玉米紫色葉突變體zmpl-1表型分析及基因定位

朱振興,郭長英,李 丹

(遼寧省農業科學院作物分子改良實驗室,遼寧 沈陽 110161)

葉片是植物接受陽光,進行光合作用最重要的組織器官。一般植物葉片顏色,因富含葉綠色葉片呈現綠色。在一些外界環境下刺激或脅迫下,如到了秋季氣溫變低,葉綠素逐漸降解,當花青素的含量多于葉綠素時,葉片就會呈現紫色;在缺磷的條件下,植物會合成更多花青素,葉片也變成紫色[1]。因此,紫色被認為是花青素的標識物,花青素屬于黃酮類物質,是廣泛存在于植物體內的一種天然色素,在植物著色以及抗氧化上具有重要作用。也因此可以保護人體免受自由基氧化的損傷、增加皮膚光滑度、保護肝臟、保持血管彈性等,是抗氧化、抗衰老的重要活性物質[2]。葉色突變體是開展葉片顏色調控基因功能及光合作用研究的重要材料。在植物中已經發現的葉色突變體多種多樣,包括多種類別,有淺綠葉、黃化轉綠葉、黃化葉、白化葉、條紋葉以及紫色葉等[3~7]。紫色葉突變體是研究花青素生物合成調控的重要材料。另外紫色葉容易識別,對植株生長發育影響小等特點,也被應用到品種制種去雜、純度鑒定等育種過程中,可以減少田間人工去雜工作量,極大的提高去雜效率[8]。玉米是中國的第一大作物,在國民生活及經濟中占有重要地位。盡管玉米花青素生物合成途徑可能與其它物種中分子機制相似[9],但缺乏詳實的數據,還有很多不清楚的地方。發掘、研究玉米紫色葉片突變體,可以補充、完善玉米花青素合成的分子機制,也可為制種去雜提供標記材料。

盡管葉色突變體在不同物種中報道了很多,但紫葉相關突變體報道相對較少[10]。紫葉突變體在水稻、小麥、油菜等作物中有少量報道。水稻中克隆了1個位于第6條染色體上的紫葉控制基因OsPL6,編碼了1個MYB轉錄因子[11]。在該基因的5’UTR非翻譯區鑒定到3個 SNP和1個6 bp的缺失。研究發現正是該非翻譯區的變異,導致該MYB轉錄因子表達的上調,繼而促進了花青素合成途徑中結構基因的上調表達,包括OsCHS、OsPAL、OsF3H以及OsF3’H基因表達都顯著的被提高,從而促進了花青素積累。水稻中的另1個紫色葉調控基因OsPL,位于第5條染色體上,同樣也編碼了1個MYB轉錄因子。該基因第3個外顯子上插入了1個堿基,造成了該編碼基因移碼突變[12]。該基因的突變造成植物葉片中花青素含量增加,葉綠素減少。與之相對應的是較野生型,花青素合成基因OsPAL、OsCHS、Os-ANS以及OsMYB55顯著上調表達,而光合相關基因表達都被下調。在小麥中報道的1個低溫敏感的紫條紋突變體psl1[13],在低溫下顯示紫色,花青素積累多而葉綠素和胡蘿卜素降低,而在高溫條件下則表現為正常綠色。遺傳分析表明,psl1表型受細胞質遺傳控制。熒光定量實時PCR結果顯示出,低溫條件下在相對幼嫩的葉片中葉綠體發育相關基因psbA和psbC基因下調最多。油菜中克隆了1個能提高紫葉芥菜花青素含量基因BjPur,該基因編碼 1個R2R3-MYB轉錄因子[14]。紫葉親本(ZY)與綠葉親本(LY)中的BjPur基因序列比較發現,紫葉親本中的BjPur基因的第一個內含子中有1個較大的插入,造成BjPur基因在紫葉植株中表達顯著被提高,而且該基因在葉中的表達量遠高于根中。

本研究從在本實驗室構建的EMS人工誘變玉米B73突變體庫中,篩選到1份特異的玉米紫色葉突變體,命名為zmpl-1。擬通過構建F2定位群體,分析紫色葉突變體控制基因的遺傳特性,并通過重測序BSA-seq定位該基因位置,以其為解析玉米花青素形成分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及種植條件

玉米紫色葉突變體zmpl-1,玉米品種 Mo17。小缽盆栽實驗于2021年3月在遼寧省農業科學院人工氣候箱中(澤大儀器有限公司)開展,12 h光照/12 h黑暗,將催完芽后的玉米種子播種于滅菌的營養基質中(購置于沈陽農業大學工廠化技術服務中心),然后正常澆水,培養至指定天數。F2材料2021年5月常規種植于試驗地中,種植大概行距40 cm,行長 2 m,株距 20 cm,其它與一般大田管理,正常澆水、施肥、蟲害管理等。

1.2 葉片花青素含量測定

于2021年3月取葉片鮮樣約0.1 g,提取液為0.1 mol/L的鹽酸乙醇溶液(1 L溶液含有8.3 ml濃鹽酸其余用95%乙醇稀釋)。首先將葉片置于2 ml離心管,加入一顆4 mm直徑陶瓷珠(因溶液呈酸性注意不要使用金屬小球)以及1ml提取液,于植物組織研磨儀上以頻率 50破碎1 min(上海靜信實業發展有限公司 Tissuelyser-64L組織研磨儀)。然后轉入50 ml離心管中并加入9 ml提取液,于60℃溫育提取30 min,然后加入5 ml提取液繼續浸提15 min,再次加入5 ml提取液繼續浸提15 min,最后用提取液定容至25 ml,全程注意避光。其后在分光光度計上(日本島津 UV2600)分別檢測530 nm、620 nm以及650 nm波長處的光密度值,然后按照Greey公式計算花青素含量,花青素含量(nmol/g)=[(OD530-OD620)-0.1×(OD650-OD620)]×V/W/(4.62×104)×1 000 000,其中 V,提取液加入總體積(ml);W,重量(g);4.62×104為花青素摩爾消光系數。

1.3 DNA提取及BSA-seq

在B73背景紫色葉突變體zmpl-1與Mo17雜交組配的F2群體中,分別取野生表型14份植株,突變體表型植株14份葉片,然后進行基因組DNA提取,提取采用植物高效基因組DNA提取試劑盒DP350(天根生化科技有限公司)。純化出來的基因組DNA采用兩種方法進行濃度和質量的檢測,一是0.8%瓊脂糖凝膠電泳,要求基因組DNA條帶清晰、銳利,無明顯拖尾;二是采用Nanodrop(美國賽默飛世爾科技公司)測定 DNA質量和濃度,挑選出的樣品要求280/260,260/230比值在1.8~2.2之間。利用重測序技術進行BSA-Seq時,兩個混池按照每個樣品基因組DNA使用總量100 ng均一混樣即可,每個樣品濃度要求在 50 ng/μl左右。檢測合格的基因組DNA混樣,送到北京普朗泰科生物科技有限公司進行高通量測序分析。

測序出來的原始序列過濾掉接頭序列、低質量序列等,得到Clean Reads,用于后續分析。bwa軟件將重測序獲得的短序列reads定位到參考基因組上(zea_mays.V4,ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-41/fasta/zea_mays/dna/)。通過比對定位Clean Reads在參考基因組上的位置,統計各樣品的測序深度、基因組覆蓋度等信息,并進行變異的檢測。利用GATK軟件工具包檢測SNP(Single Nucleotide Polymorphism)。性狀關聯分析采用歐式距離(Euclidean Distance,ED)算法[18],利用測序數據尋找混池間存在顯著差異的標記,并以此評估與性狀關聯區域的方法。在進行分析時,利用兩混池間基因型存在差異的SNP位點,統計各個堿基在不同混池中的深度,并計算每個位點ED值。利用標記在基因組上的位置,對同一條染色體上標記的ED值進行擬合,并根據關聯閾值,選擇閾值以上的區域作為與性狀相關的區域。

2 結果與分析

2.1 表型觀察及花青素含量測定

該突變體僅葉尖及葉緣部位呈現紫色,而葉片其它部位顏色較野生型 B73無明顯差異(圖1A,B以及F)。在14 d苗齡時,突變體第1、2片全展葉在葉尖呈現紫色,特別是第2片全展葉(圖1A和圖1B)。第2片全展葉的花青素含量測定表明zmpl-1突變體葉片中花青素含量較野生型顯著增加,大概為野生型葉片中含量的10倍(圖1C)。在吐絲期時,觀察突變體表型發現,該紫色葉片的面積在老葉中比較大,而在相對幼嫩的葉片中逐漸減少,最上面的6片葉中上幾乎觀察不到紫色,而最后的5片葉片中,紫色葉片在葉尖及葉緣范圍依次增加(圖1D~F)。

圖1 野生型B73和zmpl-1突變體植株表型及葉片花青素含量Figure 1 Phenotype and leaf anthocyanin concentrations of wild type B73 and zmpl-1 mutant

2.2 遺傳分析

在B73背景的zmpl-1突變體與Mo17雜交的F1植株47株,均呈現出正常綠色葉片,說明該紫色葉性狀受隱性基因控制。在吐絲期觀察F2群體中植株葉片表型的分離情況,結果顯示在種植的F2群體中,葉片表現類似于zmpl-1突變體表型的植株僅有14株,葉片全綠色的植株有962株。

卡方分析表明,F2中紫色葉表型植株與綠色葉植株數量符合63∶1的比例(表1),表明該紫色葉性狀可能受3個隱性基因共同調控,而且只有這3個隱性基因都存在的情況下,植株才能顯示出紫色葉表型。

表1 zmpl-1×Mo17 F2群體中分離個體遺傳分析Table 1 Statistical analysis of phenotype of F 2 population from zmpl-1×Mo17

2.3 BSA-seq重測序數據總概

B73來源突變體zmpl-1與 Mo17雜交組配定位群體,在吐絲期F2群體中挑選14株突變體表型植株以及14株葉片顏色全綠色植株,進行BSA-seq重測序分析。結果表明兩個混樣池綠色葉混樣池(L)以及紫色葉混樣池(P),測序總數據量分別高達272 054 640和257 343 500個Clean reads,數據量達到了平均17X和16X的測序深度,而定位到基因組上的Clean reads數比例也高達 90%,說明測序數據量多,質量也高(表2)。

表2 BSA-seq測序數據總概Table 2 Statistical analysis of BAS-seq data

2.4 性狀關聯分析

性狀關聯分析采用歐式距離(Euclidean Distance,ED)算法,通過統計各堿基在不同混池中的等位基因頻率,計算每個位點的原始ED值。根據關聯閾值判定,最終將紫色葉zmpl-1突變體控制基因定位到第2條、第3條、第5條以及第10條染色體上(圖2),區間高達207.3 Mb。詳細關聯到的信息如表3所示,主要定位區域是第2條及第10條染色體上的區間,而第3條與第5條染色體上涉及的定位區域相對較少僅8.8 Mb。

圖2 SNP-index值在染色體上的分布Figure 2 Distribution of SNP-index on chromosomes

表3 染色體關聯區域匯總Table 3 Summary of associated chromosome region

染色體編號 起始位置 結束位置 區間大小(Mb) 染色體編號 起始位置 結束位置 區間大小(Mb)2 79800000 83100000 3.3 3 234700000 235400000 0.7 2 84300000 88200000 3.9 5 300000 400000 0.1 2 90700000 91900000 1.2 5 900000 5600000 4.7 2 93900000 101300000 7.4 10 6700000 17600000 10.9 2 101500000 109800000 8.3 10 18100000 32600000 14.5 2 110300000 116600000 6.3 10 33800000 37800000 4 2 117500000 117600000 0.1 10 38000000 42800000 4.8 2 117800000 120300000 2.5 10 46300000 47200000 0.9 2 120900000 121100000 0.2 10 47400000 47600000 0.2 2 121600000 124900000 3.3 10 49700000 51400000 1.7 2 130900000 135100000 4.2 10 54100000 67500000 13.4 2 138000000 138400000 0.4 10 69700000 88400000 18.7 2 138600000 138700000 0.1 10 90200000 93700000 3.5 2 146300000 157500000 11.2 10 96100000 100600000 4.5 2 158200000 160300000 2.1 10 109000000 132700000 23.7

3 結論與討論

花青素是一類植物中廣泛存在的天然色素,抗氧化性好,在食品著色、醫藥、化妝品等方面都有重要用途[3]。紫色一般被認為是花青素化合物的標記性顏色,紫色葉突變體是研究花青素生物合成、調控途徑重要的原始材料[11~14]。本研究對EMS誘變玉米B73突變體庫中篩選到的紫色葉突變體zmpl-1進行了表型分析、葉片花青素含量測定、遺傳和重測序 BSA-seq基因定位分析。表型觀察表明,zmpl-1突變體在葉尖及葉緣出現紫色,而且紫色的分布在老葉與新葉不同?；ㄇ嗨販y定表明突變體紫色葉片中花青素含量較野生型大幅提高。與 Mo17組配的 F2群體中植株葉片顏色表型遺傳分析表明,該zmpl-1突變體紫色葉性狀可能受3個隱性基因控制。BSA-seq重測序將該紫色葉性狀控制基因定位到4條染色體上207.3 Mb的區間內,包括染色體第 2條、第 10條、第3條以及第5條。

本研究中鑒定的玉米紫色葉突變體zmpl-1,遺傳分析表明該性狀可能受3個隱性基因調控(表1),而 BSA-seq將該基因定位在四條染色體上(圖2),主要是第2條和第10條染色體上的區間,下一步需要重點關注這兩個區間。綜合紫色葉突變體zmpl-1的遺傳分析和定位來看,該紫色葉性狀受多個基因控制,而且需要幾個基因同時為隱性基因型才能起作用,植株葉片呈現紫色表型。該突變體出現的原因可能是我們在突變體庫建立時使用EMS誘變花粉時,使用的劑量較大,容易造成出現多位點突變。在油菜中鑒定到的紫色葉相關調控基因,主要定位在兩條染色體上,B04以及B05上。最終克隆了位于B05染色體上BjPur,該基因編碼了一個 R2R3-MYB轉錄因子[14]。油菜中的BjPur基因是半顯性基因,而我們玉米突變體zmpl-1是受隱性基因控制,表明該基因的調控的分子路徑與油菜BjPur基因很可能不同。而其它幾個在水稻中已經發表的紫葉調控基因都與花青素合成途徑有關,克隆出來的基因基本都是屬于MYB轉錄因子家族成員[11~12],因此在zmpl-1定位區間搜尋相關MYB轉錄因子可能是克隆該基因重要方法。從另一方面來說,從zmpl-1受隱性多基因調控,與其它現已報道紫葉調控基因明顯不同,我們鑒定的這一份玉米紫色葉突變體zmpl-1屬于特異的資源,為解析新的玉米花青素分子路徑提供了重要材料。

本研究僅是初定位了玉米突變體zmpl-1,定位區間很大,離基因克隆還有一定距離。下一步需要擴大群體,進行精細定位。盡管我們F2群體取樣是在吐絲期,確保了樣品表型的準確性,規避了苗期取樣易出現表型不準確情況(田間B73野生型苗期可能是冷害或是肥料不均一等原因,容易出現紫色葉片植株)。但是從遺傳分析上看紫色葉突變表型可能受3對隱性基因共同調控,在重測序BSA-seq結果卻定位到基因組4個區域上,可能由于用于測序植株數量較少,造成假陽性位點的出現。而第2條和第10條染色體上關聯到的區間較多,該結果應該可靠,需要進一步精細定位。但由于在F2定位群體中出現紫色葉表型的個體數量非常少,未來精細定位工作量巨大。而且從現在的表型看,如何能定位到這幾個基因具有很大的挑戰性。在基因定位策略中有一種定位手段叫Mutmap[15],該策略通過與野生型材料回交,可以過濾掉很多干擾位點的影響,然后同樣是進行混池法測序,檢測 SNP、indel等變異,檢測后代基因頻率,實現突變位點的定位。因此將來也可以嘗試采用回交群體利用Mutmap方法繼續進行基因的定位,挖掘候選基因。