大黃素介導鐵死亡途徑抑制MHCC-97H 人肝癌細胞的遷移和侵襲

張維一，張棟

（1 解放軍總醫院第七醫學中心肝膽外科 北京 100700；2 北京中醫藥大學東方醫院普通外科 北京 100078）

肝癌是一種發生在肝臟部位的惡性腫瘤，在全球癌癥相關死亡中占很大比例，近幾十年來肝癌的發病率和死亡率不斷上升[1]。肝癌的治療方法多種多樣，包括免疫治療、肝移植、手術切除、分子靶向治療、經導管動脈化療栓塞、放療和化療[2]。過去的幾十年見證了肝癌從基礎研究到臨床轉化的進展，然而，由于手術切除率低，復發率高，進展迅速，預后仍然很差[3]。鑒于此，研究新的肝癌治療策略勢在必行。近年來大量的基礎和臨床研究報道中藥在預防和治療肝癌中具有顯著的療效[4]，目前發現中藥在防治肝癌上具有抑制細胞增殖和遷移侵襲、抗血管生成、誘導細胞凋亡及調節免疫功能等作用[5]。大黃素是一種天然的蒽醌衍生物，存在于多個知名的中草藥中（如虎杖、大黃等），其被認為是一種蛋白質酪氨酸激酶抑制劑和抗癌藥物，對包括肝癌在內的多種腫瘤細胞均有活性[6]。有研究表明大黃素可通過靶向調控相關基因抑制肝癌細胞增殖，但大黃素調節肝癌細胞惡性生物學行為的機制仍不十分明確，在本研究中將通過體外培養肝癌細胞探討大黃素對肝癌細胞生物學行為的影響及其作用機制。

材料和方法

1 細胞與主要試劑、儀器

人肝癌細胞MHCC‐97H 購自美國ATCC 公司（平臺編號：Bio‐106194）；大黃素（上海源葉生物科技有限公司，貨號：B20240‐20mg）；DMEM 培養基（上海戶實醫藥科技有限公司，貨號：12800‐017）；順鉑（上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司，貨號：479306）；CCK‐8 試劑盒（上海愛必信生物科技有限，貨號：abs50003）；結晶紫（四川省維克奇生物科技有限公司，貨號：wkq‐07202）；多聚甲醛溶液（湖北科沃德化工有限公司，貨號：kns201639700029）；ANNEXIN V‐FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：CA1020）；康寧Matrigel 基質膠（北京智杰方遠科技有限公司；貨號：354230）；Transwell 小室（北京杰輝博高生物技術有限公司）；兔抗谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase 4,GPX4）（ATCC 公司，貨號：ab125066）、兔抗?；o酶A合成酶長鏈家族成員4（acyl‐CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）（ATCC 公司，貨號：ab155282）單克隆抗體；兔抗FTH1 多克隆抗體（北京索萊寶科技有限公司，貨號：K108517P）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗（上海創賽科技有限公司，貨號：C86‐ SSA004）；鐵離子檢測試劑盒（深圳子科生物科技有限公司，貨號：8448）；增強化學發光試劑（ECL Enhanced chemi‐luminescence, ECL）（上海澤葉生物科技有限公司，貨號：ZY6SL1350）；谷胱甘肽（glutathione,GSH）試劑盒（上海碧云天，編號：S0053）。顯微鏡（型號：M205 FA & M205 FCA；德國徠卡）；酶標儀（型號：CLARIOstar Plus，德國BMG 公司）；預制凝膠蛋白電泳系統（型號：Bolt TM Bis‐Tris Plus，美國賽默飛世爾）。

2 細胞培養

MHCC‐97H 細胞培養在含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養基中，并置于恒溫培養箱中培養，培養箱參數為溫度：37 ℃，二氧化碳：5%，相對濕度：95%，濕度：70%～80%。待細胞密度達到80%～90%時進行消化傳代。

3 細胞分組與藥物處理

取對數期生長的細胞，使用不同濃度（0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00、64.00 μmo/L）的大黃素處理細胞24 h 后采用CCK‐8 法檢測細胞存活率，計算IC50 值，篩選大黃素低、高劑量濃度。并將細胞隨機分為Blank 組、Dose 1 組、Dose 2 組和Positive 組，其中Dose 1 組、Dose 2 組細胞分別使用8 μmo/L、16 μmo/L 的大黃素處理細胞24 h，Positive 組細胞使用60 μg/mL 的順鉑[8]處理細胞24 h。

4 CCK-8 法檢測細胞存活率

取96 孔板，將MHCC‐97H 細胞接種于96 孔板中（密度為5×104個/孔），置于培養箱中培養貼壁至80%～90%時，棄培養液，然后加入不同濃度（0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00、64.00 μmo/L）的大黃素，并設空白對照組，繼續處理細胞24 h 后棄培養基，然后使用PBS 清洗3 次，每孔加入CCK‐8 試劑10 μL，繼續培養2 h后使用酶標儀檢測450 nm處吸光值并計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（給藥組吸光值‐空白組吸光值）/（對照組吸光值‐空白組吸光值）×100%。

5 平板克隆檢測細胞集落形成

收集MHCC‐97H 細胞接種于96 孔板中（5×104個/孔），培養箱培養貼壁至80%～90%時，按照上述細胞分組（Blank 組、Dose 1 組、Dose 2 組和Positive 組）處理細胞，培養24 h 后，使用0.25%的胰酶進行消化，之后將細胞懸浮在培養基中（10%胎牛血清）備用，將細胞接種在6 孔板中（1×104個/孔），培養箱繼續培養細胞至肉眼可見克隆細胞團（每隔1 d 更換一次培養液）后終止培養棄培養液，然后使用PBS 清洗3 次細胞后每孔加入1 mL 多聚甲醛固定細胞15 min，PBS 清洗后每孔加入結晶紫（10 g/L，1 mL）進行染色15 min，然后棄染色液并使用PBS 清洗后計數和拍照?？寺⌒纬陕剩?）=（克隆細胞團數目/接種細胞數目）×100%。

6 Western blot 法檢測各組細胞蛋白表達水平

收集MHCC‐97H細胞分組藥物處理后加入細胞裂解液裂解細胞提取總蛋白，然后使用BCA 法檢測提取的蛋白濃度，然后取適量蛋白樣品進行SDS‐PAGE 凝膠電泳，電泳結束后裁剪凝膠并轉膜（PVDF膜），然后使用5%的脫脂奶粉進行封閉（搖床，2 h），封閉結束后使用TBST 洗膜3 次后加入稀釋的GPX4、ACSL4、FTH1 一抗，并4 ℃孵育過夜，次日回收一抗，TBST 清洗3 次后加入羊抗兔IgG 二抗，在室溫下孵育2h，然后洗膜后滴加ECL 顯影和拍照，并使用Image J 軟件分析灰度值。

7 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

將MHCC‐97H 細胞接種于6 孔板中（1×106個/孔），按照上述分組使用大黃素處理細胞24 h 后消化并制備細胞懸液，細胞懸液置于離心管中離心（800 r/min，3 min）后棄上清，PBS 試劑清洗后，加入1 mL 的1×Binding buffer 重懸細胞，然后根據試劑盒每管加入100 μL 的細胞核5 μL 的Annexin V‐FITC試劑在室溫下避光結合10 min 后加入5 μL 的PI 試劑，在室溫下避光結合5 min 后加入PBS 混勻后立即使用流式細胞儀進行檢測。

8 Transwell 法檢測各組細胞遷移和侵襲能力

收集MHCC‐97H 細胞按照上述分組（Blank 組、Dose 1 組、Dose 2 組和Positive 組）處理細胞24 h。制備基質膠Transwell 小室：將Matrigel 基質膠放入‐4 ℃條件下過夜將基質膠從固體變為液體，將基質膠與DMEM 培養基按照5:1 比例混合混勻，然后取100 μL 混合液加入小室中，37 ℃下孵育60 min 凝固后備用。制備細胞懸液調整細胞密度為5×104個/mL，在Transwell 小室的上室加入細胞懸液（200 μL），下室加入含有胎牛血清的培養基，然后置于培養箱中繼續培養48 h 后棄培養液，使用多聚甲醛固定細胞15 min 后PBS 清洗3 次，然后使用結晶紫染色10 min后使用流水去除多余的染色液，晾干后顯微鏡觀察侵襲細胞數并計數。遷移實驗不加Matrigel 基質膠，其余步驟與侵襲實驗相同。

9 鐵離子水平檢測

收集細胞接種于6孔板中，根據上述分組（Blank組、Dose 1 組、Dose 2 組和Positive 組）藥物處理細胞后棄培養基并使用PBS 清洗，離心后使用100μLPBS重懸細胞，根據試劑盒操作說明檢測總鐵離子水平。Fe2+檢測步驟：每孔加入5 μL 緩沖液（37 ℃）后結合30 min，然后加入鐵離子探針100 μL，避光結合1 h（37 ℃）后使用酶標儀檢測593 nm 處吸光值。Fe3+檢測步驟：每孔加入鐵還原劑（5 μL）結合30 min（37 ℃）后加入鐵離子探針（100 μL），避光結合1 h（37 ℃）后使用酶標儀檢測593 nm 處吸光值。根據標準曲線計算總鐵含量（Fe2+濃度+Fe3+濃度）。

10 GSH 水平的檢測

取MHCC‐97H 分組藥物處理后收集細胞，PBS清洗后離心（1000 r/min，3 min）去上清，加入蛋白去除劑溶液，對細胞進行兩次快速凍融后離心（10000 r/min，10 min）取上清使用GSH 試劑盒檢測其水平。

11 統計學分析

使用SPSS26.0 軟件進行統計學分析，數據均采用平均值±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，采用Graphpad 8.0軟件進行作圖，P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 大黃素抑制MHCC-97H 細胞存活率

使用不同濃度的大黃素處理細胞24 h 后，采用CCK‐8 法檢測細胞存活率，結果如圖1 所示，與0 μmo/L 大黃素比較，1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00、64.00 μmo/L 大黃素處理細胞后，細胞存活率均顯著降低，大黃素作用24 h 時，對于MHCC‐97H細胞的IC50 為15.67 μmo/L，我們選取約1/2 的IC50濃度8 μmo/L 作為大黃素低劑量組干預濃度，選取16 μmo/L 作為大黃素高劑量組干預濃度。

圖1 CCK‐8 實驗檢測大黃素對MHCC‐97H 細胞存活率的影響。與0 μmo/L 組比較，*P＜0.05；n=5Fig. 1 The effect of emodin on the survival rate of MHCC‐97H cells was detected by CCK‐8 assay. *P＜0.05, compared with 0μmo/L group; n=5

2 大黃素抑制MHCC-97H 細胞集落形成

平板克隆結果顯示，與Blank 組比較，Dose‐1、Dose‐2、Positive 組細胞克隆形成率均顯著降低；與Dose‐1 組比較，Dose‐2 組細胞克隆形成率進一步顯著降低（圖2）。由此提示，大黃素可抑制MHCC‐97H細胞集落形成能力。

3 大黃素誘導MHCC-97H 細胞凋亡

流式細胞術結果顯示與Blank 組比較，Dose‐1、Dose‐2、Positive組細胞凋亡率均顯著增加，與Dose‐1組比較，Dose‐2 組細胞凋亡率進一步顯著增加（圖3），提示大黃素可隨劑量的增加增強誘導細胞凋亡的能力。

圖3 流式細胞術檢測大黃素對MHCC‐97H 細胞凋亡的影響。與Blank 組比較，*P＜0.05；與Dose1 組比較，#P＜0.05；n=5Fig. 3 The effect of emodin on apoptosis of MHCC‐97H cells was detected by flow cytometry. *P＜0.05, compared with Blank group; #P＜0.05, com‐pared with Dose1 group; n=5

4 大黃素抑制MHCC-97H 細胞遷移和侵襲

Transwell 法檢測細胞遷移和侵襲能力顯示：與Blank 組比較，Dose‐1、Dose‐2、Positive 組細胞遷移數和侵襲數均顯著減少；且與Dose‐1 組比較，Dose‐2組細胞遷移數和侵襲數均進一步顯著減少（圖4）。結果提示大黃素可明顯降低MHCC‐97H細胞的遷移和侵襲能力。

5 大黃素誘導鐵死亡途徑促進MHCC-97H 細胞凋亡

Western blot結果顯示，與Blank組比較，Dose‐1、Dose‐2、Positive 組細胞中GPX4 蛋白表達水平明顯降低，ACSL4、FTH1 表達水平明顯提高；且與Dose‐1 組比較，Dose‐2 組細胞GPX4 蛋白表達水平進一步降低，ACSL4、FTH1表達水平進一步提高（圖3A）；與Blank 組比較，Dose‐1、Dose‐2、Positive組細胞鐵離子含量明顯增加，GSH 含量顯著降低，且與Dose‐1 組比較，Dose‐2 組細胞鐵離子含量進一步增加，GSH 含量進一步降低（圖3B、C）。

討 論

大黃素對多種惡性腫瘤均具有抑制作用，研究表明大黃素可通過抑制細胞增殖及調控相關因子影響細胞遷移、侵襲和凋亡[9]。多個研究已經表明大黃素可抑制肝癌細胞增殖誘導其凋亡發揮抗癌作用，如Qin 等[10]研究表明大黃素可通過調節自噬和上皮間質轉化之間的串擾抑制肝癌細胞轉移，并誘導細胞凋亡；Yin 等[11]也在研究中發現大黃素可通過調控巨噬細胞極化抑制肝癌生長發揮其抗腫瘤作用。但大黃素抗肝癌的潛在作用機制并不單一，仍需大量實驗進一步進行探究。在本研究中發現大黃素處理細胞后，肝癌細胞克隆形成率顯著降低，且高劑量的大黃素對細胞克隆形成率的抑制作用優于低劑量組，同時流式細胞術結果顯示MHCC‐97H 細胞凋亡率隨著大黃素劑量的增加不斷增加，這提示大黃素可通過抑制細胞增殖，誘導凋亡發揮抗肝癌作用。此外Transwell 小室實驗顯示，大黃素處理后，MH‐CC‐97H 細胞的遷移和侵襲細胞數均顯著降低，且高劑量大黃素組的細胞遷移和侵襲數明顯低于低劑量組，這提示大黃素可呈劑量依賴性抑制MHCC‐97H細胞遷移和侵襲能力發揮抗癌作用。譚章斌等[12]也在研究中表明大黃素可介導相關信號通路抑制肝癌細胞增殖和侵襲，我們的結果與之一致。

鐵死亡是一種鐵依賴性的調節細胞死亡形式，由脂質過氧化的超量積累驅動，其特點是細胞內脂質過氧化物酶（GPX4）的減少及鐵離子和脂質活性氧的堆積[10,11]。近年來，誘導鐵死亡已成為引發癌細胞死亡的一種有前景的治療選擇，特別是對于對傳統治療方法有耐藥性的惡性腫瘤[15]。除了鐵死亡誘導因子外，許多基因也被鑒定為鐵死亡的調節因子或標記物。ACSL4 由于可參與合成某些容易被氧化的膜磷脂，被認為是誘發鐵死亡的必要成員之一，此外細胞內儲存鐵的蛋白FTH1 常被核受體共激活因子4 裂解后釋放鐵離子[16]。在本研究中發現，大黃素處理后，MHCC‐97H 細胞中GPX4 蛋白水平隨著大黃素劑量的增加不斷降低，ACSL4、FTH1 蛋白水平逐漸升高，且大黃素可明顯提高肝癌細胞中鐵離子的含量并降低GSH 水平，這些結果提示大黃素可能通過調節鐵死亡途徑誘導肝癌細胞凋亡進而發揮其抗肝癌的作用。

綜上，大黃素可通過抑制細胞增殖、遷移和侵襲，誘導凋亡發揮其抗肝癌功效，這可能與誘導細胞鐵死亡有關。本研究首次證實大黃素可能通過介導鐵死亡途徑誘導肝癌細胞凋亡，但仍需大量的實驗進行進一步的驗證。