利用酵母雙雜交系統篩選本氏煙中與RGSV P5互作的蛋白

熊桂紅，胡昱顓，吳祖建

（1.江西農業大學 農學院/江西省薯芋生物學重點實驗室，江西 南昌 330045；2.福建農林大學 植物病毒研究所，福建 福州 350002）

【研究意義】水稻草狀矮化病毒（Rice grassy stunt virus，RGSV）是纖細病毒屬（Tenuiviruses）的重要成員，于1963年在菲律賓首次發現，隨后蔓延至南亞、東南亞、東亞等地[1]。我國臺灣、福建、廣東等東南沿海地區先后發現該病害，并逐漸成為水稻上的一種毀滅性病害[2-3]。近年該病害在越南等地爆發流行并給糧食產量造成巨大損失[4-5]。針對該病害的防治，目前未發現理想的抗病品種，且RGSV 的致病機制也還不清楚，尚未找到有效防治措施。因此篩選與RGSV 互作的寄主蛋白，不僅有利于解析病毒致病和寄主抗病毒等分子機制，而且將為RGSV 的防控提供新的策略?！厩叭搜芯窟M展】水稻感染RGSV 后主要表現植株嚴重矮化，分蘗增多，似雜草叢生狀、后期葉片上會出現不規則形的暗褐色病斑，病株不抽穗或結實率低等癥狀，一旦感染，很難治愈[5-6]。RGSV 通過褐飛虱以增殖型持久性方式進行傳播[7]。RGSV 全基因組包含6條ssRNA，采用雙義編碼策略共編碼12個蛋白[8]。有研究[9-10]發現，P2和P5是該病毒的沉默抑制子，且P5 的沉默活性比P2 強。P5 能夠自身互作，也能與P3 互作增強病毒的致病性[9]。植物病毒的復制、組裝、運動、致病、癥狀形成等生物學過程都需要蛋白質的相互作用才能完成。例如，RRSV的沉默抑制子Pns6 篩選水稻cDNA 文庫獲得互作蛋白，且Pns6 與延伸因子OseEF1A 互作，招募、轉運OseEF1A 至病毒基質處并幫助病毒在寄主體內增殖與復制[11]。水稻條紋病毒NSvc4 與葉綠體相關蛋白NbGAPDH、NbPsbQ1互作，敲除NbGAPDH-A 或NbPsbQ1均可促進RSV 感染[12]。水稻條紋病毒的運動蛋白NSvc4篩選本氏煙cDNA 文庫獲得互作蛋白，NSvc4 與煙草NbMIP1 家族蛋白互作抑制NSvc4 自噬降解，維持自身穩定性[13]。南方水稻黑條矮縮病毒編碼的P1 蛋白是一個致瘤基因，P1 能夠與植物成視網膜瘤蛋白（PBR）互作誘發細胞增生并產生瘤狀突起[14]。因此研究植物病毒與寄主的互作具有非常重要的意義。篩選互作蛋白最常用、簡便的方法是酵母雙雜交技術，該技術不僅可以用來驗證已知蛋白間的互作關系，還可以利用已知蛋白篩選與之互作的未知蛋白，有利于推測和研究互作蛋白的功能[15]?！颈狙芯壳腥朦c】目前關于RGSV 與寄主互作鮮有報道，且RGSV 多數蛋白的功能尚不清楚。鑒于植物病毒與寄主互作的重要性，本研究擬從本氏煙cDNA文庫中篩選與RGSV沉默抑制子P5互作的寄主蛋白?！緮M解決的關鍵問題】利用酵母雙雜交技術篩選文庫獲得與P5 互作的本氏煙蛋白，分析互作蛋白的功能，為解析RGSV的致病機制奠定基礎，并為RGSV的防治提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本氏煙酵母cDNA 文庫、酵母菌株Y2H Gold、載體pGADT7、pGBKT7、pGADT7-T、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、大腸桿菌DH5α 由本實驗室保存；酵母雙雜交營養缺陷型培養基二缺SD/-Leu/-Trp、四缺SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp、X-α-gal、Carrier DNA 購自Clontech（美國）公司；DNA聚合酶2×EasyPfu PCR Super-Mix、克隆載體pEASY-blunt Zero Cloning 購自全式金生物技術（北京）股份有限公司；植物總RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒Fast Quant RT Kit、酵母質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內切酶BamHI、NdeI、T4-DNA連接酶購自NEB（美國）公司；

1.2 試驗方法

1.2.1 RGSVP5基因的擴增和誘餌載體pGBKT7-P5的構建 利用植物總RNA 提取試劑盒提取感染RGSV 水稻的總RNA。以RNA 為模板反轉錄合成cDNA。根據RGSVP5基因序列（GeneBank：AF290947.1）設計用于酵母雙雜交的引物：BD-P5-F：GGAATTCcatatgATGTCTGGCATGAATTC，BDP5-R：CGggatccCTAGACTCTAACGTAATCTG，分別加入NdeI、BamHI 酶切位點。PCR 反應體系為：ddH2O 19 μL、2×EasyPfu PCR SuperMix 25 μL、Forward/Reverse Primer（10 μmol/L）2 μL、cDNA 模板2 μL。PCR 反應程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，35 個循環后，72 ℃延伸5 min。對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳及膠回收?；厥盏哪康钠渭敖湍刚T餌載體pGBKT7 用限制性內切酶NdeI 和BamHI 進行酶切?；厥彰盖挟a物并與T4-DNA 連接酶連接后轉化大腸桿菌DH5α 感受態細胞。將培養的單克隆送至測序公司測序，測序正確的克隆命名為pGBKT7-P5并提取質粒。

1.2.2 誘餌載體的毒性及自激活檢測 利用PEG/LiAc 法將誘餌質粒pGBKT7-P5和空載體pGBKT7 分別轉化Y2H Gold 感受態細胞，涂布在SD/-Trp 平板上，30 ℃培養2～3 d，觀察菌落的生長情況，若pGBKT7-P5在SD/-Trp 平板上的生長速度比對照pGBKT7慢或者不長，說明誘餌蛋白對酵母菌有毒性，反之沒有毒性。將pGBKT7-P5與空載體pGADT7共轉化Y2H Gold感受態細胞，同時轉化陽性對照pGADT7-T/pGBKT7-53 和陰性對照pGADT7-T/pGBKT7-Lam，分別涂布在SD/-Trp/-Leu 平板上，30 ℃培養2～3 d。挑取單菌落畫線于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal 平板上，培養3～5 d，觀察酵母菌的生長狀況和顯色情況，若P5 蛋白有自激活活性，那么pGBKT7-P5/pGADT7能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上生長并顯色；反之沒有自激活。

1.2.3 酵母cDNA 文庫的篩選 挑取含誘餌載體pGBKT7-P5的酵母單菌落制備感受態細胞。取50 μL本氏煙cDNA文庫質粒，采用醋酸鋰法將文庫質粒轉化到酵母感受態細胞中并涂布在SD/-Leu/-Trp平板上，30 ℃培養箱培養5～7 d長出單菌落。挑取單菌落溶于無菌水，稀釋混勻后依次劃線在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal 培養基上培養，觀察菌落生長狀態和顯色反應，篩選陽性菌落。

1.2.4 酵母質粒提取及序列分析 挑取SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal培養基上藍變菌落接種于5 mL SD/-Leu/-Trp 液體培養基中，30 ℃ 220 rpm/min 培養2 d 后提取酵母質粒。以酵母質粒為模板，利用pGADT7載體的通用引物進行PCR 擴增。PCR 反應體系和程序同1.2.1。電泳后檢測文庫插入片段的大小。將酵母質粒轉化到大腸桿菌DH5a 感受態細胞中進行培養，提取質粒并測序。對測序結果進行分析，用軟件EditSeq分析插入序列的大小、編碼框順序、氨基酸的大小。將分析后的氨基酸序列輸入NCBI數據庫中進行序列比對，分析cDNA插入片段的完整性，尋找同源基因的序列信息，獲得序列的基因注釋和基因編號。

2 結果與分析

2.1 RGSV P5基因的擴增及酵母表達載體的構建

提取水稻毒株的總RNA，利用引物BD-P5-F/R進行RT-PCR擴增，獲得一條大小約為600 bp的特異性條帶，符合預期片段大?。?76 bp）（圖1-A）。將P5基因克隆到pEASY-blunt Zero 載體上，測序結果表明成功獲得該基因。利用限制性內切酶NdeI和BamHI對該質粒進行酶切回收后連接到酵母誘餌表達載體pGBKT7 上，利用相同限制性內切酶對重組質粒進行雙酶切驗證，結果表明成功構建誘餌質粒pGBKT7-P5（圖1-B）。

圖1 RT-PCR擴增P5基因（A）和誘餌載體pGBKT7-P5（B）的酶切鑒定Fig.1 The amplication of P5 gene and digestion of pGBKT7-P5

2.2 pGBKT7-P5自激活及毒性檢測

將誘餌載體pGBKT7-P5、pGBKT7（空對照）分別轉化到Y2H Gold 感受態細胞中，比較兩者在SD/-Trp 培養基上的生長情況，發現兩者菌落均為白色，且生長情況無明顯差異，含pGBKT7-P5的酵母未比空對照生長緩慢，表明P5 蛋白對酵母菌沒有毒性（圖2-A，圖2-B）。將誘餌質粒pGBKT7-P5與捕獲載體pGADT7 共轉化到Y2H Gold 中，同時分別轉化陽性和陰性對照，比較3 組含重組質粒的酵母在SD/-Leu/-Trp 和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal 培養基上的生長和顯色情況，發現3 組酵母菌均能在SD/-Leu/-Trp 培養基上生長（圖2-C），但僅陽性對照可在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal 上生長并顯色（圖2-D）。說明P5沒有自激活活性，可用于酵母互作驗證及文庫篩選。

圖2 誘餌載體pGBKT7-P5的毒性和自激活檢測Fig.2 Detection of toxicity and auto-activation of pGBKT7-P5

2.3 文庫篩選與互作蛋白的鑒定

將本氏煙cDNA 文庫質粒轉化到含誘餌載體pGBKT7-P5的酵母感受態細胞中，轉化產物涂布到SD/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal 培養基上進行依次篩選，得到15個生長良好且顯藍色的菌落（圖3）。將這15個菌落分別挑至SD/-Leu/-Trp 液體培養基培養2 d 后提取質粒。以酵母質粒為模板，利用pGADT7 載體的通用引物進行PCR 擴增（圖4）。將PCR 擴增條帶大于500 bp，且條帶單一的質粒轉化大腸桿菌并送至測序公司測序。對所得的測序結果先利用EditSeq 軟件進行序列分析，確定插入文庫中的序列大小、編碼框順序和氨基酸大小。將分析后的氨基酸序列在NCBI 數據庫中進行Blast 分析，最后獲得7個與RGSV P5互作的寄主蛋白，分別為線粒體孔蛋白（mitochondrial outer membrane protein porin，VDAC）、ADP 核糖基化因子GTP 水解酶激活蛋白（ADP-ribosylation factor GTPase-activating protein，ArfGAP）、囊泡突觸結合蛋白（synaptotagmin-1-like）、延伸因子1a（elongation factor 1-alpha，NbeEF1A）、脯氨酸合成酶共轉錄的細菌同源蛋白（Proline synthase co-transcribed bacterial homolog protein-like）、非特征蛋白質C9orf78（uncharacterized protein C9orf78 isoform X2）和一種未知蛋白（表1）。

表1 與RGSV P5互作的7個候選蛋白Tab.1 Seven candidate proteins that interacted with P5 of RGSV

圖3 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal培養基篩選與P5互作的陽性克隆Fig.3 Screening positive clones by SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal interacting with P5

圖4 陽性克隆的檢測Fig.4 PCR detection of positive clones

3 結論與討論

水稻草狀矮化病是水稻上發生嚴重的病毒病，至今無有效的防治方法。研究水稻草狀矮化病毒與寄主的互作，為深入解析RGSV 病毒的致病機制，為水稻草狀矮化病毒的防治奠定基礎。本研究成功篩選到了7 個與RGSV P5 互作的寄主蛋白，它們都具有重要的生物學功能，可能參與寄主抗病防御、病毒復制、運動和致病等過程。

植物病毒的侵染會誘導寄主抗病毒RNA 沉默，而絕大多數的植物病毒能編碼RNA 沉默抑制子抑制沉默。許多病毒的沉默抑制子陸續被鑒定。如RSV 編碼的P2、NS3 蛋白均具有RNA 沉默抑制活性，P2與水稻OsSGS3 互作干擾水稻的RNA 沉默途徑，NS3 通過自身互作抑制RNA 沉默，從而對抗宿主防御[16-18]。瓜類褪綠黃化病毒（CCYV）的RNA1 編碼的P22 蛋白是一個局部RNA 沉默的抑制因子[19]。豌豆輕型褪綠病毒（PMCV）編碼的P0 蛋白具有沉默抑制子活性，P0 促進AGO1 的降解以抑制RNA 沉默[20]。柑橘黃花葉?。–MBV）具有6 個開放閱讀框，而其中的ORFI 被鑒定具有RNA 沉默抑制活性[21]。P5 是RGSV 的沉默抑制子，能夠抑制寄主對病毒的沉默[9]。因此本試驗以P5蛋白為誘餌，篩選本氏煙酵母cDNA文庫，以期獲得互作的寄主蛋白，為該病毒防治提供策略。

本試驗成功篩選到了7 個與RGSV P5 互作的寄主蛋白，分別為VDAC、ArfGAP、Syt-2、eEF1A、C9orf78、PROSC 和一種暫無注釋蛋白。VDAC 是電壓依賴性陰離子通道蛋白，存在于真核生物線粒體外膜上，具有高度保守性[22]。VDAC 在調控線粒體與細胞質之間的代謝物質流動、ATP 合成和細胞死亡中具有重要的作用[23-25]。有研究[26]表明VDAC 參與抗逆、植物防御等，且受多種脅迫的誘導表達。如水稻VDACs1-3受到滲透、NaCl和干旱脅迫上調表達。煙草線粒體孔蛋白NtVDAC1和NtVDAC2受非寄主菌菊苣假單細胞菌（Pseudomonas cichorii）的誘導表達，將該基因抑制或沉默，降低煙草對非宿主菌的抗性，表明VDAC 參與了對非宿主病原體的防御和bax 介導的細胞死亡[27]。VDAC 與P5 互作可能在植物抗病中發揮重要的作用。eEF1A 是一個轉錄延伸因子，有很多研究表明eEFA1 在負鏈RNA 病毒的復制中發揮重要作用，促進病毒翻譯、復制、侵染等過程。Komoda 等[28]發現加入eEF1a 抑制劑會降低番茄斑萎病毒（TSWV）的RNA 合成活性，降低TSWV 的侵染，表明eEF1A 在TSWV 的RNA 合成中起著重要作用。沉默煙草eEF1a 基因家族的一個分支能顯著抑制TSWV 的積累和癥狀的發展，也表明eEF1A 基因有利于TSWV 的發生[29]。eEF1A-a1、eEF1A-a5 與TSWV NSm 蛋白互作可能參與病毒的復制[30]。推測RGSV 與eEF1A的互作也可能參與病毒的復制。

Syt 是一個廣泛存在于神經和內分泌細胞內的分泌囊泡上的蛋白質家族[31]。在動物中，Syt 不僅可以調節囊泡與靶膜的融合過程，調控神經遞質和激素的釋放，還能夠調節細胞的蛋白質與膜的轉運[32]。擬南芥的SYTA 蛋白能夠調節胞吞和改變胞間連絲促進病毒的胞間運動[33-34]。例如SYTA 與蕪菁脈明病毒（TVCV）的運動蛋白MP 互作，MP 將內質網上的SYTA 招募到胞間連絲上，MP、SYTA 和TVCV 共同形成復制復合體，有利于病毒的運動[35]。P5 與囊泡突觸蛋白Syt-2 互作可能參與病毒的胞間運動。

ArfGAP 是一種囊泡運輸調節因子，在膜轉運中發揮著重要的作用[36]。Zhang 等[37]從水稻中克隆了1 個ArfGAP 基因OsAGAP，并推測OsAGAP 通過調控水稻中的囊泡運輸，影響生長素的極性運輸。煙草的1 個GAP 蛋白NbRabGAP1 參與了竹子花葉病毒（Bamboo mosaic virus，BMV）的胞間運動[38]。紅三葉草壞死花葉病毒（RCNMV）的復制蛋白P27 可以與Arf1 互作并在內質網上形成大的點狀結構。利用Arf1 的交換因子的抑制劑會破壞病毒復制復合體的組裝及P27 介導的內質網重構，影響RCNMV 的復制[39]。推測P5 與ArfGAP 的互作參與病毒的復制和運動。由此可見，研究RGSV P5 與寄主蛋白的互作具有重要的生物學意義。本研究為解析寄主抗病和RGSV 致病的分子機制提供理論基礎，為RGSV 的防治提供參考。

致謝：江西省教育廳基金項目（GJJ170293）同時對本研究給予了資助，謹致感謝！