基于網絡藥理學和分子對接分析的“金銀花-連翹”藥對治療藥物誘導急性腎損傷的作用機制研究

郭 佳，方胡鳳，蘇 丹，楊 浩

（1．天津市中醫藥研究院附屬醫院，天津 300120； 2.南京醫科大學附屬常州第二人民醫院，常州 213000）

臨床中急性腎損傷是一個長期被關注的問題，主要表現為腎小管壞死、腎小球血流動力學改變、腎小球血漿流量和超濾系數降低等癥狀［1］。據統計發現，在我國急性腎損傷中，因藥物引起的急性腎損傷病例占比在過去10 年從26.5%上升到42.9%，已造成嚴重的醫療負擔［2］。同時，藥物誘導急性腎損傷也成為藥物研發失敗和藥品撤市的最常見原因之一［3］。據報道［4］，多種藥物均可導致急性腎損傷，包括抗癌藥物（順鉑）、氨基糖苷類（慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素或妥布霉素）、兩性霉素B、抗病毒藥物（阿德福韋、西多福韋或替諾福韋）、放射對比劑、雙磷酸鹽等。盡管急性腎損傷的血液凈化治療和化學藥物治療手段在不斷進步，但其發病率和病死率仍然很高，如何有效緩解藥源性急性腎損傷越來越受到臨床醫師們的關注。

隨中醫藥現代化進程的推進，轉向傳統醫學中尋找可替代的藥物治療越來越受到重視。藥源性急性腎損傷在疾病早期常表現腎失開闔，濕熱、濁毒內生，上犯中焦，脾胃升降、運化功能失常。中醫基本治法主要為清熱解毒、通腑泄濁、活血化瘀［5］?！敖疸y花-連翹”藥對是治療溫病最常用的藥對之一，根據中醫配伍理論，二者配伍屬于七情配伍中的相須，即二者配伍可以增強清熱解毒、疏風散熱之功效［6］。臨床上，中醫師善用“金銀花-連翹”藥對緩解早期藥源性急性腎損傷：如劉旭生教授巧用“金銀花-連翹”藥對結合半夏瀉心湯與解毒活血湯，緩解患者因乙酰唑胺導致的急性腎損傷，療效顯著［5］；呂承全老中醫重用金銀花、連翹蒲公英等清熱解毒藥治療熱毒熾盛、腎失開闔型急性腎衰［7］。整體觀念和辨證論治是中醫特色所在，用藥遵循多成分、多靶點、多途徑調節的理念［8］。而如何科學地闡釋“金銀花-連翹”配伍治療早期藥源性急性腎損傷中的成分-靶點-疾病之間關系，仍有待進一步研究。

網絡藥理學是基于系統生物學理論，強調對某種通路的多途徑調節，通過構建各成分間網絡來分析其相互作用，關注網絡中的關鍵節點，可系統闡述中藥及復方的物質基礎及分子機制［9］。這與中醫學整體觀念、辨證論治的角度去診治疾病的理論、中藥及其方劑的多成分、多途徑、多靶點協同作用特點相吻合［10］。網絡藥理學也因此成為系統性分析中藥復方多靶點、多通路作用機制的有效工具。因此，本研究擬基于網絡藥理學研究方法，篩選出“金銀花-連翹”藥對治療早期藥物誘導急性腎損傷的活性成分，預測其關鍵靶點和可能作用通路，以期為臨床應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 “金銀花-連翹”藥對活性成分的篩選和靶點預測 利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索金銀花和連翹的全部化學成分，依據藥物代謝動力學（absorption，distribution，metabolism and excretion，ADME） 參數篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 的活性化合物。運用TCMSP 靶點預測模塊對篩選的活性成分作用靶點進行預測。并利用Uniprot（https：//www.uniprot.org）將所得到的靶點進行統一規范處理。

1.2 “金銀花-連翹”藥對“活性成分-靶點”網絡的構建 通過軟件Cytoscape 3.7.2（https：//www.bootcdn.cn/cytoscape/3.7.2）構建“金銀花-連翹”藥對“活性成分-靶點”網絡，其中，使用“節點”（node）表示成分或靶點，用“邊”（edge）表示二者之間的關系；采用軟件內置Network Analyzer 分析工具分析網絡特征，包括連接度（degree）、介度（betweenness） 及緊密度（closenesss）等，研究“金銀花-連翹”藥對中活性成分與靶點及其之間的關系。

1.3 藥物誘導急性腎損傷相關靶點的收集 以“drug induced acute kidney injury”為關鍵詞，在Genecards（https：//www.genecards.org）、OMIM（https：//omim.org）等疾病數據庫進行檢索。在Genecards 數據庫中，Score 值越高則代表該靶點與疾病聯系密切。根據經驗，若靶點過多則設定Score 大于中位數的目標靶點為腎損傷的潛在靶點，合并2 個疾病數據庫靶點后，刪除重復值得到藥物誘導急性腎損傷相關靶點。

1.4 韋恩圖的繪制以及靶點相互作用網絡（PPI）的構建 為獲得“金銀花-連翹”藥對治療藥物誘導急性腎損傷的潛在作用靶點，通過Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）軟件獲得疾病靶點與藥物靶點的交集，并繪制韋恩圖進行比較。為明確“金銀花-連翹”藥對的潛在治療藥物誘導急性腎損傷作用靶點以及靶點之間的相互作用，將交集靶點導入STRING 11.5（https：//cn.string-db.org）數據庫構建蛋白相互作用網絡模型即PPI 網絡模型，將生物種類設定為“Homo sapiens”，其余設置均為默認設置，得到PPI 網絡，并通過Cytoscape 3.7.2 軟件內置Network Analyzer 工具分析PPI 網絡特征，判斷“金銀花-連翹”藥對與疾病關聯緊密的核心靶點。

1.5 通路富集分析 將“金銀花-連翹”藥對治療藥物誘導急性腎損傷的靶點錄入Metascape 平臺（http：//metascape.org/gp/index.html），設置P＜0.01，分析其主要的生物學過程與代謝通路并進行富集分析，保存數據結果并采用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn）對數據進行可視化處理。

1.6 “金銀花-連翹”藥對治療藥物誘導急性腎損傷的成分-靶點-信號通路網絡構建 分析KEGG 通路富集結果，收集與疾病相關的通路，選取排名前20 通路上的靶標，并將這些靶標與相應的活性成分對應，通過Cytoscape 3.7.2 軟件繪制“活性成分-靶點-信號通路”網絡關系圖。

1.7 “金銀花-連翹”藥對治療藥物誘導急性腎損傷的主要活性成分和潛在作用靶標蛋白分子對接驗證 選取“金銀花-連翹”藥對活性成分-靶點網絡圖中度值排名靠前的活性成分和作用靶標PPI 網絡中核心基因進行分子對接。從TCMSP 和RCSB PDB 數據庫（https：//www.rcsb.org）分別獲取“金銀花-連翹”藥對化學成分的分子結構和靶標蛋白分子結構，通過SYBYL-X 2.0 軟件（Tripos Inc.，St. Louis，MO）進行分子對接，并將對接得分較高的化合物與靶標蛋白進行可視化分析。

2 結果

2.1 “金銀花-連翹”藥對活性成分及靶點獲取 從TCMSP 數據庫中初步獲取金銀花成分236 種，連翹化學成分150 種，經ADME 篩選以及剔除未查詢到靶點的成分，最終獲得金銀花活性成分17 種，連翹活性成分19 種，兩者共有成分4 種（見表1）。金銀花有效成分作用靶點基因204 個，連翹有效成分靶點基因217 個，合并后刪除重復值共獲得靶點基因230 個。

2.2 “金銀花-連翹”藥對“活性成分-靶點”網絡的構建及分析 采用Cytoscape3.7.2 對“金銀花-連翹”活性成分及其作用靶點的關系網絡進行繪制（見圖1），網絡中共有264 個節點（其中包含32 個活性成分、230 個靶點和2 個藥物）與916 條關系。圖中節點的大小代表相應的度值，節點面積越大代表度值越大，表示涉及的生物功能越多，其生物學重要性越高。其中依據度值排序，排序靠前的主要為槲皮素（D）、山柰酚（B）、木犀草素（C）、β-谷甾醇（A）、漢黃芩素（LQ1）、豆甾醇（JYH13）等。

2.3 藥物誘導急性腎損傷相關靶點的獲取 檢索Genecards 數據庫，得到疾病靶點7 011 個，根據相關性分數中位數多次篩選，最終篩選出相關性分數＞18 的靶點作為藥物誘導急性腎損傷潛在靶點。檢索OMIM數據庫，獲得疾病相關靶點392 個。合并兩個數據庫疾病靶點，刪除重復值，最終獲得1 400 個疾病靶點。

2.4 韋恩圖的繪制以及靶點相互作用網絡（PPI）的構建 將篩選的“金銀花-連翹”藥對活性成分靶點與藥物誘導急性腎損傷疾病靶點取交集，通過Venny 2.1.0繪制韋恩圖（見圖2），得到交集靶點151 個。將交集靶點提交到STRING 11.5 平臺，將生物種類設定為“Homo sapiens”，其余設置均為默認設置，得到PPI 網絡（見圖3），并通過Cytoscape 3.7.2 軟件內置Network Analyzer 工具，根據靶點度值中位數多次篩選，最后篩選出度值大于83 的核心蛋白共21 個，包括：AKT1、TP53、IL6、VEGFA、TNF、JUN、CASP3、ESR1、EGFR、IL1B、CTNNB1、MYC、HIF1A、EGF、PTGS2、CCND1、MMP9、PTEN、FOS、FN1、PPARG（見圖4），說明這些靶點在緩解藥源性急性腎損傷中發揮重要的作用。

表1 “金銀花-連翹”藥對活性成分

圖1 “金銀花-連翹”藥對活性成分-靶點網絡圖

圖2 “金銀花-連翹”藥對-藥物誘導急性腎損傷疾病靶點韋恩圖

圖3 “金銀花-連翹”藥對治療藥物誘導急性腎損傷的靶點PPI 網絡

圖4 核心靶點PPI 網絡圖

2.5 靶點功能與通路的富集分析 利用Metascape平臺對上述151 個關鍵靶點進行基因富集分析，包括GO 的生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cellular component，CC）分析。生成結果按P 值從小到大排序，選取前20條利用微生信平臺對數據進行可視化，見圖5A、5B、5C，表明“金銀花-連翹”藥對治療藥物誘導急性腎損傷主要涉及的生物過程有對外源生物刺激的反應、凋亡信號通路、對氧響應、損傷響應、生長因子響應、細胞成分運動及細胞黏附等。同樣地，KEGG 富集分析中，選取與藥物誘導急性腎損傷相關的前20 條進行可視化分析，其中，“金銀花-連翹”藥對治療藥物誘導急性腎損傷主要參與的信號通路包括：磷脂酰肌醇3 激酶-AKT 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、絲裂原活化蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）、IL-17 信 號 通 路、細 胞 凋 亡（Apoptosis）、p53 信號通路（p53 signaling pathway）、低氧誘導因子-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、NF-κB信號通路（NF-kappa B signaling pathway）、血管內皮生長因子信號通路（VEGF signaling pathway）、Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子信號通路（Jak-STAT signaling pathway）等，見圖5D。

2.6 “金銀花-連翹”藥對活性成分-靶點-信號通路網絡構建 采用Cytoscape 3.7.2 軟件構建“金銀花-連翹”藥對“活性成分-靶點-信號通路”網絡（見圖6）。結果顯示，“金銀花-連翹”藥對通過29 個關鍵活性成分，作用于121 個潛在靶點，調控20 條不同的藥物誘導急性腎損傷信號通路，體現了中藥多成分、多靶點、多通路治療藥物誘導急性腎損傷的作用機制。

2.7 分子對接 在PPI 網絡中，治療藥物誘導急性腎損傷的關鍵靶點蛋白主要有AKT1、TP53、IL6、VEGFA、TNF、JUN、CASP3、ESR1，將其分別與6 個主要活性成分槲皮素（D）、山柰酚（B）、木犀草素（C）、β-谷甾醇（A）、漢黃芩素（LQ1）、豆甾醇（JYH13）進行分子對接，對接結果見表2。通常Total-Score 得分大于4.25 的結果被認為具有對接活性，得分越高活性越強。將Total-Score 對接得分，使用微生信平臺繪制熱圖，結果見圖7?？梢钥闯?，CASP3 與6 種主要成分的對接活性都表現出一定優勢，VEGF 與山柰酚、β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇也表現出較高活性，IL6、ESR1、JUN、TP53 與山柰酚和槲皮素的對接活性均較高。將其中對接得分大于5.7 的最佳構象使用SYBYL-X 2.0 軟件可視化，結果見圖8。

圖5 “金銀花-連翹”藥對治療藥物誘導急性腎損傷的GO 功能及KEGG 通路富集分析

圖6 “金銀花-連翹”藥對治療藥物誘導急性腎損傷活性成分-靶點-信號通路圖

表2 “金銀花-連翹”藥對主要活性成分與靶標蛋白分子對接得分

圖7 分子對接結果得分計算熱圖

圖8 關鍵靶基因與“金銀花-連翹”藥對主要活性成分對接模式圖

3 討論

中醫古籍中很早就有關于急性腎損傷的記載，根據其少尿或無尿、惡心嘔吐、水腫等急驟而突出的癥狀，歸在“癃閉”“關格”“水胖”“溺毒”“腎風”等疾病范疇內［11］。根據中醫病因病機及疾病的發展，外邪侵襲臟腑，導致肺、脾、腎之功能異常，肺之治節無權，脾之健運失司，腎之開闔無度，加之膀胱氣化功能失常，水濕濁邪不能排出體外，從而發為本?。?2］，藥源性急性腎損傷在初期往往以邪實為主，正虛為次，治療上以祛邪為主，佐以扶正，以清熱解毒、通腑化濁、活血化瘀為基本法則［13］?！敖疸y花-連翹”為中醫臨床清熱解毒常用藥對，《本草新編》記載金銀花“無經不入，而其專入之經，尤在腎、胃二經”，“欲既消胃毒，而又消腎毒之藥，舍金銀花，實無第二品也”；連翹為升科要藥，“化毒必須用金銀花，連翹以為佐使，則攻邪有力，又未必無小補也”。兩者常相須為用，既有清涼透瀉、清熱解毒的作用，又有芳香避穢的功效，在透解衛氣分邪毒的同時，兼顧了溫熱病邪多挾穢濁之氣的特點［14］。

本研究利用網絡藥理學方法，共收集了“金銀花-連翹”藥對活性成分32 種，基于對“金銀花-連翹”藥對活性成分-靶點網絡的分析，度值排列靠前的成分主要有槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、漢黃芩素等，表明這些成分可能是“金銀花-連翹”藥對藥理活性主要成分。緩解急性腎損傷相關研究基礎表明，槲皮素可通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路保護脂多糖誘導的小鼠急性腎損傷［15］。山柰酚可下調炎癥蛋白HMGB1、TLR4 和P2X7 受體，對急性腎損傷具有顯著的保護作用［16］。木犀草素可通過降低腎中炎癥和凋亡因子［17］、調節p53 依賴的凋亡通路［18］、Kim-1/NF-kappa B/Nrf2 信號通路［19］等多種途徑改善藥物誘導急性腎損傷。β-谷甾醇能上調超氧化物歧化酶和谷胱甘肽活性，使丙二醛水平降低，同時下調腫瘤壞死因子α 和白細胞介素-6 水平，上調內皮型一氧化氮合酶水平，通過限制炎癥反應和氧化應激治療急性腎損傷［20］。漢黃芩素可靶向調節ripk1 介導的壞死［21］，通過影響PPAR-γ、炎癥、凋亡和Wnt/β-catenin 通路［22］等多種途徑緩解順鉑誘導的急性腎損傷。

通過對交集靶點的PPI 網絡進行分析，以度值中位數為卡值，篩選出21 個核心靶點，其中度值較大的AKT1、TP53、IL6、VEGFA、TNF、JUN、CASP3、ESR1 等靶蛋白可能是“金銀花-連翹”藥對緩解藥物誘導急性腎損傷的關鍵作用靶點。AKT 又稱為蛋白激酶B，在細胞自噬中起到重要作用，自噬是一種維持細胞內穩態的動態分解代謝過程，與急性腎損傷的發病機制密切相關，研究發現AKT 可通過參與PI3K/Akt 信號通路調節細胞自噬能力，從而緩解順鉑引起的急性腎損傷［23］。同時TP53 蛋白也在調節自噬方面發揮重要作用［24］。炎癥反應是藥物所致急性腎損傷的特征性病理改變之一［25］，龔琴等［26］通過4 種藥物誘導動物產生急性腎損傷，并觀察比較了腎臟相關炎性壞死因子表達的變化，結果發現IL6、TNF、CASP3 蛋白明顯上調，采取措施抑制3 種蛋白表達后，可明顯緩解藥源性急性腎損傷，說明IL6、TNF、CASP3 蛋白可調節和控制炎癥反應，在腎損傷修復中發揮一定的作用。VEGFA 是一種內皮生長因子及血管通透性的調節因子，目前已被證實是一種具有腎臟保護功能因子［27］。JUN 是MAPK 信號通路的重要成員，在細胞增殖、分化、存活和凋亡過程中發揮重要作用，與急性腎損傷病程的發展密切相關，目前已有研究發現JUN 可參與JNK/CJUN 途徑調節慶大霉素誘導的腎損傷［28］。有研究表明［29］由ESR 主導的雌激素受體信號通路在維持線粒體穩態中起著至關重要的作用，雌激素可通過受體參與腎臟的修復與再生，ESR1 基因的多態性也與腎臟疾病的易感性和預后有關。

通過生物富集分析可知，生物學進程包括外源生物刺激的反應、對氧響應、損傷響應、生長因子響應、凋亡信號通路、細胞成分運動及細胞黏附等，主要涉及激酶結合、磷酸酶結合、氧化還原酶活性、細胞因子受體結合等方面的功能。經KEGG 富集分析可推斷，“金銀花-連翹”緩解藥物誘導急性腎損傷的信號通路主要與凋亡、氧化應激、血管生成、炎癥反應相關，如細胞凋亡信號通路、MAPK 信號通路、p53 信號通路、血管內皮生長因子信號通路、HIF-1 信號通路等。順鉑誘導的急性腎損傷涉及多種細胞凋亡途徑，腎毒性的發生與Caspase 依賴性和非依賴性途徑誘導細胞凋亡有關［30］。高歡［31］通過凋亡通路相關蛋白的表達情況，證實了藥物干預抑制Caspase-3 的剪切和活化，降低促凋亡蛋白Bax 的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，可有效減輕順鉑對于HK-2 細胞的細胞毒作用，改善細胞形態，提高細胞活力。研究［32］表明，MAPK 家族成員細胞外信號調節激酶（ERK1/2）、p38MAPK 與慶大霉素、順鉑等具有腎臟毒性藥物引起的AKI 關系密切，抑制p38MAPK 和ERK1/2 的表達，可有效改善炎癥反應以及降低氧化應激損傷。p53是一種腫瘤抑制基因，通過轉錄激活參與細胞周期和細胞凋亡等過程，近年研究發現p53 在急性腎損傷的損傷和修復中發揮重要作用：龍泓伶等［33］總結發現，p53 是加重急性腎損傷的重要因素，主要通過調節細胞自噬、促進細胞凋亡、加重細胞周期組織等方式促進急性腎損傷的進展，馮娟等［34］證明，抑制p53 的表達，可減輕順鉑治療乳腺癌引起的急性腎損傷。血管內皮生長因子（VEGFA）是機體內血管生成過程中的必不可少的調控因子，并且在腎小球的發育以及維持腎小球穩態方面都起著重要作用［35］。VEGFA 作為VEGF家族的重要一員，已經被發現在腎臟血管網系統的形成和發育階段發揮關鍵性作用［36］。同時VEGFA 也是HIF 的一個靶基因，HIF-1α 在多種誘因誘發的急性腎損傷中對腎組織起到保護作用，缺血預處理后高表達的HIF-1α 可能通過促進血管內皮生長因子VEGF和葡萄糖轉運蛋白Glut-1 的表達，促進腎臟缺血后微循環的重建，改善缺氧細胞的氧利用障礙，提高腎小管上皮細胞的氧供和能量代謝，增強耐缺血缺氧能力，為腎臟結構和功能的維持創造條件［37］。綜上所述，與修復腎損傷相關的通路主要與免疫反應、炎癥反應、凋亡、氧化應激有關，因此推測“金銀花-連翹”可能通過細胞凋亡信號通路、MAPK 信號通路、p53 信號通路、血管內皮生長因子信號通路、HIF-1 信號通路等干預藥源性急性腎損傷。

分子對接結果顯示CASP3 與多個核心成分均具有對接活性，特別是槲皮素、β-谷甾醇、漢黃芩素與CASP3 的對接得分均大于6，表現出更強的對接活性。除此之外，對接得分大于6 的還有VEGF 與山柰酚的對接。這提示“金銀花-連翹”藥對緩解藥物誘導急性腎損傷的可能機制是通過槲皮素、β-谷甾醇、漢黃芩素、山柰酚等活性成分，結合CASP3、VEGF 等靶點通過調控細胞凋亡、炎癥反應、血管生成等相關通路，促進損傷腎細胞的修復與生長。進一步驗證了網絡藥理學所得出的結果。

4 結語

本研究采用網絡藥理學方法從系統層面分析了“金銀花-連翹”藥對與藥物誘導急性腎損傷的關系，篩選出藥對活性成分32 種，活性成分緩解藥源性急性腎損傷的核心靶點21 個。運用生物富集與分子對接，初步預測了藥對干預藥源性急性腎損傷的可能作用機制：通過槲皮素、β-谷甾醇、漢黃芩素、山柰酚等活性成分，結合CASP3、VEGF 等靶點調控細胞凋亡、炎癥反應、血管生成等相關通路，促進損傷腎細胞的修復。本研究為今后進一步從分子生物學驗證和更深入闡述其藥理作用機制提供了思路和依據。