第二代生物乙醇制備研究進展

徐雪雯 李鵬輝 童國林

（南京林業大學，江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心，江蘇南京，210037）

早在1900年代初期，生物乙醇就已在歐洲和美國廣泛使用，并不是一種新能源，只是由于其生產成本比汽油高而被忽視。20世紀70年代，第一次世界石油危機爆發后，人們才開始關注生物乙醇的生產[1]。生物乙醇可以用作溶劑及化學工業中合成各種有機物的原料，如乙烯、聚乙烯、1,3-丁二烯和乙酸乙酯[2]。更重要的是，生物乙醇是一種可再生和可持續的液體燃料，具有的高氧含量特性使其燃燒更清潔，可降低有毒物質的排放量，并且生物乙醇是一種良好的內燃機燃料，可防止發動機爆震和過早點火，具有較高的抗爆值[3-6]。

生物乙醇可通過發酵從纖維素和半纖維素中提取的糖制得，根據制備原料不同，生物乙醇可分為以含糖類和含淀粉類的糧食作物為原料的第一代生物乙醇，木質纖維素類生物質以為原料的第二代生物乙醇和以水生藻類為主要原料的第三代和第四代生物乙醇。第一代生物乙醇生產技術成熟且具有較高的產率和產量[7]。第二代生物乙醇以木質纖維素類生物質為原料，其最大的優勢在于原料來源廣、產量大和不浪費人類食物資源，但木質纖維素乙醇被鑒定出29種雜質，含有高濃度的乙酸、乙醛、甲醇和呋喃相關化合物，而由糖或淀粉衍生物制備的第一代生物乙醇中只鑒定出16種雜質[8-11]。第三代、第四代生物乙醇以水生藻類為主要原料，如微藻和大型藻類，其中第四代生物乙醇使用的是具有高脂肪含量的轉基因藻類。該原料含有脂質、蛋白質、碳水化合物/多糖，并具有薄的纖維素壁，有利于制備生物乙醇，但藻類預處理成本相較木質纖維素類生物質更加昂貴[12-13]。

本文綜述了第二代生物乙醇制備過程中的原料優勢，預處理和2種水解方式的優缺點，最后指出了當前第二代生物乙醇研究中的難點，為制漿造紙中黑液高值化利用提供一定參考。

1 原 料

生物乙醇的缺點包括能量密度較低、腐蝕性較強、火焰光度較低、蒸氣壓較低（使冷啟動困難）、與水的混溶性較差等。生物乙醇生產的一個主要問題是生產原料的可用性[14]。

第一代生物乙醇以含糖類和含淀粉類2種糧食作物為原料。以糖為基礎的可食用原料包括甘蔗、甜菜和甜高粱；淀粉基原料主要包括小麥、玉米、大麥、木薯、土豆、紅薯及山藥[7]。其中，糖基類可食用原料可直接發酵制備生物乙醇，而淀粉基原料需水解為淀粉再發酵制備生物乙醇[8]，具體制備過程如圖1所示。

圖1 第一代生物乙醇制備過程[8]Fig.1 Preparation process of first-generation bioethanol[8]

從原料的可用性來看，以木質纖維素為原料的第二代生物乙醇具有巨大的潛力，但其制備成本是化石燃料的2倍，制備過程包括預處理、水解、發酵以及蒸餾[15]，具體過程如圖2所示。

圖2 第二代生物乙醇制備過程[15]Fig.2 Preparation process of second-generation bioethanol[15]

第三代生物乙醇的制備原料是藻類，可分為微藻類和大型藻類。大型藻類因多糖和蛋白質含量高，主要用于人類消費。微藻非常適合用于生產生物乙醇，主要是因為它們的碳水化合物和脂質含量高，且在生物或非生物脅迫條件下會急劇生長。利用藻類中的碳水化合物和脂質為原料需要先進行預處理，預處理的基本目標是使原料易于提取或用于細胞內化合物（如蛋白質、碳水化合物、脂質、寡糖、色素等）的化學轉化[12]。第三代生物乙醇的具體制備過程如圖3所示。

圖3 第三代生物乙醇制備過程[12]Fig.3 Preparation process of the third-generation bioethanol[12]

目前，最具發展潛力的主要是以木質纖維素類生物質為原料的第二代生物乙醇，為替代化石燃料的更清潔、低碳的生物燃料提供了機會。將第二代生物乙醇生產工藝與成熟的第一代生物乙醇生產設施相結合，利用協同效應，可以最大限度地集成工藝技術的優點、提高經濟和環境效益[16]。木質纖維素原料包括針葉木、闊葉木、木樹皮、鋸末及枯樹枝等。一些短周期木本品種，如楊樹、柳樹、云杉、松樹、桉樹和樺樹是典型的能源植物，據報道，其纖維素含量在31%～45%（以絕干質量計）之間[17]，具有很高的可發酵糖回收潛力。其他木質纖維生物質原料組分如表1所示。

表1 各種原料組分[18-20]Table 1 Components of various raw materials[18-20] %

2 預處理

以木質纖維素類生物質為原料制備生物乙醇的主要挑戰在于原料預處理。在生產第二代生物乙醇之前，對木質纖維素類生物質進行預處理至關重要。高效的預處理應適用于各種基材，使用廉價且易于回收的試劑，具有低能耗、低投資和維護成本等特點。

預處理過程會破壞與半纖維素結合的纖維素和木質素，降低纖維素的結晶度，增加最適合酶促攻擊的無定形纖維素的比例。纖維素是由D-吡喃式葡萄糖重復單元經過β-1,4-D-糖苷鍵連接成的線性高分子聚合物，是細胞壁的主要骨架，具有生物相容性和親水性等特性。纖維素分子鏈為線性結構，結構規整，無大側鏈，同時分子鏈上富含易形成氫鍵的羥基，因此纖維素分子易結晶。纖維素不易受酸或高溫處理的影響，但可以用酶水解[21]。半纖維素是植物細胞壁中與纖維素緊密結合的一類雜多糖的總稱，也是自然界中含量僅次于纖維素的第二大類多糖。半纖維素對高溫和酸處理高度敏感，主要是因為其具有無定形、不穩定結構，鏈長較短，支化度較高，易化學水解[22]。半纖維素在高達190 ℃的溫度下自水解，轉化為可溶性低聚木糖；在90～130 ℃的溫度下進行稀硫酸處理，幾乎可以完全水解得到戊糖。

和其他木質纖維素生物質一樣，使用纖維素酶和半纖維素酶直接水解，易受到木質纖維素的復雜結構和結晶度的限制。因此，為了將半纖維素和纖維素完全轉化為單糖，需要物理、化學及酶水解預處理[23]。預處理作用在于破壞纖維素結晶區和木質素3D結構，最大程度減少糖損失，提高酶轉化率，降低對酶或微生物的抑制[24]。

木質纖維素類生物質可以通過切片、研磨、剪切或碾磨進行粉碎，減小顆粒尺寸并增加比表面積，有利于纖維素酶作用于生物質表面并增加纖維素的轉化率。通過機械研磨、粉碎等物理方法可以顯著降低粒徑和結晶度，有利于后續水解發酵，但機械研磨所需的能耗與研磨后原料粒徑緊密相關，需要相對高的能量輸入來實現高的酶水解速率和可發酵糖產量。其他有用的物理處理方法包括熱解、γ射線輻照、微波、紅外線或超聲處理[25-26]。Thangavelu等人[25]對木質纖維素類生物質進行低微波功率預處理后，還原糖濃度相比未經微波預處理的常規水解高30%，利用釀酒酵母將可發酵糖轉化為生物乙醇，產率達40.4%。低微波功率預處理不僅有利于生物乙醇的制備，在能耗消耗方面也具有一定的優勢。Liu等人[26]在比較γ射線輻照預處理與其他預處理方法對以微晶纖維素為原料制備生物乙醇的影響時，為了檢驗γ射線輻照的有效性，在實驗中采用891 kGy的輻照劑量，對通過同步糖化發酵制備的生物乙醇進行處理。結果表明，相比于酸預處理，γ輻照預處理具有更高的生物乙醇轉化效率。雖然微波、γ輻射等輔助預處理方式在制備生物乙醇方面更有效，但是其安裝成本高，不利于工業化應用。

在典型的聯合預處理過程中，第1步一般采用合適的酸、堿及蒸氣爆破預處理方式，脫去生物質中半纖維素部分；第2步采用稀酸、稀堿及有機溶劑預處理，有效去除生物質中木質素部分[27]。物理化學方法比單純的物理方法更有效[28]。稀酸和濃酸都被證實能夠對高度復雜的木質纖維素原料進行預處理，但濃酸預處理有毒，且具有腐蝕性，需要昂貴的耐腐蝕設備。稀酸預處理因低成本、高活性和易獲取等優點，被廣泛使用。Wang等人[29]采用質量分數2.2%的稀硫酸處理玉米芯，達到了97%的總葡萄糖回收率和75%的木糖回收率，實現了高效的糖轉化。王慧等人[30]對玉米秸稈分別采用熱水和堿2種方式預處理，堿預處理后玉米秸稈的細小纖維含量增加，并且隨細小纖維含量增加，纖維素酶解效率提高。O3、H2O2試劑處理木質纖維素類生物質，其機理與制漿過程中氧脫木質素機理類似，O3、H2O2、ClO2等在氧化脫木質素過程中釋放的大量自由基可以降低原料中木質素的含量，但是與酸、堿等預處理相比，成本有所增加[31]。有機溶劑預處理是從木質纖維素材料中分離纖維素和木質素的一種十分具有吸引力的方法，主要采用的有機溶劑包括乙醇、甲醇、乙酸、甲酸、丙酮、甘油或苯酚，其中低沸點的醇類有機溶劑，因其沸點與水的沸點相差較大而易回收，獲得了更為廣泛的關注；高沸點的有機溶劑雖然在葡萄糖回收率等方面具有優勢，但其高度揮發性及易燃性使操作風險性和工業應用成本升高[28]。

用于生物質糖化前的預處理包括氨纖維爆破（AFEX）、自水解（蒸汽爆破）、SO2蒸汽爆破、酸處理和堿處理[32]。在蒸汽爆破中，生物質被高壓飽和蒸汽快速加熱一段時間后又迅速釋放壓力，導致蒸汽在木質纖維素基質內膨脹，從而破壞細胞壁結構的單個纖維。添加SO2催化劑可以減少原料預處理時間，降低處理溫度，更有效地去除半纖維素，有利于生物乙醇的轉化。AFEX是一種堿性熱預處理，是適用于農業殘余物的預處理方式，缺點是對含有較高木質素含量的生物質處理效率低[33]。Rochón等人[34]以桉樹木屑為原料，采用無堿蒸汽爆破預處理，當反應溫度200 ℃、處理時間10 min時，從半纖維素水解產物中可獲得83%的木糖和17%的低聚木糖，實現了無堿蒸氣爆破預處理下高效的糖轉化。

生物預處理在以木質纖維生物質原料作為基質供真菌生長的同時，通過真菌分泌的生物酶定向降解木質纖維中的木質素。盡管生物預處理相比于物理法能耗低，相比于化學法不需要化學品且反應條件溫和，但是需要很長的處理時間才能達到較高的酶解率[35]。

3 水解及發酵

纖維素水解也稱糖化，是將纖維素轉化為葡萄糖的過程。水解主要有2類：酸水解和酶水解。酸水解的工藝技術成熟但對設備腐蝕強，回收和廢水處理困難，對環境不友好，糖轉化率低[36]。酶水解選擇性好，反應條件溫和，對環境設備友好，但是在酶活性、重復利用率及成本方面有很大的發展空間。酶水解的效率不僅取決于預處理條件和生物質中木質素的存在，還取決于纖維素原纖維包裹在木質素鞘中的方式。雖然葡萄糖和乙醇的產量隨著纖維素含量的增加而增加，但它不是影響葡萄糖和乙醇產量的唯一因素，當生物質的木質素含量在7%～9%時，葡萄糖和乙醇的產率會顯著降低，導致乙醇產率降低[37]。酶解的作用過程主要包括纖維素酶吸附在纖維素表面、纖維素水解及纖維素酶解吸[38-39]。影響水解的主要因素是底物抑制劑木質素及生物質孔隙率，堿預處理比其他預處理能更顯著增加生物質孔隙率[40]。高結晶度會阻礙纖維素的酶促分解，使分子鏈更有序，纖維內部的孔減少。因此，半纖維素和木質素的去除有利于提高基底酶的可及性，主要是因為孔徑和基底比表面積的增加。

酶水解是從木質纖維素底物生產乙醇的成本效益的關鍵，因其過程溫和，具有潛在的高產率，并且與酸或堿水解相比，維護成本較低[41]。該過程與許多預處理方法兼容，但在酶水解之前進行化學預處理時，需要去除對酶有毒的物質。影響酶促糖化過程的因素包括底物濃度、酶負荷、溫度和糖化時間[42]。纖維素酶常用于第二代生物乙醇制備過程中的木質纖維素殘基水解，然而纖維素酶對預處理后的木質纖維素的活性依舊很低。為攻克這一難題，研究人員探索了纖維單胞菌屬、芽孢桿菌屬和微球菌屬在不同的pH值（5～9）和溫度（20～50 ℃）下對椰殼纖維的內切葡聚糖酶活性。結果表明，纖維單胞菌在pH值中性和40 ℃條件下表現出最高活性[43]。此外，纖維素酶占據生物乙醇制備成本的絕大部分。為了降低制備成本，Baskaran等人[44]以里氏木酶菌NCIM 1186作用于石榴皮制備纖維素酶，在最佳培養基和工藝條件下，纖維素酶的最大產量為12.3 IU/mL，實現了以廢制纖維素酶，降低了生產成本。纖維素酶與木質素的非生產性結合，可能會在高底物負載下增加，特別是隨著水解的進行和纖維素量的減少。Rosgaard等人[45]采用了“分批補料”方式，酶解預處理后的大麥秸稈，逐漸加載底物或底物加酶以將底物水平從5%提高到15%，實現高底物濃度的水解，得到高濃度葡萄糖。

在發酵方面，工業上主要使用的是釀酒酵母和運動發酵單細胞菌[46]。根據菌株的不同，發酵酵母發育的最佳溫度通常在25～35 ℃。酵母發酵對象一般為六碳糖，但是經過培養和篩選得到的釀酒酵母IPE005可以同時發酵葡萄糖和木糖。例如樹干畢赤酵母可天然發酵木糖產生乙醇，主要的缺點是生產過程中會產生乙酸、糠醛等副產物。五碳糖糖化發酵制備生物乙醇是限制木質纖維素原料使用的主要因素之一。Aybüke等人[47]首次報道了以含有大量五碳糖的蘋果渣為原料制備生物乙醇的研究方法，優化了一些關鍵參數，如生物質負載、補充劑（氮和礦物質源）和酶水解對生物乙醇生產的影響，乙醇理論產率為84.1%。在10%蘋果渣負載下，樹干畢赤酵母可生產14.36 g/L的生物乙醇。高效的葡萄糖/木糖共發酵能夠完全利用木質纖維素生物質中的所有可用糖，從而提高木質纖維素生物質精煉廠的總轉化率。Wu等人[48]將釀酒酵母與樹干葡萄球菌共培養，從富含戊糖和己糖的木質纖維素水解物中高效制備生物乙醇，具有95.97%的高糖轉化率及0.39 g/g的乙醇產量。Bisht等人[49]研究了一種突變酵母Pichia kudriavzevii BGY1-γm，與天然菌株相比，其在葡萄糖/木糖共發酵過程中具有高ADH活性，能夠高效地生產乙醇。

為提高生物乙醇生產的效率，研究人員已經提出了不同的整合水解和發酵的方法，包括單獨水解和發酵（SHF）、同步糖化發酵（SSF）及同步糖化共發酵（SSCF）[50-52]。SHF有2個階段，水解和發酵過程分開進行，即預處理的木質纖維素生物質首先通過酶降解成葡萄糖和木糖，然后發酵成乙醇。其優勢在于酶水解和發酵都在各自的最佳條件下發揮作用，而抑制酶活性的糖的積累仍然是最終影響乙醇產量的主要因素[53]。SSF將生物質的糖化與在單個反應器中同時發酵釋放的糖相結合。該過程的關鍵特征是糖從生物質中形成后，會迅速轉化為乙醇，從而減少培養基中抑制性糖的積累。與SHF工藝相比，其操作方便、設備要求低，培養基不易受到污染，效率更高[54]。該工藝的主要缺點是難以同時考慮酶和微生物來優化工藝參數。SSCF可以將木質纖維素預處理和水解過程中釋放的所有己糖和戊糖（主要是葡萄糖和木糖）共同發酵。SSCF的酶水解與發酵同時發生，與單獨的水解和共發酵（SHF）相比，投資成本低，且能實現更高的乙醇生產率[55-56]。

近年來，有許多關于第二代生物乙醇制備的研究，由于原料的選取不同，后續的預處理及水解發酵參數都不盡相同。White等人[57]以麥芽汁提取后剩余的殘渣酒糟（SG）為原料，開發了稀酸和酶處理以將半纖維素和纖維素部分轉化為葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，具體流程如圖4所示。在用纖維素酶和半纖維素酶制劑進行酶消化之前，溶解谷物最優工藝是用0.16 mol/L HNO3在121 ℃下預處理干燥的碾磨谷物15 min。對20%的SG制備水解物，用0.16 mol/L HNO3預處理，部分中和至pH值=5～6，并用酶消化18 h，得到還原糖濃度為66.6 g/L（27.4 g/L葡萄糖、16.7 g/L木糖和11.9 g/L阿拉伯糖）。用畢赤酵母和馬氏克魯維酵母發酵該水解物48 h，分別得到8.3和5.9 g/L乙醇。然而與合成培養基中的葡萄糖/木糖混合物相比，底物利用效率較低，表明水解產物中存在來自SG的酵母抑制化合物。Phuong等人[7]以稻草為原料，采用Na2S輔助堿法蒸煮，利用響應面法確定了制漿的最佳工藝參數為活性堿用量7%、溫度100 ℃、時間120 min，獲得了51.8%的最大糖產率。表明采用Na2S輔助的堿法蒸煮預處理可使糖化效率達91.2%，以最大限度地酶解實現可持續生物乙醇的生產。具體工藝流程如圖5所示。

圖4 以麥芽酒SG為原料制備生物乙醇流程[57]Fig.4 Preparation process of bioethanol with malt liquor SG as raw material[57]

圖5 以稻草為原料制備生物乙醇流程[7]Fig.5 Preparation process of bioethanol from rice straw[7]

Ren等人[8]開發了一種受控的亞硫酸氫鎂預處理（MBSP），實現生物乙醇生產、木糖-寡糖（XOS）和木質素磺酸鎂（ML）制備同時進行，在預處理程度（PS）為3.66，170 ℃下處理40 min后，從1 kg小麥秸稈中獲得了約136 g生物乙醇、98 g XOS和133 g ML，葡聚糖含量約70.8%，酶解率超過90%。受控的MBSP是小麥秸稈生物精煉的潛在經濟盈利預處理工藝。Qiu等人[9]對小麥秸稈進行磷酸加過氧化氫（PHP）預處理，在高負荷下通過同步糖化發酵進行乙醇轉化。結果表明，經過PHP預處理的小麥秸稈的固載率可大幅提升至20%，增加酵母添加量可促進乙醇轉化，但反應并不明顯，利用響應面法優化同步糖化發酵條件后，在固體負載為15.3%的情況下，同步糖化發酵處理120 h后，乙醇轉化率為88.2%，100 g小麥秸稈可收獲15.5 g乙醇。具體過程如圖6所示。

圖6 PHP預處理小麥秸稈制備生物乙醇流程[9]Fig.6 Preparation process of bioethanol from wheat straw with PHP pretreatment[9]

Ajayo等人[10]以紙桑木為原料，在溫度34.7 ℃，71.3% H3PO4和4.84% H2O2條件下優化處理3.3 h，脫木質素效率達97%，半纖維素去除率達100%，獲得了493 mg/g原木的高葡萄糖產量。Prajapati等人[11]利用甘蔗渣（SCB）為原料，用由管狀曲霉NKBP-55產生的纖維素酶和半纖維素酶混合物進行酶處理。SCB水解產物通過葡萄糖和木糖發酵酵母Candida shehataeNCIM 3501發酵成乙醇，得到最大乙醇濃度為15.54 g/L，發酵效率為77.9%。結果表明，A.tubingensis酶混合物可使SCB有效水解并轉化成生物乙醇。

得到可使用的生物乙醇前還需經純化處理，常采用的方法有化學脫水、真空蒸餾、共沸蒸餾、萃取蒸餾、膜分離、分子篩吸附及擴散蒸餾等[58-59]。

4 結語與展望

第一代生物乙醇制備工藝已十分成熟，基于此，第二代生物乙醇的制備還需加強預處理方面的研究，以及就如何利用半纖維素五碳糖仍需進一步培育新型酵母，或組合酵母對五碳糖、六碳糖共同發酵。雖然第三代生物乙醇的制備已有不少研究，并且具有不占用耕地和吸收空氣中CO2，減少對環境污染的優勢，但藻類預處理成本昂貴，對此還需時間去進一步挖掘與改良。目前來說，第二代生物乙醇的預處理方法及發酵過程中酵母的培育與選擇仍是當前的研究熱點。

制漿造紙過程中產生的黑液中含有部分纖維素和半纖維素，若能夠對其進行糖化發酵制備生物乙醇，無疑是開拓了黑液高值化利用的一個全新領域。此前關于黑液中纖維素與半纖維素制備生物乙醇的研究僅限于亞硫酸鹽法制漿黑液，因其他方法產生的黑液至今未能有合適的酵母菌去處理，今后若能在該難點取得突破，制漿造紙行業便能實現質的飛躍。