口腔微生態的研究進展及益生菌在口腔護理中的應用研究

陳敏珊 鄭 娟 李 平

(廣州薇美姿實業有限公司，廣東 廣州 510665)

引言

人體口腔環境是由多種微生物集合形成的復雜的微生物系統，口腔中的微生物包括：細菌、真菌、原蟲、支原體、病毒等，口腔中的細菌種類超過700種?？谇晃⑸锿ㄟ^共生、競爭、拮抗等相互作用達到一個口腔微生態的平衡。只有微生物群落之間與微生物群落與宿主之間維持生態平衡才能保持口腔健康。當有外來微生物進入口腔或者口腔環境中固有的某些微生物在口腔中過量生長，逐漸成為優勢菌群，打破了口腔微生態的平衡，進而導致口腔疾病的發生。

在20世紀后期，尤其是在發達國家，主要采用口服抗生素的化學療法來治療細菌感染性疾病。但是長期服用抗生素不僅會破壞口腔生態平衡，同時也會加劇細菌耐藥性問題的嚴重性。

隨著關于益生菌方面研究的逐漸開展，研究者已經證實了益生菌可以用于防治腸道感染、泌尿系統感染等方面，同時這種防治疾病的方式也逐漸被應用到口腔醫學領域。益生菌療法不僅可以通過不同機制抑制致病菌的生長，同時還能維持正常的口腔微生態菌群，保障口腔健康。

1 口腔微生態的研究進展

微生態系是指在宿主一定結構的空間內，正常微生物群以宿主組織和細胞及其代謝產物為環境，在長期進化過程中形成的能獨立進行物質、能量及基因相互交流的統一的生物系統。人是由自己的細胞和微生物細胞組成的，人類與許多細菌保持著永久的和親密的關系。在人體內部的表面上寄居者數以萬計的細菌，這些寄住在人體各特殊部位或表面的生物群被稱為正常菌叢(normal flora)，或稱為固有菌叢。正常菌叢中的成員可稱之為常居菌或固有菌。迄今尚無關于人體內固有菌叢精確數量的報道，據保守估計，其總數多于人體細胞的總數，人體細胞數約為1013個，而人體內細菌數約為1014個。這些常居菌的大多數寄居在口腔、腸道中，口腔正常菌叢之間以及它們與宿主之間的相互作用成為口腔生態系(oral ecosystem)。許多正常菌叢和其宿主之間呈動力的平衡狀態(dynamic equilibrium)，這些共生微生物通過抵抗病原體而有助于宿主健康，維持體內平衡并調節免疫系統[1]。

1.1 口腔微生態的組成

口腔微生態作為微生態學的一個重要分支，主要由宿主固有口腔環境和口腔微生物構成?？谇皇且粋€復雜而完整的微生態系統?？谇还逃协h境主要包括口腔的物理化學特征，如口腔溫度、濕度、pH值等，以及口腔各部位的解剖形態及組織結構。定植于口腔的微生物主要包括細菌、真菌、螺旋體、支原體、病毒及原蟲等，這些微生物在口腔的不同部位共棲、競爭和拮抗，與口腔固有環境共同構成了口腔微生態系統，形成一種動態平衡關系。

1.1.1 固有口腔環境

1.1.1.1 物理化學特征

口腔環境的物理化學特征包括：口腔溫度、濕度、pH值、營養物質的代謝等?？谇粶囟燃s為37℃，口腔細菌大多屬嗜溫微生物，這為細菌的生長提供了適宜的溫度條件?？谇画h境潮濕，這可能是口腔微生物復雜的條件之一。大多數口腔細菌都生長在pH值為7的中性環境中，而口腔可提供一個相對恒定的中性pH值環境，這為口腔中細菌的定植生長提供了良好的基礎，但口腔與外環境相通，其pH值易受到外源性物質干擾而改變, 從而對口腔微生態產生影響。此外，營養物質代謝產酸，在某些口腔疾病的發生發展過程中也起重要作用。

1.1.1.2 口腔各部位的解剖形態及組織結構

口腔的特殊解剖形態及組織結構參與了口腔微生態的組成?？谇恢写嬖谥鞣N不同的表面，并且各有特征，如黏膜表面就有舌、牙齦上皮、齦溝上皮、頰上皮和腭上皮等幾種不同類型；硬組織有牙釉質、牙本質、牙骨質和用于修復的各種不同的材料等幾種不同的類型。由于結構不同，造成口腔不同部位的氧含量有很大差異，如舌背和頰黏膜主要為有氧環境，牙周袋內為乏氧環境，這導致了口腔不同部位菌群分布的差異。同時口腔分泌唾液，會影響口腔pH值，唾液中含有的酶和抗體等，也構成口腔微生態的一部分。這些部位的局部解剖、組織結構和表面化學對于細菌在口腔中的定植選擇起著很大的作用。

1.1.2 口腔微生物

美國國立衛生研究院(NIH)啟動了人類微生物組計劃(HMP)，以表征人類微生物組更完整并確定關聯微生物組變化與健康/疾病之間的關系?？谇晃⑸锸侨祟愇⑸锝M的重要組成部分之一，尤其是人類口腔中的微生物?？谇槐徽J為是人體中第二大復雜的微生物群，僅次于結腸[2]?？谇晃⑸锝M高度多樣化，研究發現，定植于口腔的微生物，主要以細菌為主，目前從口腔中分離和鑒定的細菌種類已經超過700多種(AaS，2005)，分屬11個不同的菌屬，是人體最復雜的微生物集群之一[3]。其中，大約有54%的菌株已經被培養和命名，有14%的菌株被培養但未命名，還有32%的菌株被稱為未培養的系統型(來自人類口腔微生物組數據庫)。越來越多的研究表明，口腔微生物群在許多口腔和全身性疾病的發病和發展中起著至關重要的作用。

Miller首次提出關于齲齒發生的“化學細菌學說”，他認為牙菌斑生物膜由微生物組成。根據發生部位與齦緣的關系，牙菌斑可分為齦上菌斑和齦下菌斑，齦上菌斑以革蘭陽性鏈球菌為優勢細菌，構成了牙齒平滑面的微生物群落。齦下菌斑以革蘭陰性厭氧菌為優勢菌，它們在牙周袋內形成群落并可導致牙周病[4]。

口腔微生態系的平衡和失調與口腔的健康和疾病密切相關[5]。一般正常菌群對機體也具有雙重作用，在一定環境中，當機體與正常菌叢之間保持著相互平衡的狀態時，正常菌叢顯示對宿主起著有益的作用；但當環境中的某些因素干擾了這個平衡狀態時，如放射線照射、過量激素的應用、抗生素的長期使用等而導致菌群失調，這就為正常菌群提供了顯示其有害作用的機會，這些原來無致病性的或毒力很弱的細菌，遂成為機會致病菌而引起內源性感染疾病，如長期服用抗生素所致的葡萄球菌假膜腸炎、口腔中的念珠菌病。

2 口腔微生態與疾病

2.1 齲齒

齲齒是最常見的口腔疾病之一，是導致口腔疼痛和牙齒脫落的主要原因。齲齒是由產酸細菌和可發酵碳水化合物之間的復雜相互作用引起的。通常情況下，大量碳水化合物的攝入會導致細菌產酸增加，唾液緩沖能力降低和低pH值的口腔環境。環境酸化是齲齒發展過程中微生物菌群表型和基因型變化的主要原因[6]。其中變形鏈球菌和乳桿菌經深入研究，被認為是齲齒中的特定病原體。然而，最近的研究表明，變形鏈球菌不僅在齲齒的早期以高水平存在，而且在一些健康的個體中也存在[7,8]。而且在一些患者中，變形鏈球菌和乳桿菌在一些齲齒樣本中含量低或不存在[9]。這些結果表明，齲齒病變的發生和發展不能完全歸因于這些微生物，齲齒是一種細菌性疾病，是由復雜的群落而不是單一的病原體引起的。Aas等報道了維永氏菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、丙酸桿菌屬、變形鏈球菌、放線菌屬和擬南芥屬在齲齒進展中也起著關鍵作用[10]。除產酸細菌外，某些細菌還可以從精氨酸和尿素中產生氨，從而提高pH值，從而影響口腔生物膜的pH穩態，并可能減緩齲齒的發生和發展[11]。

2.2 牙周疾病

牙齦炎是成年人中最常見和最普遍的牙周疾病，是由牙齦邊緣形成的細菌菌斑引起的可逆性炎癥疾病。如果不加以控制，牙齦炎將發展為牙周炎。牙周炎是一種慢性、不可逆的炎癥性疾病，在此過程中，免疫細胞的慢性浸潤導致結締組織破壞，血管增生和肺泡骨破壞[12]。微生物群落組成的變化導致宿主-微生物相互作用發生變化，從而引發破壞性炎癥和骨質流失。牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)，牙垢螺旋體(T. denticola)和連翹坦氏菌(T. forsythia)在歷史上被定義為“紅色復合物”，盡管這些細菌在健康個體中可能很少見，但它們被認為與牙周炎的發生和發展密切相關。

2.3 復發性口瘡性口炎

復發性口瘡性口炎(RAS)是最常見的口腔粘膜疾病，約占總人口的20%[13]。該疾病的特征是極度疼痛的復發性口腔潰瘍。越來越多的證據表明，RAS與粘膜和唾液微生物群的營養不良有關。 Marchini等[14]發現普雷沃氏菌僅存在于RAS患者的粘膜微生物群中，而不存在于健康受試者中。Seoudi等對黏膜微生物群的研究發現，與健康對照組相比，RAS患者中放線菌屬，尤其是羅思氏菌屬的水平更高[15]。

2.4 口腔腫瘤

越來越多的證據表明口腔微生物群可能在口腔腫瘤的發展中起作用?？谇击[狀細胞癌(OSCC)是口腔表皮的最常見的惡性腫瘤。 Nagy等用培養依賴性法檢查了同一患者的口腔腫瘤和健康粘膜表面，發現口腔腫瘤表面具有大量的需氧和厭氧菌[16]?？谇晃⑸锝M中的這些可觀察到的差異可能具有作為監測口腔腫瘤的發生、發展和復發的生物標志物的潛力?？谇晃⑸锶涸诳谇话┌l病機理中的作用尚不明確，專家們目前推測了幾種機制。首先，細菌可以引起慢性炎癥反應，在該過程中產生的慢性炎性介質引起或促進細胞增殖、誘變、致癌基因激活和血管生成；其次，細菌可能通過使用3型或4型分泌系統(T3SS / T4SS)分泌細菌效應蛋白而直接影響癌癥的發病機制，這可能會影響細胞增殖、細胞骨架重排、NF-KB的活化以及對細胞的抑制細胞凋亡；第三，細菌可能產生某些致癌物質，例如細菌將乙醇轉化為乙醛(一種公認的致癌物)。

3 口腔微生物群和系統疾病

3.1 糖尿病

糖尿病和牙周炎之間存在雙向關系。牙周炎被認為是糖尿病控制不力的并發癥之一。已有多項研究探索了糖尿病對口腔微生物群的影響。 Hintao等[17]報道指出，與非糖尿病受試者相比，糖尿病受試者的齦上菌斑具有較高的齒垢密螺旋體、尼古拉斯暴食桿菌、血鏈球菌、口頭鏈球菌和中間鏈球菌水平。在另一項研究中，糖尿病患者和非糖尿病患者的齦下微生物群存在顯著差異[18]。另外，牙周炎相關細菌增加了血糖控制的難度。牙齦卟啉單胞菌(一種主要的牙周炎病原體)產生的脂多糖(LPS)可以通過刺激某些炎癥細胞因子的產生來介導胰島素抵抗并損害胰島素活性[19]。

3.2 心血管疾病

微生物感染是心血管疾病的重要危險因素，與牙周病原體密切相關。 Koren等人的研究結果表明，動脈粥樣硬化斑塊中韋榮菌和鏈球菌的豐度與其在口腔中的豐度有關[20]。在動脈粥樣硬化斑塊中還檢出了一些口腔微生物，包括牙齦卟啉單胞菌、放線桿菌集合桿菌、連翹腸桿菌、核小腸彎曲桿菌和直彎曲菌[21,22]。近年來已經有專家提出了幾種可能的機制來解釋牙周炎和心血管疾病之間的關系。通常，宿主長時間接觸牙周病原體是主要原因。微生物通過口腔組織進入循環系統，并進入動脈分泌LPS和炎性介質，從而導致心血管并發癥，如血管內皮損傷、血小板聚集、平滑肌增殖和脂質沉積[23]。

3.3 遠處器官的腫瘤

口腔微生物也參與其他器官腫瘤的發生?？谇晃⑸镆鸬募毎蜃雍推渌仔越橘|的增加可能與癌癥發展的免疫相關機制有關。 Shiga等有報道稱，鏈球菌(S. anginosus)感染可能與頭頸部鱗狀細胞癌的發生和發展有關[24]。 Narikiyo等。用與培養無關的分子方法檢查了唾液，發現口腔牙周病螺旋體T. denticola，鏈霉菌和鏈球菌與食管癌有關[25]。此外，胰腺癌患者和健康對照者之間的長條狀奈瑟氏球菌和鏈霉菌比例明顯不同[26]。

4 口腔微生物群調節

考慮到口腔微生物在口腔和全身性疾病的病因和發病機制中的作用，其關鍵是改善口腔對病原體的保護并維持口腔微生態的動態平衡。研究微生物群落之間的相互作用是對抗口腔病原體的關鍵。如果在營養利用或環境管理中沒有粘附受體并且沒有合適的伴侶細菌進行代謝合作，則可能會排除掉潛在的病原體。另一方面，某些特定的微生物，例如牙齦卟啉單胞菌，被定義為關鍵病原體，可以改變環境，改變生態內其他微生物的比例。

4.1 機械清創術

當前的療法主要旨在通過機械方法減少病原微生物的數量。自行清除牙菌斑，例如刷牙，可以改善牙菌斑的控制水平。專業去除斑塊，包括洗牙、根部計劃和牙周手術，可以減少病原細菌的數量和比例，并重新建立口腔菌群的生態平衡。通常，在牙周治療后，與深度大于4mm的囊袋相關的微生物會降低到非常低的水平，甚至無法檢測到。機械清創后，牙周炎患者的牙周病原體，如牙齦卟啉單胞菌，連翹坦氏菌(T. forsythensis)，齒狀坦索菌和密螺旋體也明顯減少了[27]。但是，牙齒解剖結構的復雜性和手術區域的局限性為徹底清除牙菌斑帶來了挑戰和困難。機械手段是非特異性的，因此也可以去除有益細菌。更重要的是，機械清創后微生物豐富度和生物多樣性顯著降低，從某種意義上說，這對口腔健康是不利的。

4.2 抗生素使用

抗生素旨在針對動物和人類中的特定病原細菌。在牙科領域使用抗生素的適應癥是有限的，因為大多數口腔疾病可以通過手術干預和口腔衛生措施得到最佳控制。在牙科領域中，局部使用抗生素通常比全身使用更可取，因為它可以大大增加和持續增加溝液中的藥液濃度，并減少全身性不良副作用?？股爻１挥米鳈C械治療牙周炎的輔助手段，特別是在常規治療失敗和治療發病較快的疾病的情況下。但是，應該注意的是，牙科實踐中使用抗生素的特征是基于臨床和細菌流行病學因素的經驗處方，導致短期內僅使用非常窄范圍的廣譜抗生素，這種方法導致了多種微生物的抗藥性的發展，并導致了常用抗生素的無效。據報道，在使用阿莫西林的幼兒中，對阿莫西林耐藥的口腔細菌的數量明顯高于未使用阿莫西林的兒童。有效使用抗生素可能需要對患者口腔微生物組進行基因組分析，以鑒定目前的微生物并確定它們是否會對特定治療產生反應。

4.3 益生菌和益生元

為了克服這些傳統干預方法的局限性，目前已經有了新的口腔微生物群調節方案，例如益生菌和益生元。益生菌在促進健康方面是眾所周知的，并已得到廣泛研究。國際科學協會已將“益生菌”一詞定義為“當以適當量施用時，對宿主具有健康益處的活微生物”[28]。關于益生菌的作用機制，主要有以下幾種觀點：益生菌能夠分泌有機酸、過氧化氫和細菌素等多種抗菌物質，從而抑制致病菌的生長；它還能夠與致病菌競爭黏膜表面的結合位點，減少致病菌的定植；可通過調整pH值和氧化-還原反應電位，改變微生態環境，使之維持在適宜的范圍內；還有可能通過刺激非特異性的免疫反應和調節體液免疫與細胞免疫，來發揮其益生作用。通過實驗研究還發現，除鼠李糖乳桿菌外，唾液乳桿菌、雙歧桿菌、羅伊氏乳桿菌、動物雙歧桿菌、副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌已被證實能夠減少致齲菌的數量，從而預防齲齒。

越來越多的研究支持益生菌療法預防或治療牙齦炎和牙周炎。Krasse等有報道稱食用含羅伊氏乳桿菌的口香糖可以減少牙齦出血并減少牙齦炎；Iniesta等人進一步評估了羅伊氏乳桿菌。在患牙齦炎的情況下，發現齦下微生物群中的牙齦卟啉單胞菌數減少；對于牙周炎，羅伊氏乳桿菌可降低牙齦指數、牙菌斑指數、探查囊袋深度和臨床附著水平，并降低牙周病原體(A.放線菌，中間媒介和齒齦假單胞菌)的水平[29]。另外，干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、唾液乳桿菌和某些芽孢桿菌屬菌種也被評估為牙周病的益生菌。

益生元是不易消化的低聚糖，并已被證明可以輔助益生菌治療口腔疾病。益生元可以刺激有益細菌的生長和活性，同時抑制潛在有害細菌的生長和活性。它們還可以改善粘膜屏障功能、宿主免疫力并增強短鏈脂肪酸的產生。乳糖、菊粉、低聚果糖、半乳糖低聚糖和木糖均是腸道中廣泛使用的常見益生元，而口腔中使用的益生元的研究卻非常有限。糖和膳食纖維被認為是腸道乳酸菌的益生元，不適合口腔環境。一些潛在的口服益生元，如木糖醇和阿拉伯糖可以抑制變形鏈球菌的生長，但也被用于某些乳酸菌菌株的生長。鑒于缺乏一些完美的口服益生元，越來越多的研究試圖鑒定新的益生元。一些口腔微生物，例如加氏乳桿菌、唾液乳桿菌、發酵乳桿菌和雙歧桿菌在健康的口腔生態系統中更為流行。因此，被認為促進這些微生物生長的益生元方法也可以促進牙周健康。益生菌和益生元可能是預防和治療細菌性疾病的更好方法，因為它們可以在早期階段恢復生態平衡或恢復口腔微生物群的生物多樣性[30]。但是，重要的是要了解口服微生物組與益生菌之間的相互作用，以及口服益生菌的確切作用方式。此外，需要進行更多的研究來評估益生菌在口腔中的功效和安全性。

4.4 其他調節方式

除上述方法外，還有其他一些口腔微生物群調節方案的研究?；蚬こ坍a生的無毒變形鏈球菌已在體外進行了研究，并被認為可用于控制齲齒。在最近的研究中，Ren等人描述了一種靶向葡糖基轉移酶的化合物，葡糖轉移酶是變形鏈球菌的主要毒力因子，在體外和體內均可抑制生物膜的形成和變形鏈球菌的致齲性[29]。噬菌體是一種病毒，可以通過侵染細菌細胞，破壞其新陳代謝并引起裂解來特異性靶向并破壞引起疾病的細菌。目前已有研究提出使用噬菌體來控制產酸細菌，例如嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)，以抵抗齲齒的發展。此外，已經設計和開發了許多靶向治療系統來治療口腔疾病，例如纖維、條、薄膜和納米顆粒。結合這些新型藥物的治療方法，對口腔微生物群的調節將是非常有希望更有效地治療口腔疾病。

總體而言，口腔微生態作為人體微生態系統的一個重要組成部分，在維持人類健康方面起著至關重要的作用?？谇晃⑸锶旱母淖兛赡芘c口腔疾病和全身性疾病密切相關。目前對口腔微生態的研究還處在萌芽狀態，關于口腔微生物群在疾病發生和發展中的作用的研究還遠遠不夠。未來準確確定健康和疾病中關鍵口腔微生物群的研究將有助于更好地開發有效的口腔微生物群調節工具。雖然已經探索和開發了許多用于調節口腔微生物群的新興策略。即使這樣，仍需要進行更多的研究來評估這些方法的有效性和安全性。

5 益生菌在口腔護理中的應用研究

近年來，越來越多的研究發現，益生菌不僅可以調節腸道菌群，而且還能夠改善口腔菌群，從而在口腔健康的維護、口腔疾病的預防和治療方面都發揮積極的作用。1985 年，Ishihara 等發現，發酵乳桿菌、唾液乳桿菌等乳酸菌的胞外水溶性成分能夠在體外有效抑制口腔致病菌變異鏈球菌的生長[31]。隨后的研究證實，包括乳酸乳球菌、唾液鏈球菌、雙歧桿菌在內的多株乳酸菌都具有類似的口腔菌群調節功能。這些研究均為益生菌在口腔健康維護上發揮更重要作用提供了可能。目前研究已經證明，益生菌通過對致病菌的抑制可預防牙周炎、齲齒、口臭等多種疾病。

5.1 人體口腔益生菌篩選

5.1.1 口腔益生菌種類

目前，口腔中的益生菌主要有乳酸桿菌(Lactobacillus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)和腸球菌(Enterococcus)，其中雙歧桿菌為專性厭氧菌在口腔中的應用研究相對較少。乳酸桿菌多為兼性厭氧菌，適合在口腔中存活定植也是被研究得最多的益生菌種類，主要有植物乳桿菌(L. lantarum)、唾液桿菌(L. salivarius)、發酵乳桿菌(L. fermentum)、鼠李糖乳桿菌(L. rhamnosus)、嗜酸乳桿菌(L. acidophilus)、副干酪乳桿菌(L. paracasei)和羅伊氏乳桿菌(L. reuteri)。此外，屎腸球菌在口腔中也有相關研究。

5.1.2 口腔益生菌選擇條件

目前，國內外的益生菌制品種類繁多并形成了產業規模，尤其是日本和歐盟，在中國的發展也是日新月異。應用方面，在食品、保健品、藥品等領域已有多種益生菌制劑問世，其中在食物中的應用更為廣泛，利用益生菌防治口腔疾病的研究正逐漸成為國內外研究熱點。理想的口腔用益生菌需具備特定的性能，如圖1所示，根據這些特點可在眾多益生菌制劑中選擇適宜的益生菌，用于口腔護理產品研究開發。

圖1 理想口腔益生菌應具備特性

隨著對益生菌制劑的深入研究，科學家發現活菌制劑存在一些潛在的安全隱患，如：菌體突變，菌體可能因變異而產生一定的毒性;非正常部位轉移，菌體可能離開腸道、口腔等正常的定植部位，進入機體的其它部位進行繁殖(血液、胸腔等)，引起病變；抗藥性基因轉移，可能會增加致病菌杭藥性的危險。尤其對一些免疫力低下的病人而言，服用活茵制劑很容易引起病理反應。國際微生物學會聯合會(IUMS)通過臨床資料解釋和推斷，乳桿菌及其相關微生物依然存在一定的危險性，見表1[32]。與此同時，由于需要維持一定數量的活菌，活茵制劑的生產保存均較為困難，質量穩定性不高。為此，本文在后續的功效評價模型和產品開發中所采用的益生菌均為滅活的益生菌凍干粉。

表1 益生菌的安全性

5.2 益生菌對口腔致病菌生長抑制作用評價模型建立

益生菌的作用機制主要有①黏附機制：益生菌通過黏附占據口腔黏膜上的結合點，從而減少口腔致病菌在口腔環境中的定植；②聚集和生物膜的形成機制：益生菌通過自聚集、共聚集與形成生物膜從而抑制致病菌的生長、形成阻止致病菌定植和感染的屏障；③免疫調節機制：益生菌的產物及其菌體成分能夠激活免疫應答，當益生菌進入宿主中，宿主免疫系統的淋巴細胞和巨噬細胞等多種效應細胞被激活，使其釋放出多種細胞因子，從而提高機體自身等防御功能。

5.2.1 實驗材料

①滅活的益生菌凍干粉；

②口腔厭氧致病菌：牙齦卟啉單胞菌、變異鏈球菌以及具核梭桿菌。

5.2.2 口腔厭氧致病菌生長曲線的測定

①口腔厭氧致病菌活化：牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、變異鏈球菌-20℃菌種(10mL西林瓶)→4℃溶解(約30min可融化)→2mL一次性無菌注射器吸取少量菌液(幾滴)滴在BHIA平板， 37℃厭氧培養48h。

②吸光度測量：挑取平板上單菌落接種到10mL BHI試管中，37℃厭氧培養一定時間段，取樣，于紫外可見分光光度計600nm波長條件下測量吸光度；

③生長曲線繪制：以培養時間為橫軸，以對應吸光度值為縱軸繪制曲線。

5.2.3 益生菌對口腔致病菌生長抑制作用測定

①益生菌吸光度調整：益生菌液滅活后，取10mL菌液經4000rpm，15min離心分離收集菌體，用2mL PBS洗滌兩次后于10mL PBS中重懸；適當稀釋調整菌懸液吸光度A600為0.20～0.30范圍內。

②將已調整吸光度的益生菌液與處于對數生長期的致病菌液等量混合，分別在0h、2h、4h、6h、20h、24h，使用吸光度法測定致病菌的生長曲線，以△OD表示?！鱋D增長越慢，抑制作用越強。實驗以沒有添加益生菌的致病菌的為對照組。

5.2.4 益生菌A和益生菌B對口腔致病菌生長抑制作用

圖2 滅活益生菌對變異鏈球菌生長抑制作用

圖3 滅活益生菌對牙齦卟啉單胞菌生長抑制作用

從圖2及圖3可以看出，益生菌A和B對兩種致病菌的生長均有明顯抑制作用。

5.3 口腔益生菌對口腔致病菌凝集作用評價方法建立

5.3.1 實驗材料

①滅活益生菌；

②口腔厭氧致病菌：牙齦卟啉單胞菌、變異鏈球菌以及具核梭桿菌。

5.3.2 口腔厭氧致病菌生長曲線的測定

①口腔厭氧致病菌活化：牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、變異鏈球菌-20℃菌種(10mL西林瓶)→4℃溶解(約30min可融化)→2mL一次性無菌注射器吸取少量菌液(幾滴)滴在BHIA平板，37℃厭氧培養48h。

②吸光度測量：挑取平板上單菌落接種到10mL BHI試管中，37℃厭氧培養一定時間段，取樣，于紫外可見分光光度計600nm波長條件下測量吸光度；

③生長曲線繪制：以培養時間為橫軸，以對應吸光度值為縱軸繪制曲線。

5.3.3 益生菌對口腔致病菌凝集作用測定

①益生菌吸光度調整：益生菌液滅活后，取10mL菌液經4000rpm，15min離心分離收集菌體，用2mLPBS洗滌兩次后于10mLPBS中重懸；適當稀釋調整菌懸液吸光度A600為0.20～0.30范圍內。

②將已調整吸光度的益生菌液與處于平臺期的致病菌液等量混合，分別在4h和24h，使用吸光度法測定致病菌的上清液濁度變化，以△OD表示。

△OD為負值，表示細胞發生了聚集，△OD數值越小，表示共聚集作用越強。

益生菌存在自凝集作用，測定益生菌自凝集數據用于校正。實驗以沒有添加益生菌的致病菌的為對照組。

5.3.4 唾液乳桿菌A和B對口腔致病菌凝集作用

圖4 滅活益生菌對變異鏈球菌的共聚集作用

圖5 滅活益生菌對牙齦卟啉單胞菌的共聚集作用

選取滅活的益生菌A和B兩種益生菌，采用上述凝集作用測試方法，測試其與牙齦卟啉單胞菌以及變異鏈球菌的共聚集作用，結果如圖4、圖5所示。

從圖4、圖5看出，靜置4小時后致病菌上清液濁度增加，而添加益生菌的致病菌中，上清液濁度明顯下降，即發生了共聚集作用。靜置24小時后，致病菌上清液的濁度下降，而添加益生菌的致病菌上清液濁度下降程度更大。說明滅活益生菌對兩種致病菌均有較強的凝集作用。

5.4 益生菌牙膏抑菌作用評價方法

5.4.1 實驗材料

①菌種：牙齦卟啉單胞菌(ATCC 33277)和變異鏈球菌(ATCC25175)。

②培養基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)，胰蛋白胨大豆培養基(TSB)。

③儀器耗材：生物安全柜(HR-II-A2)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(LT-CPS38D)、微量移液器(NPX-1000、NPX-100)、漩渦混合器(XW-80A)、一次性塑料培養皿(9×1.5 cm)、恒溫培養箱(SPX-250B-Z)、牛津杯(10×8×6 mm)、玻璃試管(15×150 mm)、玻璃推棒等；

④益生菌牙膏(采用二氧化硅體系的牙膏配方制備的牙膏)。

5.4.2 菌懸液的準備

①將細菌接種在TSA斜面培養基上于37℃培養24 h，連續轉接2次；

②用1mL滅菌生理鹽水(0.85%)將上述斜面洗脫，裝于10mL滅菌離心管中，作為初始菌液(100)，4℃保藏備用。

③用微量移液器吸取菌懸液1mL于9mL無菌生理鹽水中，振蕩混勻，此稀釋倍數為1∶10。用移液器吸取10倍稀釋菌液1mL于9mL無菌生理鹽水中，此即100倍稀釋。其余以此類推，稀釋到10～12梯度；

④選取合適的梯度，按照《化妝品衛生規范(2007版)》分別進行細菌計數。

5.4.3 牛津杯的準備

①牛津杯若干個，置于100mL血清瓶中，于121℃，滅菌20min，烘干；

②使用前，將牛津杯置于玻璃皿中，加入少許無水乙醇，進行灼燒，冷卻，備用。

5.4.4 樣品的制備

①牙膏樣品按照牙膏∶水=1∶4的比例稀釋混勻。

②益生菌粉均配置成不同濃度的水溶液。

5.4.5 試驗菌接種及加樣

①將約15mL 50℃左右的TSA培養基倒入平皿中，冷卻；用微量移液器吸取0.1mL合適濃度(107～108 CFU/mL)的菌懸液于冷卻的平板中央，用無菌推棒小心涂布均勻，重復3次，蓋好皿蓋，置室溫干燥。

②用無菌鑷子取牛津杯放于平板表面，作好起點標記，逆時針放置4個牛津杯，各牛津杯中心之間相距25 mm以上，與平板的周緣相距15 mm 以上；在平板上用杜氏小管打孔，控制好中心距離。

③向每個牛津杯中加入200 μL制備好的樣品；向每個孔中滴加2～3滴樣品，使樣液表面與培養基表面平齊。

④小心移動上述平板，置37℃恒溫培養箱中，培養16～18h。

5.4.6 評價標準

用游標卡尺測量抑菌圈的直徑并記錄，抑菌圈直徑大于8mm判為有抑菌作用，直徑越大，抑菌效果越強。

5.5 益生菌定量檢測方法開發

5.5.1 實時熒光定量PCR操作流程

由于市場上益生菌制品的質量監管和認證，尤其實在定性、定量檢測和鑒定方面缺乏科學、合理、快速的方法，菌種濫用、魚目混珠的現象時有發生，嚴重影響產品質量。因此，開發一種快速高效的益生菌定性及定量檢測方法對產品質量保證具有重要意義。實時熒光定量PCR是在PCR定性技術上發展起來的核酸定量技術，可利用該技術對牙膏樣品中益生菌進行定性及定量分析，有效支撐產品功效及宣稱。具體操作流程如圖6所示。

圖6 熒光定量PCR操作流程

5.5.2 牙膏中益生菌含量檢測

牙膏產品一般由磨擦劑、保濕劑、膠黏劑、發泡劑、香料、調味劑、功效成分等組成，牙膏發泡劑目前廣泛使用的以陰離子表面活性劑月桂醇硫酸鈉為主，也有添加一些輔助表面活性劑如月桂醇肌氨酸鈉、CAB等。發泡劑的存在可能對牙膏中益生菌含量檢測造成一定干擾，分別對以下三組牙膏進行實時熒光定量PCR檢測，考察表活對定量結果影響，結果如下表2所示。

表2 Q-PCR檢測牙膏中益生菌C含量結果

從表2中可以看出，Q-PCR方法檢測益生菌數量與理論添加益生菌數差異無顯著差異，該方法可較準確實現益生菌定量檢測。牙膏體系中表活的存在對定量結果影響較小，在允許誤差范圍內。

6 討論及展望

當前，益生菌作為一種新的健康維護的概念引發越來越多的關注，益生菌對人類口腔健康的促進及調節作用也已逐漸被認知。采用益生菌調節口腔生態，制約口腔致病菌的生長，為各種口腔疾病的防治提供了一個新的思路，已成為非常有前景的生物干預手段。大量研究證實，大多數情況下益生菌對人體是安全的，其致病的可能性非常低。盡管如此，益生菌潛在的風險也不容忽視。為了保證益生菌的安全使用，仍需對益生菌的有效性和安全性進行長期深入研究。

本研究概述口腔的微生態研究進展，并對益生菌的典型功效模型進行了基礎研究。目前益生菌對口腔微生態的研究還處在萌芽狀態，雖然已經有一些新技術新方法開始應用于益生菌對口腔微生態的研究，但這些技術方法仍然存在許多不足，不能完全滿足對口腔微生態的研究。相信，隨著科學技術的進步，不久的將來將會有更多更好的技術方法應用于口腔微生態的研究。