白念珠菌對氟康唑耐藥機制的研究

封小川 元航 鄭瑩瑩,3 白江苗 張欠欠

(1.延安大學醫學院,延安 716000;2.延安市人民醫院,延安 716000;3.延安大學附屬醫院,延安 716000)

近年來,世界范圍內以白念珠菌感染為主的侵襲性念珠菌病呈上升趨勢,全球SENTRY抗真菌監測顯示,在歐洲,白念珠菌引起的感染占念珠菌屬的52.5%、亞太地區為46.0%、拉丁美洲為43.9%、美國和加拿大為42.7%[1],我國流行病學調查顯示[2-3],白念珠菌引起的感染占念珠菌屬的65%,個別地區甚至大于70%,在免疫功能低下者和植入醫療設備的健康人中白念珠菌的感染率居首位,感染病死率高達68.9%[4],美國每年也會因置入導管引發的白念珠菌感染造成約10萬人死亡[5]。美國感染病學會(IDSA)指出氟康唑是既往非粒細胞缺乏念珠菌血癥患者初始治療及ICU中高?；颊咔忠u性念珠菌感染預防的首選藥物[6],在發展中國家,三唑類藥物(如氟康唑等)是治療侵襲性念珠菌感染尤其是白念珠菌感染的主要藥物[7]。但隨著氟康唑在臨床上的長期廣泛應用,致使白念珠菌對氟康唑的耐藥性不斷增強,據美國疾控中心(CDC)統計,在感染念珠菌患者的血液樣本中,約有7%對氟康唑耐藥[8]。全球SENTRY監測顯示[9],白念珠菌對氟康唑的耐藥率為11.9%,我國白念珠菌對氟康唑的耐藥率小于6%,劑量依賴性敏感(SDD)率為4.35%[10],這勢必給臨床治療白念珠菌引發的疾病過程中帶來嚴峻考驗。

文獻報道顯示[11-13],白念珠菌對氟康唑耐藥機制主要是靶酶編碼基因ERG11的突變和外排泵編碼基因過表達,但由于不同地區白念珠菌的感染及其耐藥不同,其耐藥機制亦不盡相同,因此,本文通過研究白念珠菌對氟康唑耐藥相關基因ERG11、CDR1、CDR2和MDR1的表達水平及其與耐藥的關系,探究延安地區白念珠菌對氟康唑的耐藥機制,對管理目前有限的抗真菌藥物,以及為患者提供精準治療服務至關重要。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 收集延安市兩家三甲醫院送檢并經鑒定為白念珠菌且對氟康唑耐藥和敏感的菌株各10株,耐藥菌株編號C1-C10,敏感菌株編號C11-C20。標準質控菌株：白念珠菌ATCC 90028。納入標準：①經質譜鑒定為白念珠菌;②根據美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)判斷標準[14],敏感(S)：MIC≤8 μg/mL,耐藥(R)：MIC≥64 μg/mL,藥敏結果復核為白念珠菌對氟康唑耐藥及敏感菌株;③所有操作均符合實驗室操作標準。

主要試劑和儀器 YeastOne plate真菌藥敏板試劑盒(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)(批號：280543)、Taq DNA聚合酶(北京百奧萊博科技有限公司)(批號：JN0015)、逆轉錄試劑盒(廣州賽國生物科技有限公司)(批號：70060000)、羅丹明 6G (西亞化學試劑商店)(批號：20211115)、VITEK MS全自動快速質譜微生物檢測系統(法國梅里埃公司)、ABI 7300 型全自動熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、Cytomics 500流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)、Nanodrop One 超微量分光光度計(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)、Tanon3500型凝膠成像分析系統(上海天能有限公司)。

1.2 方法

ERG11基因擴增并測序 白念珠菌DNA的提?。壕昱囵B、離心后,提取出白念珠菌DNA,與5 μL 樣品混合均勻后進行電泳約55 min,應用電腦成像系統進行凝膠相片拍攝。以GenBank公布的白念珠菌標準菌株ERG11基因序列數據為準,PCR引物設計：ERG11F：5’-ATGGCTATTGTTGAAACTGTCATTG-3’ (第1～25位) 、ERG11R：5’- TTAAAACATACAAGTTTCTCTTTTT-TCC-3’(第1560-1587位)。

羅丹明6G在試驗菌株中外排情況的測定 ①實驗菌株經離心、預冷,重懸于PBS使葡萄糖耗盡,加入羅丹明6G后將試管放于冰面上,然后在菌液中加入PBS混合均勻、離心,用流式細胞儀進行分析記錄,此時菌株的熒光強度設為外排前的起始熒光強度;②洗3次預冷PBS,將多余的羅丹明6G去除后分為兩管,一管50 μL菌液加入1 mL PBS,另一管50 μL菌液加入1 mL PBS,離心加入PBS混合均勻,運用流式細胞儀分析,將未用羅丹明6G處理的菌株細胞的熒光強度作為自身熒光對照;③將攝取羅丹明 6G 之后的細胞熒光強度作為基底,分別減去加與不加葡萄糖外排之后的細胞熒光強度,進行數據分析。

白念珠菌外排泵基因表達的檢測 白念珠菌外排泵基因引物序列見表1。

表1 白念珠菌外排泵基因引物

白念珠菌總RNA的提取 采用Trizol法提取白念珠菌總RNA,RT-PCR 擴增外排泵基因嚴格按照試劑盒說明書進行操作。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min, 94 ℃變性10 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,40個循環。收集熒光閾值(cycle threshold,Ct),將核糖體基因18S rRNA設定為內參基因,用相對定量△Ct表示(△Ct = Ct目的基因- Ct18S)并進行分析,其中△Ct值越小,相對基因表達量越高,反之則越低,見圖1及圖2。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 ERG11基因的檢測結果

實驗菌株ERG11基因 PCR擴增的產物經純化并測序,測序結果與 GenBank中的標準序列X13296進行比對分析,發現氟康唑耐藥的C3號菌株第414位堿基發生了突變G→A,但并未引起第118位氨基酸甘氨酸(Gly)密碼子的改變;氟康唑耐藥的C7號菌株及對氟康唑敏感的C12號菌株的第518位堿基發生了突變C→G,引起第173位氨基酸密碼子改變,致脯氨酸(Pro)變為精氨酸(Arg),見圖3～6及表2。

圖1 實驗菌株RT-PCR溶解曲線

表2 白念珠菌ERG11基因突變及對應氨基酸改變

2.2 羅丹明6G的外排情況

結果顯示,敏感株在攝取羅丹明6G后,未加葡萄糖幾乎不發生外排,加葡萄糖后略有外排,但二者比較差異無統計學意義(P>0.05);耐藥株在攝取羅丹明6G后,無論加葡萄糖與否均發生外排,加葡萄糖較未加葡萄糖的外排量增加,二者比較差異具有統計學意義(P<0.01);將耐藥組株對羅丹明6G的外排與敏感組菌株對羅丹明6G的外排量進行分析,耐藥組羅丹明6G的外排量明顯高于敏感組,差異具有統計學意義(P<0. 01),見表3和圖7。

圖3 白念珠菌ERG11基因擴增DNA凝膠電泳圖

表3 白念珠菌耐藥組與敏感組羅丹明6G外排實驗結果比較

2.3 RT-PCR測定外排泵基因表達水平

統計學分析顯示,耐藥組和敏感組肌動蛋白相關基因ACT1和質膜H+-ATP酶編碼基因PMA1的表達水平相比較,差異無統計學意義(P>0.05);耐藥組CDR1和CDR2外排泵基因表達量較敏感組顯著增高,差異有統計學意義(P<0. 01),見表4和圖8。

圖7 敏感和耐藥白念珠菌羅丹明6G外排實驗結果

表4 白念珠菌主動外排泵基因在敏感組與耐藥組相對表達水平的比較(△Ct值)

圖8 敏感和耐藥白念珠菌外排泵基因的表達量

3 討 論

全世界每年由念珠菌引起的深部器官感染病例40萬以上,病死率超過45%[15],尤其白念珠菌的發病率、致死率明顯上升。唑類藥物中的氟康唑是臨床早期經驗治療白念珠菌感染尤其作為高危人群預防白念珠菌感染的首選藥物,使其在人體內長期處于亞治療水平,引起耐藥性增加[16],白念珠菌耐藥是目前臨床治療其感染失敗的一個重要原因,研究報道,ERG11基因錯義突變可使氟康唑抗真菌的作用靶點去甲基化酶CYP51的血紅素表面結合位點發生變化,從而使氟康唑無法與白念珠菌有效結合而致耐藥[17],而且白念珠菌細胞膜上的外排泵活力增強也是白念珠菌對氟康唑耐藥的主要機制之一[18]。

本研究中靶酶編碼基因ERG11的目的基因擴增測序中雖然引起氨基酸的改變,即耐氟康唑的C7號菌株及對氟康唑敏感的C12號菌株的第518位堿基發生了突變,引起第173位氨基酸密碼子改變,致Pro變為Arg,但耐藥及敏感菌株中均存在,雖為錯義突變,但該突變沒有發生在ERG11點突變的105-165、266-287、405-488氨基酸之間的3個“熱點”區域[19],也不是既往文獻報道的Y123F、K143R、F449V和G464S等多個與白念珠菌對氟康唑耐藥有關的突變位點[20],推測這個位點的突變在白念珠菌對氟康唑耐藥機制中為無意義突變,但此也不能表明該機制在本地區白念珠菌耐藥性的產生中無作用,可能與樣本量較少有關,尚需擴大樣本量進行進一步研究。

羅丹明6G作為白念珠菌細胞膜上活性流出系統的底物,具有無毒、易檢測、易吸收入射光的能量等優點,準確測量白念珠菌中羅丹明6G的積累濃度值有利于選擇抗性菌株中CDR1、CDR2、MDR1等基因的過度表達。研究結果顯示,加入熒光染料羅丹明6G后,耐藥組羅丹明 6G的外排量明顯高于敏感組,說明白念珠菌對氟康唑耐藥為主動外排系統所致。為排除實驗環境(如菌株的生長環境和RNA的抽提等)對外排泵基因的檢測結果的影響,耐藥組和敏感組加入肌動蛋白相關基因ACT1和質膜H+-ATP酶編碼基因PMA1,比較其表達水平,差異無統計學意義(P>0.05),說明實驗環境對外排泵基因的檢測結果沒有影響。耐藥組CDR1和CDR2外排泵基因表達量較敏感組顯著增高,差異有統計學意義(P<0.01),由此可知影響本地區白念珠菌對氟康唑耐藥機制中最為重要的是其藥物外排泵基因CDR1、CDR2過度表達,并且耐藥組耐藥基因CDR1、CDR2相對表達量均顯著高于敏感株組,與文獻報道結果相似[21-22]。分析原因主要是,CDR1的表達受順式作用調控元件的控制,包括一個BEE(基礎表達元件)、一個DRE(藥物敏感元件)、兩個SRE(甾醇調控元件)和一個NRE(負調控元件),而CDR2的表達僅受DRE的控制,在這些不同的元件中,只有DRE參與必需的CDR1和CDR2的高表達和對氟康唑外排的上調相反,MDR1基因不具有DRE元件,并且MDR1啟動子也不直接與氟康唑反應[21]。

綜上所述,本地區白念珠菌的耐藥機制主要與外排泵基因過度表達相關,未發現靶酶編碼基因有意義的突變,由于白念珠菌對氟康唑耐藥現象的產生并非由于單一機制的調控,且臨床很多患者存在濫用抗真菌藥物的現象,導致白念珠菌對氟康唑的耐藥性不斷提高,而新型抗真菌藥開發緩慢,改善白念珠菌對氟康唑的耐藥問題迫在眉睫,因此,我們急需進一步探索白念珠菌致病機制和耐藥機制,尋找新的藥物治療靶點,探索新的治療體系,提高患者的生存率。