萵筍鏈格孢葉斑病病原鑒定及室內生防菌劑篩選

朱啟寒，何劍鵬，張曉陽，2，李庚花，劉 冰，熊桂紅，蔣軍喜*

（1.江西農業大學 農學院，江西 南昌 330045；2.江西省九江市農業技術推廣中心，江西 九江 332000）

【研究意義】萵筍（Lactuca sativavar.angustataIrish），即莖用萵苣，為菊科一或二年生草本植物，其莖葉均可食用，既可補充維生素、蛋白質，也可預防疾病、潤腸通便[1]。萵筍栽培較易，經濟效益好，但在種植過程中易發生病害[2-3]。2022 年4 月，在江西省南昌市郊蔬菜種植地發現一種少見的葉斑病，經鏡檢初步確定其病原為鏈格孢屬（AlternariaNees）真菌，但種類未明確。本研究主要開展此病菌種類鑒定及室內生防菌劑篩選，對該病害的后續研究和綠色防控具有重要的理論和實際意義?！厩叭搜芯窟M展】國外尚未見萵筍鏈格孢葉斑病病原菌鑒定的報道，但發現近10 種鏈格孢屬真菌能引起萵筍的近緣變種生菜即葉用萵苣的葉斑病[4-9]；我國則報道了蕓薹鏈格孢A.brassicae和茄鏈格孢A.solani可引起河北省和內蒙古自治區的萵筍葉斑病[10]，同時，發現交鏈格孢A.alternata可引起廣昌縣白蓮葉斑病[11]。目前，國內外尚未開展萵苣鏈格孢葉斑病的生物防治研究?！颈狙芯壳腥朦c】本研究擬從田間采集萵筍鏈格孢葉斑病樣品，對其進行病菌分離，對分離獲得的菌株進行形態學和分子生物學鑒定，并做致病性測定，同時，從市場上挑選主要用于作物真菌病害的生防制劑進行室內生防菌劑篩選?！緮M解決的關鍵問題】本研究旨在明確南昌市郊萵筍鏈格孢葉斑病病原菌種類，并篩選到對該病菌具有顯著抑制作用的生防菌劑。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2022 年4 月在江西省南昌市郊3 個蔬菜種植地隨機采集25 份萵筍鏈格孢葉斑病病葉，迅速帶回實驗室進行病菌分離。

1.2 病菌分離純化

采用常規組織分離法進行病菌分離。選擇典型病斑，在病健交界處剪取邊長約3 mm 的小塊組織，在超凈工作臺上先用體積分數75%酒精消毒10 s，再在1 g/L 升汞溶液中消毒15 s，隨后用無菌水漂洗3 次，每次2 min，最后將小塊組織在滅菌濾紙上吸干殘留水分后移入PDA 平板上[12]，然后置于26 ℃恒溫箱中培養，待菌落長出后，挑取菌落邊緣菌絲體進行純化，獲得純培養菌株。

1.3 病菌致病性測定

取新鮮萵筍健康葉片，先用體積分數75%的酒精作表面消毒，再用無菌針頭在以主脈為分界的兩半葉片各輕刺兩個傷口。將培養10 d的菌落用無菌水洗下孢子，經紗布過濾得到孢子懸浮液，再用無菌水將孢子懸浮液稀釋至106CFU/mL。對左半葉兩傷口，各接種10 μL 孢子懸浮液，對右半葉兩傷口則各接種等量無菌水作對照。將接種及對照葉片置于26 ℃恒溫培養箱中培養，逐日觀察結果，試驗設置3 次重復[13-14]。

1.4 病菌培養性狀及形態觀察

將供試菌株接種于PDA 平板中央，26 ℃培養，逐日觀察菌落形態及產孢情況，用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落生長速度。利用李朋華[15]的方法觀察分生孢子鏈，即將濾紙剪成同載玻片大小形狀，并在中間剪出1 cm×2 cm的小孔，滅菌后，在超凈工作臺中，加入適量無菌水，使濾紙緊貼載玻片，挑取菌絲放在濾紙孔旁，26 ℃培養24 小時觀察分生孢子鏈形態。取菌落上分生孢子梗及分生孢子制片鏡檢，觀察其形態特征并測量大小[16]。根據觀察結果，參照文獻[17-18]，初步確定病原菌種類。

1.5 病菌分子生物學鑒定

1.5.1 菌株基因組DNA 提取 取適量菌絲于2 mL 圓底離心管中，加入滅菌的鋼珠，用液氮研磨打樣成粉狀。采用Ezup柱式真菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株基因組DNA，用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。

1.5.2rDNA-ITS和Alt a1基因擴增及序列測定 采用引物對ITS1（5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[19]和Alt-F（5′-ATGCAGTTC ACCACCATCGC-3′）/Alt-R（5′-ACGAGGGTGAYGTAGGCGTC-3′）[20]分別對rDNA-ITS和Alt a1基因進行PCR 擴增。PCR 擴增反應總體系25 μL，包含ddH2O 8.5 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、正反向引物各1 μL（10 μmol/L）和模板DNA 2 μL。PCR 反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1min，共35 個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的片段送至生工生物工程（上海）有限公司進行序列測定。

1.5.3 序列比對及系統發育樹構建 獲得的原始序列用DNA Star分析軟件進行拼接，用BLAST比對后，將獲得的準確序列遞交至GenBank 獲得登錄號。根據序列同源性大小，在GenBank 數據庫中下載相關序列（表1），利用MEGA 7.0軟件中的鄰位加入法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹[21]。

表1 用于構建鏈格孢屬系統發育樹的基因序列信息Tab.1 Gene sequence information for the construction of phylogenetic tree of Alternaria spp.

1.6 室內生防菌劑篩選

將市售的8 種生防菌劑（表2）按照各自的芽孢含量稀釋成1×108CFU/mL 菌懸液備用。采用平板對峙法[22]測定其對萵筍葉斑病菌的抑菌作用。在PDA 平板正中央接種直徑為5 mm 的病原菌菌餅，以病原菌菌餅位置為中心，在正四方各2.5 cm 處用長牙簽蘸取適量生防菌菌懸液，對照組點滴適量無菌水，均以菌液無流動為適量，各處理均3 次重復。26 ℃培養箱中培養7 d 后用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落平均直徑以及各生防菌對病原菌的抑菌率，抑菌率公式[23]為：

表2 8種生防菌劑基本信息Tab.2 Basic information of 8 tested biological agents

1.7 數據分析

采用Excel 2010 和SPASS 20.0 軟件進行數據統計與處理，使用Duncan’s 法進行差異顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 病害田間癥狀與病原菌分離

2022年4月，在江西省南昌市郊種植的萵筍上發現一種新的葉斑病，病斑大多發生于植株中下部葉片，葉片病斑初期為褐色小點，后逐漸擴大成圓形或不規則形，有的受葉脈限制呈多角形，病健交界明顯，天氣潮濕時，病斑表面產生灰色霉層。重病葉片病斑累累，卷縮干枯脫落。對病葉（圖1-A）進行組織分離純化，共獲得23株培養性狀一致的鏈格孢屬菌株，分離率100%。

2.2 致病性測定

用分離到的代表性菌株WS1進行孢子懸浮液接種，接種1 d后開始發病，病斑近圓形，灰褐色（圖1-B），4 d后病斑擴大，周圍褪綠變黃（圖1-C），5 d后病斑繼續擴大并裂開（圖1-D），其癥狀與自然發病癥狀相同，對照組均不發病。對接種產生的病斑進行病菌再分離，獲得的菌株與WS1的形態特征以及分子生物學測定結果一致。

圖1 萵筍鏈格孢葉斑病癥狀以及病菌形態Fig.1 Symptoms of lettuce Alternaria leaf spot and the morphology of its pathogenic fungus

2.3 病菌培養性狀及形態特征

供試菌株在PDA平板上26 ℃培養5 d，菌落圓形，菌絲體絨毛狀，菌落正面中央灰褐色，邊緣白色，菌落背面中央黃褐色，邊緣白色；后期菌落正面中央顏色加深成暗青褐色，背面呈黑褐色（圖1-E，圖1-F）；菌落平均生長速度為10.86 mm/d。分生孢子梗單生或叢生，直立或膝狀彎曲，0～12個隔膜，少分支，淡褐色至褐色，大?。?5.76～83.02）μm×（2.90～4.74）μm（圖1-G）；分生孢子以短鏈方式著生在分生孢子梗上，主鏈一般不超過10個孢子，分生孢子側面或基部可萌生次生分生孢子梗形成支鏈而產孢，支鏈不超過5個孢子（圖1-H）。分生孢子倒棍棒形或橢圓形，淡褐色至褐色，表面光滑或帶微刺，具0～6 個橫隔、0～3 個縱隔和0～2個斜隔，分隔處稍縊縮或不縊縮，孢身大小為（14.60～40.09）μm×（6.61～14.44）μm（圖1-I）；短喙柱狀或錐形，淡褐色，大?。?.84～8.29）μm×（2.60～4.35）μm。根據菌株的菌落特征和病菌形態大小，將該菌株初步確定為交鏈格孢A.alternata。

2.4 分子生物學鑒定

用真菌DNA 通用引物對ITS1/ITS4和Alt-R/Alt-F 分別對rDNA-ITS和過敏原基因Alt a1進行PCR 擴增和測序，結果獲得的DNA 片段長度分別為570 bp 和472 bp，其在GenBank 中的序列登錄號分別為OP161641和OP185144。通過BLAST比對，發現此兩序列與GenBank中交鏈格孢A.alternata對應序列均具有100%的同源性。在以rDNA-ITS和Alt a1基因串聯序列構建的系統發育樹中，菌株WS1 與A.alternata的菌株聚于同一分支，而其他種類的鏈格孢構成各自獨立的分支（圖2）。根據序列同源性大小和菌株親緣發生關系，將菌株WS1鑒定為交鏈格孢A.alternata。

圖2 基于rDNA-ITS和Alt a1基因序列構建的鏈格孢屬的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Alternaria spp.based on the sequences of rDNA-ITS and Alt a1 genes

2.5 室內生防菌劑篩選

8種供試生防菌劑對交鏈格孢A.alternata均有較好的抑制效果（表3和圖3），其中，地衣芽孢桿菌抑菌效果最好，抑菌率達75.42%，巨大芽孢桿菌抑菌效果最差，抑菌率為63.55%。

圖3 8種生防菌劑與交鏈格孢菌的對峙培養Fig.3 Confrontation culture of 8 biocontrol agents and A.alternata

表3 8種生防菌劑對交鏈格孢菌的抑菌效果Tab.3 Inhibitory effects of 8 biocontrol agents on A.alternata

3 結論與討論

本研究對江西省南昌市郊萵筍鏈格孢葉斑病進行病原菌分離，共獲得23 株培養性狀一致的鏈格孢屬菌株，在通過接種明確其具有致病性的基礎上，選擇代表性菌株進行培養性狀和形態特征觀測，觀測結果與文獻中對交鏈格孢的描述一致，隨后對代表性菌株的rDNA-ITS和Alt a1基因進行PCR擴增、測序和序列分析，結果所得序列與GenBank 中交鏈格孢對應序列具有100%的同源性，并在系統發育樹上處于同一個分支且支持率為99%。綜合上述結果，將發生于江西南昌市郊的萵筍鏈格孢葉斑病的病原鑒定為交鏈格孢。采用對峙培養法，測定8 種生防菌劑對交鏈格孢的抑制作用，結果8 種生防菌劑對交鏈格孢均具有較好的抑制作用，其中，地衣芽孢桿菌和熒光假單胞菌的抑菌效果突出，抑菌率分別達75.42%、72.74%，巨大芽孢桿菌抑菌效果相對較弱，抑菌率為63.55%。對該病害病原的明確和篩選出高效生防菌劑為該病害的后續研究和生物防治奠定了工作基礎。

本研究報道的由交鏈格孢A.alternata引起的萵筍葉斑病與前人報道的由蕓薹鏈格孢A.brassicae和茄鏈格孢A.solani引起的萵筍葉斑病除病原種類不同外，其癥狀表現也不同，前者的癥狀為病斑圓形或不規則形，褐色，無輪紋，后者的病斑雖然也為圓形或不規則形，但病斑為黑褐色，有輪紋。因此，在診斷這兩種病害時，除依靠病菌形態差異外，還可以根據病害癥狀作出初步判斷。同時，在田間診斷該病害時，還應注意與萵筍上另外兩種半知菌葉斑病相區別。一種是由極長尾孢Cercospora longissima引起的萵筍葉斑病，其病斑邊緣褐色，中心有灰白色小斑，病斑內外有顏色差異，另一種為微疣匐柄霉Stemphylium chisha為害引起的葉斑病，其病斑黃褐色并有明顯的同心輪紋[24-25]。鏈格孢由于其孢子形態鮮明，很容易鑒定到屬，但有些鏈格孢種間形態變異性大，難以確定到種。因此，在形態學鑒定的基礎上，一些研究者還采用兩個及兩個以上基因聯合構建系統發育樹來進一步鑒定鏈格孢種類[26]。本研究基于rDNA-ITS和Alt a1基因的序列分析和系統發育樹構建，則明確將萵筍鏈格孢葉斑病菌鑒定為交鏈格孢，且與形態鑒定結果相一致。在生防菌劑篩選試驗中，雖然獲得地衣芽孢桿菌、熒光假單胞菌等高效生防菌劑，但這僅說明其在室內單純對病菌具有顯著的抑菌效果，并不表示其在田間對萵筍葉斑病具有等同的防效[27]。后續筆者將對這些生防菌劑進行大田防效試驗研究，為萵筍葉斑病的綠色防控提供更為可靠的依據。