近5年肺移植科及呼吸科患者細菌碳青霉烯酶分布及耐藥調查

李夢雪，李子堯，魯炳懷

（中日友好醫院 呼吸中心，中國醫學科學院呼吸病學研究所，國家呼吸醫學中心，北京 100029）

隨著臨床上抗菌藥物的大規模和不合理應用，耐藥菌株的分離率逐年增多，這對公共衛生造成了嚴重威脅[1]。近年來，革蘭陰性桿菌的耐藥問題日益嚴峻，耐碳青霉烯類腸桿菌目（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）受到廣泛關注[2]。然而，目前對CRE 在肺移植感染患者中的流行及其耐藥的調查較少。

本研究收集北京某醫院2017 年6 月—2021年5 月肺移植及呼吸病患者中分離的CRE 菌株，對其標本來源、碳青霉烯酶分布及其他抗生素敏感率進行分析，以期為臨床醫生提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

臨床分離菌株標本取自北京某醫院2017年6月—2021 年5 月肺移植科（簡稱LT 組）、呼吸科（簡稱nLT-nS 組）及重癥呼吸科（簡稱nLT-S 組）患者。本研究經中日友好醫院倫理委員會審批通過（審批號：2021-YKY-14）。參與者的書面知情同意書被豁免，相關受試者的隱私不受影響。

1.2 常規藥敏實驗

從標本中分離的亞胺培南或美羅培南耐藥（VITEK-2全自動分析鑒定儀檢測）的腸桿菌目細菌，依據保留同一患者第一株相同細菌的原則，剔除重復菌株后納入最終分析。同時使用紙片擴散法對納入菌株進行復核，確證納入菌株的表型。記錄VITEK-2 全自動分析檢定儀的藥物敏感性實驗結果。

1.3 碳青霉烯酶抑制試驗

碳青霉烯酶抑制試驗參照文獻[3]進行，并有一些修改。將待檢菌株調整至0.5標準麥氏濁度，使用棉簽涂布在MH 瓊脂平板上。將4 個含有IPM（10μg）（Becton Dickinson，美國）的紙片分別放置在該平板上后，立即將10μl 0.1M EDTA（索萊寶，中國）溶液加到IPM 紙片上，命名為R1。將10μl 30mg/ml 3-氨基苯硼酸溶液（APBA，索萊寶，中國）加到IPM紙片上，命名為R2。將10μl 0.1M EDTA溶液+10μl 30mg/ml APBA 溶液加到IPM 紙片上，命名為R1+R2。最后一個沒有添加任何內容命名為R0。將培養板在35°C下培養16～20h，并用游標卡尺測量區域直徑。R0 和R2 的直徑差>5mm，判定為產A類碳青霉烯酶；R0和R1的直徑差>5mm，則判定為產B類碳青霉烯酶。

1.4 多重實時熒光定量PCR 檢測碳青霉烯酶耐藥基因

碳青霉烯酶耐藥基因檢測參考文獻[4]。將每個引物與探針按適當比例混合，并添加適量的DNA 模板。將TaqMan? Fast Advanced Master Mix（ABI，美國）添加到反應體系中，使其終濃度為1X。然后用ddH2O 將反應體系稀釋至20μl。使用QuantStudio 5（ABI，美國）進行多重實時定量PCR。如果有代表相應基因的熒光信號被收集到，表示檢測到相應的碳青霉烯酶耐藥基因。檢測blaKPC，blaNDM，blaIMP，blaVIM及blaOXA-48基因。

1.5 質量控制

全自動微生物分析儀和藥敏紙片擴散法均按照美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）要求進行質量控制。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、陰溝腸桿菌 ATCC 700323、銅綠假單胞菌ATCC 27853，每周進行1次質控。

1.6 統計學分析

應用SPSS22.0 軟件進行統計學分析。對肺移植科及非肺移植科的計數資料數據，比較采用卡方檢驗及Fisher 精確概率法。P<0.05 被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 菌株分類與來源

本研究中LT 組共納入58 株CRE。菌株來源的患者中男49 例，女9 例；年齡17～72 歲，四分位數為53 歲，中位數為61.5 歲。標本類型以呼吸道標本為主，占77.59%（45/58），2 株菌株分離自尿液，1株菌分離自血液。詳見表1。

表1 CRE的標本來源 n（%）

nLT-nS 組納入69 株CRE。來源于呼吸科患者，其中男16 例，女53 例；年齡19～102 歲，四分位數為57歲，中位年齡為68歲。標本類型以呼吸道標本為主，占78.26%（54/69），另有11 例標本分離自尿液標本，其余分離于組織、胸水、膽汁及膿液共計4例。詳見表1。

nLT-S 組納入32 份CRE。來源于重癥呼吸科患者，其中男5 例，女27 例；年齡23～92 歲，四分位數為61.5 歲，中位數為65.5 歲。菌株主要分離自呼吸道樣本，占84.38%（27/32），另2 株分離于血液，其余樣本分離于胸水，組織及手術傷口各1株。詳見表1。

2.2 CRE細菌種類分布（圖1）

圖1 CRE的菌種分布

LT組分離的菌株中，以肺炎克雷伯菌最為多見，占72.41%（42/58），陰溝腸桿菌占10.34%（6/58），產氣克雷伯菌約6.90%（4/58）。

nLT-nS 組同樣以肺炎克雷伯菌最為多見，占86.96%（60/69），陰溝腸桿菌占5.80%（4/69）。

nLT-S組中，肺炎克雷伯菌最常見，占84.38%（27/32），陰溝腸桿菌占6.25%（2/32），大腸埃希菌、奇異變形桿菌及粘質沙雷菌僅分離1株。

2.3 碳青霉烯酶抑制試驗

本研究的3 組標本共159 株CRE 中全部檢出碳青霉烯酶，具體見表2。

表2 碳青霉烯酶分布情況

LT 組檢出單一絲氨酸酶40 株（68.97%），單一金屬酶16 株（27.59%），金屬酶和絲氨酸酶共存菌株2株（3.45%），且均為肺炎克雷伯菌。肺炎克雷伯菌中絲氨酸酶分布最廣泛（78.57%，33/42）。產氣克雷伯菌（75%，3/4）、布氏枸櫞酸桿菌（100%，2/2）與弗勞地枸櫞酸桿菌（1/1，100%）也主要產絲氨酸類碳青霉烯酶。

nLT-nS 組中，單產絲氨酸酶的菌株共60 株（86.96%），單產金屬酶菌株8株（11.59%），金屬酶和絲氨酸酶共產菌株僅1 株，且為肺炎克雷伯菌。肺炎克雷伯菌中絲氨酸酶分布最廣泛（91.67%，55/60）。產氣克雷伯菌（100.00%，2/2）、陰溝腸桿菌（50.00%，2/4）及粘質沙雷菌（50%，1/2）也主要產絲氨酸酶類碳青霉烯酶。

nLT-S組中，24株（75.00%）菌檢出絲氨酸酶，且均為肺炎克雷伯菌；另8 株菌（25.00%）均檢出金屬酶，且肺炎克雷伯菌及陰溝腸桿菌最多。無攜帶雙酶的菌檢出。

單一絲氨酸酶及金屬酶分布在LT 組與nLTnS組之間有統計學差異，絲氨酸酶在nLT-nS組的分布較廣泛（P<0.05），而金屬酶在LT 組檢出較多（P<0.05）。其他單酶及雙酶分布不具有統計學差異（P>0.05）。

2.4 碳青霉烯酶耐藥基因的鑒定

該159 株菌經多重實時熒光定量PCR 鑒定，均存在碳青霉烯酶基因。其中在上述表型鑒定為絲氨酸酶的菌株均攜帶blaKPC基因，表型鑒定為金屬酶的菌株均存在blaNDM基因。未檢出blaIMP，blaVIM及blaOXA-48基因。詳見表2。產β-內酰胺酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC）及新德里金屬-β-內酰胺酶（New Delhi Metallo-beta-lactamase，NDM）的碳青霉烯酶在LT 組與nLTnS組的分布具有統計學差異（P<0.05）。

2.5 其他藥敏分析

LT、nLT-S 與nLT-nS 組之間，其他抗生素的藥敏結果上沒有統計學差異（P>0.05）。各組中，單環β-內酰胺（氨曲南）的敏感率均較低，均低于10%；喹諾酮類抗生素（環丙沙星與左氧氟沙星）的敏感率更低，均低于5%。而氨基糖苷類抗生素（妥布霉素和阿米卡星）與復方新諾明藥物敏感率相對較高，均高于20%。詳見表3。

表3 各組標本檢測對其他抗生素耐藥的敏感率 n（%）

3 討論

3.1 CRE對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的機制

機制主要包括碳青霉烯酶的產生、膜孔蛋白的改變和外排泵活性的增加等[5～7]。其中，以碳青霉烯酶的產生最為常見。碳青霉烯酶主要分布在Ambler 分類系統中的A、B 和部分D 類酶中。A（KPC 為代表）和D 類酶（OXA-48 為代表）稱為絲氨酸酶（絲氨酸作為其活性位點）能水解大多數β-內酰胺藥物，但可被新型β-內酰胺酶抑制劑包括阿維巴坦、瑞來巴坦和維博巴坦所抑制[8～10]，而B 類酶（NDM 為代表）稱為金屬酶（金屬鋅作為其活性中心）可水解除氨曲南以外的大多數β-內酰胺類藥物，β-內酰胺酶抑制劑無效，但可被EDTA所抑制[8，11，12]。

3.2 CRE在肺移植患者中的流行情況

CRE已經成為威脅全球人類健康的重要病原體。實體器官移植是治療各種終末期器官疾病的公認療法[13]。革蘭陰性桿菌感染是引起移植后患者發病及死亡的主要原因[14]，器官移植后長期使用免疫抑制劑的患者更易感染CRE，且臨床預后不佳[15，16]。然而，目前對CRE 在肺移植患者的流行情況報道較少，對其耐藥機制更是知之甚少。本研究對中國某醫院肺移植患者及呼吸科患者分離到的CRE 進行了分析，探究其標本來源與碳青霉烯酶分布情況。

本研究中肺移植科菌株來源主要是呼吸道標本（77.59%），包括肺泡灌洗液、痰、氣管插管。這說明肺移植術后患者肺部容易感染細菌，這與以往報道的文獻相似[17，18]。在尿液和血液中也有部分病原菌分離，說明肺移植患者也可出現其他部位感染。在呼吸科患者中，痰標本中分離到致病菌的比率較高，說明非肺移植患者呼吸系統以外的感染比率相對較低。

與以往多數文獻報道相近，引起肺移植患者感染的CRE主要是肺炎克雷伯菌[17，19]。這可能與我國廣泛且大量使用抗菌藥物有密切關系，同時也可能與歐美地區同我國的菌種分布差異相關。來自于意大利的研究顯示，腸桿菌屬分離率最高，大腸埃希菌次之，然后是肺炎克雷伯菌[20]。移植術后患者易引起繼發性血流感染，這對患者來說非常危險，需引起臨床的重視[21，22]。本研究中肺移植科與呼吸科患者結果相近，均以肺炎克雷伯菌與陰溝腸桿菌的分離多見。

本研究中碳青霉烯酶在肺移植科及呼吸科患者中的分布差異具有統計學意義。呼吸科患者中KPC 占比高達86.96%，肺移植科僅為68.97%；金屬酶分別為11.59%和27.59%。但兩者均主要以KPC 分布為主，且集中在肺炎克雷伯菌中。這可能與產KPC 的肺炎克雷伯菌在我國廣泛傳播相關[23]。肺移植患者中，枸櫞酸桿菌屬主要產KPC，大腸埃希菌與陰溝腸桿菌主要產NDM，這與之前的報道一致[24]。產氣克雷伯菌也主要產KPC，這可能和產氣克雷伯菌與肺炎克雷伯菌的親緣關系較近相關[25]。頭孢他啶-阿維巴坦在臨床上是對抗CRE 非常有效的藥物，尤其是針對產KPC 的菌株，在肺移植患者的效果也很好[26]。但此藥物對產NDM 的菌株無效，由于其金屬酶的高分離率，因此肺移植患者分離出大腸埃希菌、陰溝腸桿菌等需慎重考慮用藥。同時本研究也發現了2 株共產KPC與NDM的菌株。

另外，我們還調查了肺移植和呼吸病患者對其他抗菌藥物的敏感率，發現對單環β-內酰胺（氨曲南）、喹諾酮類抗菌藥物（環丙沙星、左氧氟沙星）的藥物敏感率最低；對氨基糖苷類抗菌藥物（妥布霉素、阿米卡星）及復方新諾明的敏感率相對較高。藥物敏感率在3 組患者間無統計學差異，這可能和本研究樣本量較少相關。因此，氨基糖苷及復方新諾明也是合適的選擇，但尚未檢索到相關藥物敏感率的文獻。

綜上，本研究中呼吸道標本是分離菌株的主要來源，且均以產KPC 的肺炎克雷伯菌為主，NDM 集中分布在大腸埃希菌及陰溝腸桿菌中。肺移植患者中金屬酶分布較呼吸病患者高，差異具有統計學意義。因此，臨床對分離出陰溝腸桿菌的患者用藥更加慎重。