唑類耐藥煙曲霉在江蘇不同農田流行特點研究

劉晨 黃瑞 胡丹陽 周益花 陸敏 鄧淑文 史冬梅,3

(1.濟寧市第一人民醫院醫學真菌實驗室,濟寧 272000;2.蘇州高新區人民醫院,蘇州 215000;3.濟寧市第一人民醫院皮膚科,濟寧 272000)

煙曲霉(A.fumigatus)是一種廣泛分布的腐生性絲狀真菌,是機會性真菌感染的重要病原菌之一,其所致臨床疾病譜多樣,包括過敏、慢性感染及急性侵襲性曲霉病[1]。最近報道另一類高危人群,即病毒性肺炎患者易引起曲霉感染[2],如重癥COVID-19肺炎患者易于合并曲霉感染[3],并已經報道COVID-19相關的唑類耐藥曲霉感染加速肺炎的惡化[4]。侵襲性曲霉病危及生命,死亡率高達60%[5]。

唑類抗真菌藥是治療和預防曲霉感染的一線藥物選擇[6]。然而,全球范圍煙曲霉對唑類藥物耐藥不斷增加,部分國家的局部地區可達27.8%[7]。而唑類耐藥曲霉感染死亡率是唑類敏感曲霉感染患者死亡率的3～4倍[8]。因此,煙曲霉唑類耐藥已經成為曲霉感染治療的一個巨大挑戰。

目前研究認為[9]：煙曲霉唑類耐藥可在患者接受唑類治療過程中出現(患者途徑);而環境中唑類化合物的廣泛使用是煙曲霉唑類耐藥選擇的主要途徑(環境途徑)。在中國,唑類殺菌劑的使用量占所有殺菌劑的三分之一以上,國內已經有學者報道浙江、云南等地區農田環境中唑類耐藥煙曲霉的流行特點及與農藥的相關性[10-12]。本研究調查了江蘇省部分地區農田分離唑類耐藥煙曲霉流行特點,為煙曲霉感染的防治提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 農田土壤樣本的采集

2019年7—8月間,在江蘇省位于蘇北的高郵和泰州,蘇南的東山和同里古鎮的農田和溫室大棚采集了68份土壤標本,包括水稻、水果、草莓和蔬菜大棚田地的土壤,每個采集點采集深度包括表層下5 cm(表層土壤)和表層下20 cm(深層土壤)。

1.2 煙曲霉菌株的分離與鑒定

每份土壤標本取2 g土壤加入15 mL離心管,加入含1%吐溫20的無菌生理鹽水中,定容至10 mL后,取渦旋均勻后的菌懸液取100 μL接種含氯霉素(50 mg/L)的沙堡弱葡萄糖瓊脂(Sabouraud dextrose agar, SDA)上,在44 ℃培養箱中孵育24 h和48 h后挑取曲霉菌落,通過顯微和肉眼觀察并隨機選擇同一平板上5個具有煙曲霉形態的菌落進行進一步分離鑒定。如果一個平板上的曲霉菌落總數<5個,將它們全部分離鑒定。

每個挑取的曲霉菌落接種在沙堡弱葡萄糖瓊脂(SDA)培養基,于37 ℃培養3 d后,提取真菌基因組DNA(Omega Bio-Tek純化試劑盒)。菌種鑒定采用核糖體DNA內轉錄間區(ITS1- ITS4)基因擴增測序,獲得的序列與GenBank 數據庫(BLAST; http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對,鑒定到菌種水平。

1.3 唑類耐藥煙曲霉菌株篩選

參照美國臨床和實驗室標準化委員會(CLSI) M38-A3方案[13]進行藥物敏感實驗耐藥菌株的篩選?？拐婢幬锇ㄒ燎颠?itraconazole, ITR)、伏立康唑(voriconazole, VOR)、泊沙康唑(posaconazole, POS)均購自Sigma-Aldrich(美國)。所有待測菌株在SDA培養基37 ℃培養4～5 d,進行菌株活化,菌懸液最終接種濃度為(0.4～5)×104CFU/mL?？拐婢幍臐舛确秶鸀?.031～16 mg/L。培養板則在37 ℃下培養48 h讀取最低抑制濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。ATCC22019C.parapsilosis和ATCC MYA-3623A.fumigatus為質控菌株。依據2020年修訂CLSI M59標準[14],唑類耐藥煙曲霉菌株判定根據流行病學界值(ECV, epidemiology cuff-off value)：對伊曲康唑和伏立康唑,MIC >1 mg/L(ECV); 泊沙康唑, MIC >0.5 mg/L (ECV) 判定為非野生煙曲霉菌株, 即唑類耐藥煙曲霉菌株。

1.4 唑類耐藥煙曲霉菌株cyp51A基因測序

所有唑類耐藥煙曲霉菌株進行cyp51A基因及其啟動子的擴增測序?；蚪MDNA提取同菌種鑒定[15],引物參見前期文獻[16]。獲得序列采用ClustalW軟件,與煙曲霉敏感菌株AF338659基因序列比,鑒定煙曲霉在cyp51A基因區域的耐藥突變基因。

2 結 果

2.1 農田土壤標本中唑類耐藥煙曲霉菌株檢測

采集68份土壤標本分離培養,38份土壤標本曲霉培養陽性,分離106株曲霉菌株分子鑒定(ITS基因)為煙曲霉,其中,70株分離自表層土壤,36株分離自深層土壤。草莓田煙曲霉分離率最高(33株/106株,31%),且16株為RAF菌株(耐藥率48.5%);稻田次之(32株/106株,30%),8株RAF菌株(耐藥率25%),見表1。不同地方分離煙曲霉菌株分別為：高郵26株;泰州19株;蘇州東山33株;蘇州同里28株,見表2。

2.2 農田土壤分離唑類耐藥煙曲霉菌株特點

表2歸納了不同地方分離唑類耐藥煙曲霉菌株對三種唑類藥物耐藥率。表3總結了RAF菌株的環境分布,對三種唑類藥物的MIC值及cyp51A基因突變表型。

共分離34株唑類耐藥煙曲霉菌株(RAF),全部RAF菌株對伊曲康唑耐藥(MIC：2～16 mg/L);19個菌株對伏立康唑(VOR)耐藥(MIC：2～16 mg/L);16個菌株對泊沙康唑耐藥(MIC：0.5～16 mg/L);ITR+VOR 同時耐藥的4株;ITR+POS同時耐藥的1株;ITR+VOR +POS同時耐藥的15株,參見表2、3。所有34株RAF菌株進行cyp51A基因及啟動子區域擴增,序列分析顯示只有8株檢測到cyp51A基因及啟動子區域突變;其中,7株含有TR46/Y121F/T298A突變,1株為TR34/L98H/S297T/F495I突變,其余26株RAF菌株沒有檢測到任何cyp51A基因及啟動子區域突變。8株具有cyp51A基因突變表型菌株均表現為對檢測的三種唑類抗真菌藥同時耐藥。

表1 唑類耐藥煙曲霉菌株在不同農田的分布

(續表)

表2 不同地區分離唑類耐藥煙曲霉菌株對三種唑類藥物耐藥率

表3 唑類耐藥煙曲霉菌株環境分布,MIC值及cyp51A基因突變表型

(續表)

3 討 論

本研究調查了江蘇省蘇北和蘇南農田(蔬菜和草莓大棚、稻田和水果園)土壤環境,RAF分離率達32.08%(34/106),高于國內多數地區的報道,如浙江農業環境RAF分離率為2%[17],Chen等[10]調查了全國7個城市不同農田,RAF分離率為10%,Cao等[11]調查了中國東部6個省的稻田土壤,RAF分離率為10%。值得注意的是,Zhou等[12]調查了云南昆明9個蔬菜大棚,RAF分離率高達80%。我們的結果低于云南的報道。與國外報道比較,美國RAF的流行率約19%[18],荷蘭約30%[19],意大利約19%[20-21]。我們的結果(32.08%)高于多數世界各地區報道的環境唑類耐藥范圍。

本次調查江蘇不同農田唑類耐藥煙曲霉分離率發現,草莓大棚土壤RAF菌株分離率最高(15.09%),其次是稻田(7.54%),蔬菜大棚分離率最低(0～3.77%)。與Chen等調查結果相似[10],即全國7個城市不同農田中,草莓田RAF分離率最高(36.4%)。提示草莓田可能是江蘇地區RAF選擇的熱點環境。草莓從秋季插秧到冬季成熟基本在大棚里生長成熟。大棚內冬天也能保持很溫暖的溫度。在高溫如45 ℃大棚環境中的許多真菌已經不能存活或繁殖力降低,但煙曲霉可在50 ℃以上溫度生長良好,因此,大棚環境有利于煙曲霉生長。本研究稻田唑類耐藥煙曲霉分離率與Cao等[11]報道相近,而與云南昆明蔬菜大棚報道耐藥率高達80%相反[12],本研究蔬菜大棚分離率很低,可能因本次調查蔬菜大棚的標本數少有關,需進一步擴大樣本數研究證實。

我們調查發現表層下20 cm RAF分離率略高(39% / 26%),與Chen等[10]報道不同,即土壤表層RAF分離率高(表層 / 深層：13.6% / 3%)。這些差異有待進一步深入研究。

目前研究認為,唑類耐藥煙曲霉耐藥機制主要有兩類：一類是cyp51A基因相關的耐藥機制,另一類是非cyp51A基因相關耐藥機制,如外排轉運蛋白過度表達、靶蛋白的過表達[22]等。而cyp51A基因突變是煙曲霉最常見的耐藥機制[22],常見耐藥突變表型有TR46/Y121F/T289A, TR34/L98H和TR53[9]。我們的研究結果發現,34株RAF菌株中,僅有8株檢測到cyp51A基因突變,主要是TR46/Y121F/T289A突變表型(7株),TR34/L98H/S297T/F495I突變表型只有一株。有趣的是,這些cyp51A基因突變菌株都集中在高郵地區的草莓田,且都表現為對伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑同時交叉耐藥,且對伏立康唑高度耐藥(MIC=16 mg/L)。值得注意的是76%(26株/34株)的RAF菌株未檢出任何cyp51A基因突變表型,且53%(16株/26株)菌株只對伊曲康唑耐藥,7株對3個唑類(伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑)同時耐藥,4株對伊曲康唑和伏立康唑同時耐藥。說明江蘇地區唑類耐藥突變機制以非cyp51A基因突變為主,具有cyp51A基因突變表型菌株表現為多個唑類同時耐藥,多耐藥菌株在蘇北農田分離率高于蘇南地區(見表3)。

本研究雖未直接檢測土壤的唑類農藥殘留,但調查了采集點農田的農藥使用情況,如表3所示,唑類殺菌劑主要為三唑酮(triadimefon)、戊唑醇(tebuconazole)、苯醚甲環唑(difenoconazole)、丙環唑(propiconazole)、己唑醇(heaconazole)和氟硅唑(flusilazole),均為我國最常用的農業殺菌劑[12]。說明江蘇地區農田高RAF分離率及耐藥流行特點不能排除農業唑類殺菌劑使用的影響。

我們的研究發現,草莓田可能是江蘇地區RAF選擇的熱點環境。RAF分離率很高,耐藥機制以非cyp51A基因突變為主,cyp51A基因突變菌株主要為TR46/Y121F/T289A突變表型,具有cyp51A基因突變菌株均為唑類多重耐藥,且對伏立康唑高度耐藥。進一步深入研究熱點環境的特點及與唑類耐藥煙曲霉產生的機制,從而有效阻斷唑類耐藥煙曲霉產生途徑,提高曲霉感染的治愈率。