miR-143-3p 通過靶向integrin β1 抑制肝癌進展

李麗坤，邸雅南，陳帝，張晶

（北京航天總醫院消化內科，北京 100076）

據流行病學調查顯示，肝癌是發病率排名前四的癌（每年約748 300 名新增病例），也是世界各地因癌致死排名前三的癌（每年約695 900 名死亡病例）。我國肝癌高發，其患病人數占世界50%以上[1‐2]。目前的研究顯示肝癌的發病與乙型肝炎、丙型肝炎、飲酒以及黃曲霉素污染等因素有關[3‐4]，但對腫瘤進展的分子機制仍了解甚少。因此迫切需要對肝癌的進展與轉移的機制進行研究。

據報道，miRNAs 在癌的發生、進展與預后的調節中發揮著舉重輕重的作用[5]。迄今為止，在各種癌癥中已鑒定出數以千計的發生表達變化的miR‐NAs，這些miRNAs 中就有很多參與調節癌的進展與預后[5‐6]。miR‐143‐3p 已被發現其在結直腸癌、肺癌和胃癌等癌中發揮腫瘤抑制因子的作用[7‐9]。在肝癌中，miR‐143‐3p 也發現與肝內轉移以及不良預后相關，但其對肝癌的具有作用以及潛在的機制仍不完全清楚[10‐11]。近來研究表明，整合素β1（integrin β1）不僅可促進肝癌細胞與基底膜、細胞外基質以及宿主細胞間的黏附，并且其與配體結合進而激活的下游信號進而促進肝癌細胞的增殖、遷移與侵襲[12,13]。在前期實驗中，我們通過生物信息學預測miR‐143‐3p 與integrin β1 存在潛在的結合序列。因此，本研究旨在調查miR‐143‐3p 在肝癌進展中的作用，以及其與integrin β1 的內在聯系。

材料和方法

1 主要實驗試劑

TRNzol Universal總RNA提取試劑、FastKing一步法反轉錄熒光定量PCR 試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；miR‐143‐3p 和U6 引物、miR‐143‐3p擬 似 物（miR‐143‐3p mimics；5’‐UGAGAUGAAG‐CACUGUAGCUC‐3’）及其陰性對照（miR‐NC）、pcDNA‐integrin β1 及其陰性對照（pcDNA‐NC）（生工生物工程(上海)股份有限公司）；Lipofectamine 3000（美國Invitrogen 公司）；XTT 細胞活力檢測試劑盒（美國Trevigen 公司）；EdU 檢測試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；ECL 化學發光試劑（上海碧云天生物科技有限公司）；integrin β1 和GAPDH 兔源抗體、HRP‐羊抗兔二抗（成都正能生物技術有限責任公司）；SP 兔免疫組織化學染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）。

2 臨床樣本收集

收集自2019 年6 月—2022 年6 月在我院行根治性肝葉切除術的25 例肝癌患者（男21 例，女4例；42 ～69 歲，平均年齡（54.7±6.7）歲； T1 期4例、T2 期9 例、T3 期8 例、T4 期4 例；病理分型為肝細胞型），收集肝癌和癌旁組織?；颊邽槭状未_診，未進行過治療。研究方案通過了本院倫理委員會的批準，且獲得了所有患者簽寫的知情同意書。

3 細胞培養、轉染與分組

肝癌細胞株（HepG2、SMMC‐7721、Huh7 和Hep3B）購自北京普非生物科技有限公司，人正常肝細胞株（HHL‐5、HL‐7702、QSG‐7701）購自武漢純度生物科技有限公司。上述細胞接種在含10%胎牛血清的DMEM 培養基中常規培養。取生長良好的HepG2 和Huh7 細胞，按說明書用Lipofectamine 3000 分 別 將miR‐NC、miR‐143‐3p mimics、miR‐143‐3p mimics+pcDNA‐NC 和miR‐143‐3p mimics+cDNA‐integrin β1 轉入細胞，培養48 h 后經過鑒定的細胞分別命名為miR‐NC 組、Mimics組、Mimics+Vec組和Mimics+integrin β1 組。

4 XTT 法檢測細胞增殖活力

將各組細胞以104個/孔的密度再次接種于96孔板中，分別常規培養1、2、3 和4 d，按照說明書，每孔加入50 μL XTT 試劑，37 ℃孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm 波長處光密度值（A），并繪制細胞生長曲線。

5 EdU 法檢測細胞增殖

將各組細胞以104個/孔的密度再次接種于96孔板中，按照說明書，每孔加入終濃度為10 μmol/L EdU 溶液，37 ℃孵育2 h，用4%多聚甲醛固定后，再用0.5% Trizol X‐100 通透細胞5 min，加入100 μL按照說明書配置的熒光標記檢測反應液室溫孵育20 min，用DAPI 染核，用熒光顯微鏡對每視野下EdU陽性細胞計數。

6 Transwell 法檢測細胞遷移與侵襲

將各組細胞以104個/孔的密度（無血清培養基配置的細胞懸液，100 μL）再次接種于Transwell 嵌套小室（包被基質膠的濾膜用于侵襲測定，僅濾膜用于遷移測定），下室孔加600 μL 正常培養基作為誘導劑，培養24 h。用4%多聚甲醛固定嵌套小室濾膜，并用0.2%結晶紫染細胞10 min，顯微鏡下任選5 個實驗對遷至濾膜下表面的細胞計數。

7 RT-qPCR 檢測miR-143-3p 表達

按照試劑盒說明，用TRNzol Universal 總RNA提取試劑提取臨床組織樣本以及培養的細胞的總RNA。將提取的各樣本總RNA 模板連同目的基因的引物用FastKing 一步法反轉錄熒光定量PCR 試劑盒在AFD4800 實時熒光定量PCR 檢測系統（杭州安杰思生物科技有限公司）反應。設置程序為：50 ℃ 30 min，95 ℃ 3 min，40 個循環（95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s）。引物序列：miR‐143‐3p 正向5’‐GT‐GAGATGAAGCACTGTAGC‐3’，反向5’‐GTGCAGG‐GTCCGAGGT‐3’；U6正向5’‐CTCGCTTCGGCAGCA‐CA‐3’，反向5’‐AACGCTTCACGAATTTGCGT‐3’。以U6 作為內部對照，用2‐ΔΔCt法計算miR‐143‐3p 的相對表達量。

8 熒光素酶活性分析檢測miR-143-3p 與integrin β1 靶向關系

將Targetscan 軟件預測的miR‐143‐3p 與integrin β1（基因名為ITGB1PB1）在其3′‐UTR 區的假定結合位點進行堿基突變，并分別將野生型integrin β1 3’UTR 序列片段和突變型序列片段克隆至pGL3‐熒光素酶報告基因的下游。將此倆種熒光素酶活性報告基因載體質粒分別與miR‐143‐3p mimics 或miR‐NC 共轉入細胞。48 h 后，通過化學發光熒光儀檢測的熒光素酶活性分析二者的靶向關系。

9 Western blot 檢測integrin β1 表達

常規法提取臨床組織樣本和培養的細胞樣本中的蛋白。定量樣本中的蛋白濃度后，取等量的蛋白進行常規的Western blot 實驗轉印。封閉膜面上非特異性蛋白后，4 ℃孵育integrin β1（1 ∶2000）和GAPDH（1 ∶8000）抗體過夜；洗膜后，室溫孵育HRP‐羊抗兔IgG（1 ∶2000）1 h；洗膜后，ECL 孵育、化學發光成像儀成像并量化各條帶光密度值，然后以GAPDH 為內部對照進行歸一化處理。

10 integrin β1 免疫組織化學染色

將臨床組織樣本用4%多聚甲醛固定后，按照常規程序用石蠟包埋，然后將其切為連續的切片（6 μm厚）。切片依次脫蠟、水化和阻斷過氧化氫酶后，按照SP 兔免疫組織化學染色試劑盒說明書步驟，行integrin β1 免疫組織化學染色，在顯微鏡獲取染色圖像。

11 統計學分析

用SPSS 20.0 軟件對數據統計分析，數據表示為均數±標準差（±s）。兩組數據間的比較采用t檢驗，多組數據間比較采用單因素方差分析。P＜0.05則認為差異具有統計學意義。

結 果

1 肝癌中miR-143-3p 低表達integrin β1 高表達

qRT‐PCR 檢測顯示，肝癌組織中miR‐143‐3p 的表達水平明顯低于癌旁組織（圖1A、B），且隨肝癌T 分期增加而逐漸降低（圖1B）；Western blot 和免疫組織化學檢測表明，integrin β1 的表達水平明顯高于癌旁組織（圖1C、D），并隨肝癌T 分期增加而逐漸增高（圖1D）。Pearson 相關性分析顯示，miR‐143‐3p 與integrin β1 的表達呈現明顯的負相關（圖1E）。

圖1 miR‐143‐3p 和integrin β1 在肝癌組織和細胞系中表達水平檢測。A，肝癌組織與癌旁正常組織中miR‐143‐3p 表達水平的RT‐qPCR 檢測與統計學分析。B，各T 分期肝癌組織中miR‐143‐3p 表達水平的RT‐qPCR 檢測與統計學分析；C，肝癌組織與癌旁正常組織中integrin β1 表達水平的Western blot 檢測與統計學分析；D，各T 分期肝癌組織中integrin β1 表達的代表性免疫組織化學檢測結果；E，肝癌中miR‐143‐3p 與integrin β1 表達水平相關性的Pearson 分析；F，正常肝細胞株（HHL‐5、HL‐7702、QSG‐7701）與肝癌細胞株（HepG2、Hep3B、Huh7 和SMMC‐7721）中miR‐143‐3p 表達水平的RT‐qPCR 檢測與統計學分析；G，正常肝細胞株（HHL‐5、HL‐7702、QSG‐7701）與肝癌細胞株（HepG2、Hep3B、Huh7 和SMMC‐7721）中integrin β1 表達水平的Western blot 檢測與統計學分析；H 和I，HepG2（H）和Huh7（I）細胞中miR‐143‐3p mimics 轉染效果的RT‐qPCR 檢測與統計學分析；J 和K，轉染miR‐143‐3p mimics 的HepG2（J）和Huh7（K）細胞中integrin β1 表達水平的Western blot 檢測與統計學分析。*P＜0.05 vs 癌旁正常組織（n=25）或正常肝細胞株（n=4）或對照組（n=4）Fig. 1 Detection of expression levels of miR‐143‐3p and integrin β1 in the tissues and cell lines of liver cancer. A, RT‐qPCR detection and statistical analysis of miR‐143‐3p expression levels in liver cancer tissue and adjacent normal tissue; B, RT‐qPCR detection and statistical analysis of miR‐143‐3p expression levels in liver cancer tissues of different T stages; C, Western blot detection and statistical analysis of integrin β1 expression levels in liver cancer tissue and adjacent normal tissue; D, immunohistochemical examination of integrin β1 expression in liver cancer tissues of different T stages;E, Pearson correlation analysis of miR‐143‐3p and integrin β1 expression levels in liver cancer; F, RT‐qPCR detection and statistical analysis of miR‐143‐3p expression levels in normal liver cell lines (HL‐5, HL‐7702, QSG‐7701) and liver cancer cell lines (HepG2, Hep3B, Huh7 and SMMC‐7721);G, Western blot detection and statistical analysis of integrin β1 expression levels in normal liver cell lines (HL‐5, HL‐7702, QSG‐7701) and liver cancer cell lines (HepG2, Hep3B, Huh7 and SMMC‐7721); H and I, RT‐qPCR detection and statistical analysis of miR‐143‐3p mimics transfection effect in HepG2 (H) and Huh7 (I) cells; J and K, Western blot detection and statistical analysis of integrin β1 expression in HepG2 (J) and Huh7 (K) cells after transfection with miR‐143‐3p mimics.*P＜0.001 vs adjacent normal tissue (n=25), normal liver cells (n=4), or control group (n=4)

在培養的肝癌細胞株（HepG2、Hep3B、Huh7和SMMC‐7721）中，miR‐143‐3p 水平均明顯低于正常肝細胞株（HHL‐5、HL‐7702、QSG‐7701）（圖1F， RT‐qPCR 法），integrin β1 的 表達 水平 明顯高于正常肝細胞株（圖1G， Western blot 法）。用miR‐143‐3p mimics 轉染肝癌細胞HepG2（圖1H）和Huh7（圖1I）以過表達miR‐143‐3p，Western blot檢測integrin β1 表達，與miR‐NC 組比較，過表達miR‐143‐3p 的肝癌細胞HepG2（圖1J）和Huh7（圖1K）中，integrin β1 表達均顯著下調。

2 miR-143-3p 抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲

分別應用XTT、EdU 染色和Transwell 法檢測過表達miR‐143‐3p 對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響顯示，與miR‐NC 組比較，過表達miR‐143‐3p 顯著抑制肝癌細胞HepG2（圖2A）和Huh7（圖2B）的增殖活性、EdU 陽性細胞數（圖3C‐3F）、遷移（圖3A、3B、3D、3E）和侵襲（圖3A、3C、3D、3F）。

圖2 過表達miR‐143‐3p 抑制肝癌細胞增殖。A 和B，轉染miR‐143‐3p mimics 的HepG2（A）和Huh7（B）細胞增殖活性的XTT 檢測與統計學分析；C 和D，轉染miR‐143‐3p mimics 的HepG2 細胞的EdU 代表性染色圖像（C）與EdU 陽性細胞比例（D）統計學分析；E 和F，轉染miR‐143‐3p mimics 的Huh7 細胞的EdU 代表性染色圖像（E）與EdU 陽性細胞比例（F）統計學分析。比例尺，50 μm；*P＜0.05 vsmiR‐NC 組，n=4Fig. 2 Over‐expression of miR‐143‐3p inhibited the proliferation of liver cancer cells. A and B, XTT assay and statistical analysis of cell viability of HepG2 (A) and Huh7 (B) cells transfected with miR‐143‐3p mimics; C and D, representative EdU staining images (C) and statistical analysis of the EdU‐positive cells proportion (D) in HepG2 cells overexpressing miR‐143‐3p mimics; E and F, representative EdU staining images (E) and statistical analysis of the EdU‐positive cells proportion (F) in Huh7 cells overexpressing miR‐143‐3p mimics. Scale bar, 50 μm; *P＜0.05 vs miR‐NC group; n=4

圖3 過表達miR‐143‐3p 抑制肝癌細胞遷移與侵襲。A—C，過表達miR‐143‐3p mimics 對HepG2 細胞遷移和侵襲影響的Transwell 法檢測（A）和統計學分析（B 和C）；D—F，過表達miR‐143‐3p mimics 對Huh7 細胞遷移和侵襲影響的Transwell 法檢測（D）和統計學分析（E和F）。比例尺，100 μm；*P＜0.05 vsmiR‐NC 組；n=4。Fig 3. Over‐expression of miR‐143‐3p inhibited the migration and invasion in liver cancer cells. A to C, representative Transwell assay (A) and statistical analysis (B and C) for the effect of overexpression of miR‐143‐3p mimics on migration and invasion of HepG2 cells; D to F, representative Transwell assay (D) and statistical analysis (E and F) for the effect of overexpression of miR‐143‐3p mimics on migration and invasion of Huh7 cells. Scale bar,100μm; *P＜0.05 vs miR‐NC group; n=4

3 miR-143-3p 靶向integrin β1

TargetScan 軟 件 預 測 的miR‐143‐3p 與integrin β1（基因名為ITGB1PB1） 3’‐UTR 區的假定結合位點的堿基互補序列（圖4A），以及突變體的堿基序列。雙熒光素酶活性分析顯示，在與野生型（WT）integrin β1 3’UTR 熒光素酶報告基因載體質粒共轉體系中，miR‐mimics 組熒光活性顯著低于miR‐NC組；在與突變型（Mut）integrin β1 3’UTR 熒光素酶報告基因載體質粒共轉體系中，miR‐mimics 組熒光活性與miR‐NC 組無明顯差異（圖4B）。

圖4 Integrin β1 為miR‐143‐3p 的靶點。A，TargetScan 軟件預測的miR‐143‐3p 與integrin β1 ITGB1PB13’‐UTR 區的假定結合位點的堿基互補序列；B，miR‐143‐3p 與integrin β1 靶向關系的雙熒光素酶報告基因活性檢測與統計學分析。*P＜0.05 vsmiR‐NC 組；n=3Fig. 4 Integrin β1 was a target for miR‐143‐3p. A, the base complementary sequences of putative binding sites of miR‐143‐3p and integrin β1 gene ITGB1PB1 3’‐UTR region predicted by TargetScan software; B, detection and statistical analysis of dual luciferase reporter activity in the targeting relationship between miR‐143‐3p and integrin β1. *P＜0.05 vsmiR‐NC group; n=3

4 上調integrin β1 逆轉miR-143-3p 對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

Western blot 檢測Mimics+Vec 組和Mimics+inte‐grin β1組肝癌細胞HepG2和Huh7中integrin β1表達顯示：Mimics+integrin β1組中integrin β1表達明顯高于Mimics+Vec 組（圖5A）。XTT 檢測細胞增殖活性結果顯示，Mimics+integrin β1組肝癌細胞HepG2（圖5B）和Huh7（圖5C）的增殖活性較Mimics+Vec 組明顯升高。EdU 染色顯示，Mimics+integrin β1 組肝癌細胞HepG2（圖5D、5E）和Huh7（圖5F、5G）的EdU 陽性細胞數同樣明顯增多。Transwell 法檢測2 組細胞遷移和侵襲顯示，Mimics+integrin β1 組肝癌細胞HepG2（圖6A—6C）和Huh7（圖6D—6F）的遷移和侵襲均較Mimics+Vec 組明顯升高。

圖5 過表達integrin β1 對miR‐143‐3p 抑制肝癌細胞增殖作用的影響。A，共轉染miR‐143‐3p mimics 和pcDNA‐integrin β1 的HepG2 和Huh7細胞中integrin β1 表達水平的Western blot 檢測與統計學分析；B 和C，共轉染miR‐143‐3p mimics 和pcDNA‐integrin β1 的HepG2（B）和Huh7（C）細胞增殖活性的XTT 檢測與統計學分析；D 和E，共轉染miR‐143‐3p mimics 和pcDNA‐integrin β1 的HepG2 細胞的EdU 代表性染色圖像（D）與EdU 陽性細胞比例（E）統計學分析；F 和G，共轉染miR‐143‐3p mimics 和pcDNA‐integrin β1 的Huh7 細胞的EdU 代表性染色圖像（F）與EdU 陽性細胞比例（G）統計學分析。比例尺，50 μm；*P＜0.05 vsmiR‐mimics+NC 組；n=3。Fig. 5 Over‐expression of integrin β1 reversed the inhibitory effects of miR‐143‐3p on proliferation of liver cancer cells. A, Western blot detection and statistical analysis of integrin β1 expression in HepG2 and Huh7 cells after co‐transfection of miR‐143‐3p mimics and pcDNA‐integrin β1; B and C,XTT assay and statistical analysis of cell viability of HepG2 (B) and Huh7 (C) cells with co‐transfection of miR‐143‐3p mimics and pcDNA‐integrin β1;D and E, representative EdU staining images (D) and statistical analysis of the EdU‐positive cells proportion (E) in HepG2 cells with co‐transfection of miR‐143‐3p mimics and pcDNA‐integrin β1; F and G, representative EdU staining images (F) and statistical analysis of the EdU‐positive cells propor‐tion (G) in Huh7 cells with co‐transfection of miR‐143‐3p mimics and pcDNA‐integrin β1. Scale bar, 50 μm; *P＜0.05 vs miR‐mimics+NC group; n=3

討 論

肝癌是一種致命的疾病，其發病率在全球范圍內呈較高的增長率[1,2]，但目前對肝癌的治療效果并不能令人滿意。因此，需要對肝癌的發生與進展機制進行更深入的研究。

已有大量數據表明miRNAs 是癌的關鍵調節因子，其可參與調控癌的發生、發展以及預后[5,6,14]。面對龐大的miRNAs 家族成員，人們目前對miRNAs調節癌細胞的分子機制仍所知甚少。miR‐143‐3p 作為重要的抑癌基因調節因子，其可抑制如結直腸癌、肺癌和胃癌等癌細胞的增殖、遷移與侵襲[7‐9]。但miR‐143‐3p 在肝癌中的具有作用以及相關機制并不清楚。我們的研究結果表明miR‐143‐3p 在肝癌中表達下調，且伴隨T 分期而降低表達，由此初步提示miR‐143‐3p 可能在肝癌進展中發揮作用。為證明這一觀點，本研究首先對比了正常肝細胞株和肝癌細胞株中的miR‐143‐3p 的表達，發現體外培養的肝癌細胞中miR‐143‐3p 表達下調；進一步通過基因轉染方式證明過表達miR‐143‐3p 可抑制肝癌細胞增殖、遷移與侵襲。結果表明miR‐143‐3p 在肝癌中可作為抑癌因子發揮作用。

我們進一步對miR‐143‐3p 在肝癌中的抑癌作用機制進行了探討。miRNAs是通過與靶基因的3’UTR區的堿基序列通過互補配對模式結合來調節基因表達，進而發揮生物學效應[15]。用生物信息學預測發現integrin β1 基因ITGB1PB1是miR‐143‐3p 潛在的靶基因。integrin β1 被發現在多種癌中表達上調，可直接促進癌細胞與基底膜黏附[12‐13]。另外，integrin β1與配體結合可激活的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）/EGF 信號促進癌細胞增殖[16]，也可通過黏附激酶（focal adhesion kinase,FAK）激活下游比如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases, MAPK）[17]、磷脂酰肌醇‐3‐ 激 酶（phosphatidylinositol‐3‐kinase, PI3K）[18]、信號轉導和轉錄激活因子（signal transduction and transcription activator, STAT）[19]等信號進而促進癌細胞的增殖、遷移與侵襲。在肝癌中也發現，integrin β1 表達上調，其和肝內轉移相關，且上調integrin β1能促進肝癌細胞增殖與遷移[10‐11]。本研究結果顯示integrin β1 在肝癌組織中表達上調，隨T 分期而增高，這與前人研究一致。另外，本研究顯示，miR‐143‐3p與integrin β1在肝癌中呈負相關，過表達miR‐143‐3p 能抑制integrin β1 表達，而過表達integrin β1能廢除miR‐143‐3p 對肝癌細胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用，這些結果說明miR‐143‐3p 是通過靶向integrin β1 進而發揮抑制肝癌細胞增殖、遷移與侵襲的作用。

綜上，本研究表明，miR‐143‐3p 是肝癌的抑癌因子，其可通過靶向integrin β1 抑制肝癌細胞增殖、遷移與侵襲。