進一步探究了CK/PCr 系統在GSCs 中發揮的功能，敲低CKB 或使用抑制劑CCr抑制Cr 代謝能顯著抑制GSCs 的存活和增殖能力，而對NSTCs 的影響較小，而使用Cr 的代謝產物PCr則在一定程度上挽救了CKB敲低導致的細胞死亡，這表明CKB 依賴其對Cr 的代謝活性促進GSCs 的存活和增殖。綜上所述，本研究發現CKB 在GSCs中表達上調，通過CK/PCr 系統促進GSCs 的存活和增殖，是殺傷GSCs 來治療GBM 的一個潛在靶點。

本研究僅初步探討了CKB 在GSCs 中的表達情況和功能。有研究表明CKB 通過直接調控細胞的能量穩態或某些癌基因的表達水平促進包括乳腺癌[26]、結直腸癌[27]、胰腺導管癌[28]、黑色素瘤[29]和人骨肉瘤[30]等多種癌癥的進展，CKB 是否影響GSCs 的細胞能量水平以及發揮信號通路的調控功能還有待進一步探討。