ApoD對多巴胺能神經元Basigin表達影響

欒夢瑤 閻春玲 姜宏

［摘要］ 目的

探究載脂蛋白D（Apo D）對多巴胺能神經元Basigin（BSG）蛋白表達的影響。

方法 小鼠側腦室埋入不銹鋼管套，并給予外源性Apo D處理。培養鼠多巴胺能神經元細胞MES23.5細胞，并給予外源性Apo D處理。采用Western Blotting方法分別檢測小鼠黑質區和MES23.5細胞中BSG蛋白表達變化。

結果 與對照組相比，給予外源性Apo D組黑質區神經元和MES23.5細胞的BSG蛋白表達水平均明顯上升（t=2.299、3.408，P<0.05）。

結論 外源性Apo D能夠促進多巴胺能神經元BSG蛋白表達。

［關鍵詞］ 載脂蛋白D類；Basigin；多巴胺能神經元

［中圖分類號］ R338.2

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）06-0832-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.100

［網絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230807.0914.001;2023-08-07 16：33：58

EFFECT OF APOLIPOPROTEIN D ON THE PROTEIN EXPRESSION OF BASIGIN IN DOPAMINERGIC NEURONS

LUAN Mengyao， YAN Chunling， JIANG Hong

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of apolipoprotein D （Apo D） on the protein expression of Basigin （BSG） in dopaminergic neurons.

MethodsStainless steel tubes were placed in the lateral ventricle of mice， followed by the treatment with exogenous Apo D. Mouse dopaminergic neurons MES23.5 cells were cultured and treated with exogenous Apo D. Western Blotting was used to measure the change in the protein expression of BSG in the substantia nigra and MES23.5 cells.

Results

Compared with the control group， the exogenous Apo D group had a significant increase in the protein expression level of BSG in both neurons in the substantia nigra and MES23.5 cells （t=2.299，3.408;P<0.05）.

ConclusionExogenous Apo D can promote the protein expression of BSG in dopaminergic neurons.

［KEY WORDS］apolipoproteins D; Basigin; dopaminergic neuron

載脂蛋白D（Apo D）于1963年被首次發現，是人類血漿脂蛋白系統的一個獨立成分，屬于脂肪鈣超家族［1］。在人體內多種器官和組織中均檢測到Apo D的表達，其廣泛表達表明Apo D在體內具有重要作用［2］。在多種神經退行性疾病中發現大腦及腦脊液中Apo D的表達升高［3-4］。在帕金森病病人中，表達升高的Apo D可能是作為一種抗氧化保護劑來應對多巴胺能神經元損傷［4］。在體外模擬阿爾茲海默病和帕金森病的情況下Apo D也能夠保護細胞［5］。但Apo D對神經細胞的保護作用具體機制仍不明確。Basigin （BSG）是免疫球蛋白超家族的成員，在體內介導多種物質的識別和轉運［6］。在中樞神經系統，BSG高表達于腦毛細血管內皮細胞和大腦的各個亞區［7］。在多種神經退行性疾病中BSG的表達升高［8-9］。2015年有研究發現，BSG能夠作為Apo D內化的受體，并影響著Apo D的神經保護作用［10］。但Apo D和BSG的相互作用仍有待進一步研究。本研究旨在探討外源性Apo D對多巴胺能神經元BSG蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康雄性 C57BL/6小鼠 40 只，10～12 周齡，體質量（26±2）g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供。小鼠置于安靜環境下飼養，飼養條件：室溫（19±2）℃，12 h-12 h晝夜循環光照，可自由飲水、取食。MES23.5細胞系是由小鼠神經母細胞瘤細胞系N18TG2及大鼠胚胎中腦細胞融合而成的多巴胺能神經母細胞瘤細胞。DMEM-F12（1∶1）培養液購于美國Hyclone公司，胎牛血清（FBS）購于以色列Biological Industries公司，青鏈霉素混合液購于北京索萊寶公司，多聚賴氨酸購于德國Sigma公司，β-Tublin抗體購于美國CST公司，BSG抗體及羊抗兔IgG-HRP購于上海愛必信公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠單側腦室埋管術 術前小鼠禁食12 h，腹腔注射80 g/L水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后充分暴露顱骨，立體定位儀定位，用三棱針于顱骨表面側腦室代表區鉆透顱骨（立體定位坐標：前囟后0.3 mm，矢狀縫右側1 mm，顱骨表面下2.2 mm）。將長7 mm、外徑0.7 mm、內徑0.5 mm的不銹鋼外套管置入右側側腦室，用502膠和牙托粉固定外套管，并置入針芯防止堵塞。術后恢復3 d，分籠飼養，恢復期間每日腹腔注射2萬單位青霉素預防感染。術后第4天，實驗組小鼠每天側腦室注射Apo D 80 μg/kg，對照組小鼠每天側腦室注射等量的生理鹽水，持續7 d。

1.2.2 細胞培養 于細胞培養前1 d，用100 mg/L多聚賴氨酸處理細胞培養瓶。將MES23.5細胞從液氮中迅速轉移到37 ℃水浴鍋中，完全融化后，用培養液輕輕吹打懸浮，然后接種于預先鋪有多聚賴氨酸的培養瓶中，置37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中培養。實驗時細胞以1×105/cm2密度接種于6孔板，實驗組細胞給予8 nmol/L Apo D處理24 h，對照組細胞給予等量PBS處理24 h。給藥劑量參考相關文獻［11］。

1.2.3 Western Blotting檢測BSG蛋白表達 側腦室注射Apo D 7 d后，處死小鼠，根據小鼠腦圖譜定位取出黑質區腦組織，置于1.5 mL EP管中，加入100 μL裂解液，置于高速低溫組織研磨儀中研磨，研磨完置于冰上裂解30 min后提取蛋白，然后加入5×loading buffer，在水中煮沸10 min變性。從培養箱中取出MES23.5細胞，負壓吸除培養液，每孔加入100 μL裂解液，置于冰上裂解30 min后提取蛋白，然后加入5×loading buffer，在水中煮沸10 min變性。蛋白提取完畢后進行SDS-PAGE凝膠電泳，凝膠孔上樣量為每孔20 μg。采用90 V穩定電壓進行電泳，300 mA穩定電流進行轉膜，轉膜時間90 min，轉膜結束后根據所需蛋白分子量對PVDF膜進行裁剪，應用10 g/L的脫脂奶粉封閉90 min，分別加入BSG抗體、β-Tublin抗體并置于4 ℃孵育過夜。應用TBST溶液清洗3次，每次10 min，然后加入二抗室溫孵育60 min，再用TBST溶液清洗3次，每次10 min。用配制好的ECL化學發光液進行顯影并拍照，使用Image J軟件分析條

帶灰度值。BSG的表達水平以BSG/β-Tublin比值

表示。

1.3 統計學方法

使用GraphPad Prism軟件對數據進行統計學分析，計量資料數據以±s表示，兩獨立樣本比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結? 果

2.1 外源性Apo D對小鼠黑質區BSG表達的影響

Western Blotting檢測結果顯示，與對照組小鼠（0.606 9±0.095 2）相比，給予Apo D組小鼠（0.948 4±0.312 6）黑質區BSG蛋白的表達水平明顯上升，差異具有統計學意義（n=3，t=3.408，P<0.05）。見圖1。

2.2 外源性Apo D對MES23.5細胞BSG蛋白表達的影響

Western Blotting檢測結果顯示，與對照組細胞（0.836 9±0.059 4）相比，給予Apo D組細胞（1.051 0±0.071 5）BSG蛋白的表達水平明顯上升，差異具有統計學意義（n=6，t=2.299，P<0.05）。見圖2。

3 討? 論

作為一種在體內廣泛分布的蛋白質，Apo D已被發現能與包括膽固醇、孕酮、卟啉、花生四烯酸在內的多個疏水性分子結合，配體的多樣性表明Apo D具有廣泛的細胞功能。在阿爾茲海默病、卒中、帕金森病、精神分裂等多種疾病中均發現Apo D的表達增加［3-4，12］。在神經系統中Apo D可能參與了膽固醇及其他類固醇的酯化作用［13］。越來越多的證據表明，Apo D具有神經保護作用，過表達Apo D能夠防止紅藻氨酸誘導的小鼠神經毒性［14］，在小鼠

大腦中過表達Apo D能夠提高小鼠存活率并降低氧化應激導致的腦脂質過氧化物增加［15］。多巴胺能神經元作為黑質中最主要的神經元，在動物活動中起很大作用。前期研究已經證明Apo D對多巴胺能神經元具有保護作用［16］，但其作用的具體機制仍不明確。有研究認為，Apo D是通過內化到神經元中調節脂質代謝來發揮保護作用的［14］。

Apo D作為神經系統中具有重要保護作用的物質，其內化的具體機制目前仍不明確。在所有脊椎動物中均檢測到BSG基因的表達，其編碼產物在體內發揮著物質轉運、分子識別等多種功能［17-18］。研究認為，Apo D是通過BSG內化到細胞內的，而且BSG的天然配體親環素A能夠抑制Apo D的內化［10］。離開神經系統的Apo D聚集在腎臟、肝臟等器官中，而其在這些器官中的聚集也與BSG的表達密切相關［19-20］。本研究結果顯示，多巴胺能神經母細胞瘤MES23.5細胞給予外源性Apo D處理后，其BSG蛋白表達明顯升高，在小鼠黑質區多巴胺能神經元中也得到了相同的結果，這表明在體內和體外Apo D均能夠促進多巴胺能神經元BSG蛋白的表達。本研究為進一步揭示Apo D的神經保護作用機制提供了新的思路。

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（本文編輯 馬偉平）