CWF19L1抑制細胞周期以抑制膠質瘤細胞的增殖和遷移

劉俊哲,王利平,雷錕堅,羅 敏,楊新宇,楊璐菲,葉敏華

(1.南昌大學第二附屬醫院神經外科,南昌 330006; 2.婺源縣人民醫院神經外科,江西 上饒 333200)

膠質瘤是成年人中最常見的顱內腫瘤之一[1],主要起源于神經膠質細胞,具有高度的侵襲性,易在顱內進行廣泛播散,患者的預后通常很差,中位生存時間僅為12個月甚至更少[2]。臨床上對膠質瘤常用的治療手段為外科手術切除,加以輔助放化療,但由于其在顱內播散廣泛,難以通過手術治療進行腫瘤全切[3]。此外,膠質瘤對放化療易產生抗性的特征也使得術后的放化療難以獲得滿意的療效,探索新的診斷及預后標志物及治療靶點對膠質瘤的診治具有重要的參考意義[4]。

細胞周期紊亂是腫瘤發生發展的重要因素,通過調控細胞周期能為腫瘤發展及治療提供新的治療方向,而細胞周期調控分子的研究可為特異性靶向藥物的篩選與研發提供依據。大量研究[5-6]證明,抑癌基因編碼的蛋白質對于細胞周期過程有關鍵的調控作用,被證明與細胞周期密切相關。在本課題組前期研究[7]中已經表明CWF19L1(CWF19 Like cell cycle control factor 1)在膠質瘤的進展中參與關鍵的調控作用,但其具體作用機制尚未被完全揭示,本文進一步設計相應實驗,探究CWF19L1對細胞周期的影響以及在腫瘤細胞增殖,遷移與浸潤中的作用,進而影響其惡性進展,為進一步探索針對膠質瘤治療尋找新的靶點和診療思路。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料與儀器

人正常神經細胞SVG、人胚腎細胞HEK293T和膠質瘤細胞系U87、T98、U118、LN229及U251均購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。DMEM、MEM培養基、opti-MEM培養基及0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco生物科技公司。胎牛血清購買自蘇州依科賽生物科技公司,CWF19L1、GAPDH單克隆抗體山羊抗兔與山羊抗鼠二抗購自美國Proteintech公司;細胞周期試劑盒、CCK-8試劑盒及BCA試劑盒購買自上海碧云天生物技術有限公司,超敏化學發光檢測試劑盒(Super ECL Plus)購自蘇州優逸蘭迪生物科技有限公司,sh-NC、sh-CWF19L1-1、sh-CWF19L1-2、sh-CWF19L1-3慢病毒質粒購自吉凱基因生物科技有限公司,LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen生命技術有限公司。本研究使用的主要儀器有低溫高速離心機(美國Thermo Fisher生物科技公司)、超凈工作臺(蘇潔凈化設備有限公司)、熒光顯微鏡(德國Leica公司)、流式細胞儀(美國Beckman公司)、多功能酶標儀(美國Thermo Fisher生物科技公司)、細胞培養箱(美國BD公司)、細胞計數儀(江蘇卓微生物科技有限公司)、蛋白質電泳儀(美國Bio-Rad公司)等。

1.2 細胞培養

除U87細胞培養于含10% FBS的MEM培養基外,上述其余細胞系均培養在含10%FBS的DMEM培養基中,培養環境為37 ℃,5% CO2。細胞鋪板后,均待其進入對數生長期再進行操作。細胞消化均使用含有EDTA的0.25%胰蛋白酶,37 ℃ 環境下消化3 min,等量完全培養基中止消化,離心后取得細胞沉淀以進行后續實驗。

1.3 慢病毒包裝

在六孔板上進行HEK293T細胞鋪板,使用慢病毒包裝體系(psPAX2、pMD2.0+慢病毒質粒)進行慢病毒的包裝,使用LipofectamineTM3000轉染試劑進行質粒共轉,轉染后6 h換液,去除轉染試劑后36 h收集上清,即為病毒溶液。將收集的病毒溶液通過0.22 μm細胞篩進行過濾,使用慢病毒濃縮試劑盒進行慢病毒濃縮后置于-20 ℃冰箱備用。

1.4 穩轉細胞系構建

將U251膠質瘤細胞接種于六孔板中,細胞生長至50%～60%密度時進行慢病毒轉染操作。將收集的慢病毒溶液加入六孔板中進行孵育,12 h后進行細胞換液重置培養箱中培養,待細胞長至適宜密度使用嘌呤霉素進行細胞篩選。收集篩選后的穩定CWF19L1敲低細胞系進行大量擴增并部分在-80 ℃冰箱中凍存備用,同時保留部分細胞進行后續實驗。

1.5 蛋白質提取及蛋白質印跡法(WB)實驗

待CWF19L1敲低穩轉細胞和陰性對照未做處理的細胞生長至合適濃度時,用RIPA細胞/組織裂解液裂解細胞,使用超聲破碎儀進行細胞破碎,提取細胞蛋白質通過BCA法測定蛋白質濃度。進行WB實驗時,每孔的上樣量為30 μg,以確定蛋白質電泳時蛋白質樣品的上樣量。將樣品蛋白與loading buffer進行混合,置于100 ℃金屬浴鍋中煮沸至蛋白質變性,置于-20 ℃保存備用。WB實驗采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,每孔上樣量為30 μg。電泳條件分別為濃縮膠:90 V、30 min;分離膠:120 V、60 min,待電泳結束后,用濕轉法將分散開的電泳蛋白質轉移到事先用甲醇溶液激活的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,轉膜條件為400 mA、60 min。轉膜完成后用5%脫脂牛奶將膜封閉4 h,之后用1：10 000稀釋的CWF19L1單克隆抗體在4 ℃ 條件下進行過夜孵育。次日,TBST清洗3次后,用山羊抗兔抗體(1：3000)孵育4 h,繼續用TBST清洗3次,最后在顯影液中孵育并通過顯影儀(Tanon-5200Multi)在暗室中進行熒光拍照。將最終獲得的圖像用ImageJ軟件進行灰度值讀取,并取GAPDH作為內參對照對目的蛋白的表達進行半定量統計學分析。

1.6 細胞周期實驗

分別取CWF19L1穩定敲低細胞和正常對照組細胞,胰酶消化細胞后用PBS清洗。將潤洗后的細胞使用80%乙醇在-20 ℃條件下過夜進行細胞固定。再使用RedNucleus Ⅰ對細胞的雙鏈DNA染色,再通過流式細胞儀上638 nm為激發波長的FL2通道中檢測熒光強度,將結果在Flowjo軟件中進行細胞周期分析。

1.7 細胞增殖實驗

分別取未做處理以及穩轉sh-CWF19L1-2慢病毒的U251膠質瘤細胞進行消化重懸及鋪板,將兩種細胞以每孔3000個的密度接種于96孔板中,充分搖勻,置于37 ℃培養箱中培養1～4 d。分別在培養第1、2、3、4天時,根據CCK-8試劑盒說明書進行操作,利用酶標儀在450 nm處進行吸光度的測量,根據結果確定細胞的增殖情況。根據測得的不同時期的細胞生長數差異,繪制細胞的生長特征曲線。

1.8 劃痕實驗

取前述轉染敲低慢病毒的U251膠質瘤細胞,以5×105個細胞每孔進行鋪板,待細胞貼壁過夜生長,待生長至大約60%密度,用1 mL槍頭進行劃痕操作(事先用marker筆在皿的反面進行標記),每隔0.5～1.0 cm一道劃痕,用PBS清洗培養皿3次,洗去刮下的細胞,加入無血清培養基進行培養,重新放回5% CO2培養箱中進行培養,并且在0、6、12、24 h 分別進行拍照和取樣,觀察劃痕周圍腫瘤細胞向劃痕進行遷移的程度和速率。遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。

1.9 Transwell實驗

取轉染敲低質粒慢病毒的U251膠質瘤細胞,經消化離心后,用無血清培養基進行細胞重懸,并用細胞計數儀進行細胞密度的計算,用培養基調整細胞密度至2.5×105個·mL-1,每個Transwell小室的上室中鋪200 μL細胞懸液。同時,向下室中加入500 μL含FBS的培養基,在37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后,去除上室上膜殘留的細胞,對已進入下室中的細胞用1%的結晶紫溶液進行染色10 min,通過顯微鏡對下室細胞進行觀察并拍照記錄,最后使用ImageJ軟件對照片進行分析并計數。以上實驗在相同的條件下均重復3次或以上,以避免偶然誤差。

1.10 生物信息學分析

通過GEPIA網頁工具(http://gepia.cancer-pku.cn/),分析CWF19L1在GBM與LGG兩種腫瘤中分別與對應正常組織之間的表達差異。從TCGA和GTEx數據庫下載TCGA、CGGA及GEO數據庫中的膠質瘤RNA-seq數據,按照CWF19L1表達量高低分成2組,結合患者的生存時間應用R軟件(Version:4.0.4)進行數據處理并繪圖,最終確定CWF19L1的表達量與腫瘤之間的關系。匹配每位患者的生存與表達數據,使用“Survival”“Survminer”包分析CWF19L1基因表達與患者預后之間的關聯。

1.11 統計學方法

所有數據均由實驗所得原始數據通過SPSS 22.0軟件進行分析所得,所有數據均以均數±標準差進行呈現,組間比較行t檢驗,變量之間使用Spearman相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CWF19L1在膠質瘤組織中的表達

在GBM和LGG兩種腫瘤中,CWF19L1的表達存在明顯差異,其中在2組腫瘤樣本中表現為腫瘤組表達均高于正常組(P<0.05)(圖1A)。初步推斷CWF19L1作為抑癌基因,在腫瘤組中高表達以抑制腫瘤的生長和侵襲,但這種抑制作用不足以抑制腫瘤的發展,因此設計了后續實驗對上述猜想加以驗證。通過提取各細胞系的全蛋白質進行蛋白質電泳,選擇GAPDH作為內參,進行CWF19L1蛋白質的表達量比較,最終確定在U251膠質瘤細胞系中,CWF19L1蛋白質的表達最高(圖1B)。

A:在TCGA與GTEx合并數據庫LGG和GBM樣品中,腫瘤組織相較于癌旁組織CWF19L1表達量更高。B:在6種基礎細胞系中檢測CWF19L1蛋白質的基礎表達量,顯示在U251細胞中CWF19L1表達最高。*P<0.05。

2.2 CWF19L1高表達對預后的影響

在3個數據庫中各樣本進行表達分析,將患者的CWF19L1表達量分成高低兩組,對其生存時間進行統計學處理,結果如圖2A—C,在TCGA、CGGA和GEO數據結果均顯示,低表達組患者的生存時間通常較短,預示著CWF19L1對于膠質瘤屬于保護基因,其高表達能有效限制膠質瘤細胞的惡性程度,減少膠質瘤細胞產生的損傷。

圖2 TCGA、CGGA、GEO數據庫中CWF19L1生存分析

2.3 sh-CWF19L1-2敲低效果

對實驗組U251膠質瘤細胞進行轉染敲低慢病毒(圖3A),對照組U251膠質瘤細胞進行陰性對照慢病毒的轉染,收集蛋白質進行WB檢測,結果如圖3B所示,CWF19L1蛋白表達相較于陰性對照組出現明顯的敲低,并且sh-CWF19L1-2對CWF19L1基因具有最明顯的敲低效果,后續亦選擇該質粒進行功能實驗。

A:轉染慢病毒后通過普通顯微鏡及熒光顯微鏡觀察到的U251膠質瘤細胞;B:WB檢測三保一敲低慢病毒轉染情況各組之間的CWF19L1蛋白質表達量,n=3。

2.4 CWF19L1敲低在膠質瘤細胞周期中的表達

細胞周期實驗的流式細胞術檢測結果表明,CWF19L1敲低細胞系中處于DNA合成期與合成后期(S/G2期)的細胞比例相較于對照組明顯上調(42.22%比33.00%,P<0.05),見圖4。提示CWF19L1蛋白能抑制U251膠質瘤細胞的細胞周期G1/S期轉化,表現為具有抑制細胞周期進展的作用。

圖4 流式細胞術檢測CWF19L1敲低組與對照組對細胞周期的影響(n=3)

2.5 敲低CWF19L1對膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響

CCK-8實驗結果顯示,轉染質粒的細胞樣本吸光度明顯升高(P<0.001),見圖5,提示敲低CWF19L1后,膠質瘤細胞的增殖能力顯著提升,這進一步驗證了CWF19L1作為腫瘤抑制基因對腫瘤增殖的抑制作用。通過在不同處理組細胞中進行劃痕實驗,結果顯示,敲低組中細胞通過相同時間的培養后,劃痕間距較未處理組明顯縮短(P<0.001),見圖6,提示CWF19L1對于腫瘤細胞的遷移存在明顯的抑制作用。Transwell結果進一步顯示,敲低細胞內CWF19L1的表達后,細胞的侵襲能力顯著增強,處理組細胞系在Transwell小室中出現的細胞數量超過對照組(P<0.001),見圖7。

時間/dn=3。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。圖5 敲低CWF19L1的表達對細胞增殖能力的影響

n=3,*P<0.001。圖6 敲低CWF19L1的表達對細胞遷移能力的影響

n=3,*P<0.001。圖7 敲低CWF19L1的表達對細胞遷移和侵襲能力的影響

3 討論

膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤,是神經系統致死率最高的腫瘤之一,對其發生發展機制的研究已持續幾十年,已有一部分實驗研究應用于膠質瘤的臨床治療,但由于血腦屏障的存在及其對大部分藥物具有較強的阻隔效應,不能將藥物擴散至顱內發揮作用,因此藥物治療往往收效甚微[8]。腫瘤的發生發展與細胞周期的進程密切相關,通過改變細胞周期的進展從而對腫瘤細胞的增殖與浸潤產生影響[9-11]。表觀遺傳學說明了腫瘤的發生與基因改變之間的聯系,原癌基因表達升高或抑癌基因表達抑制是腫瘤發生的主要因素之一,基因表達水平研究的不斷深入能從分子水平解答腫瘤的病因及影響因素,并憑此開發新的腫瘤治療方案。

鑒于在腫瘤樣本中CWF19L1表達相較于正常樣本普遍升高,但其在膠質瘤發生發展過程中并未發生明顯的突變現象,而腫瘤細胞的惡性進程激發了CWF19L1抑制腫瘤細胞周期的作用[12]。在分子水平上表現為腫瘤組織中CWF19L1表達升高,但其發揮的抑癌作用的效力只能減緩腫瘤細胞的進展,不能達到殺傷腫瘤細胞的目的。

除了通過細胞周期調節腫瘤細胞生理特征的作用,還有研究[13]表明,CWF19L1基因突變可能導致其他腦部疾病。例如,CWF19L1發生基因突變導致早發常染色體隱形小腦共濟失調,提示CWF19L1通過細胞通路調控細胞生物學行為的方式并不單一。CWF19L1通過直接影響細胞周期對細胞生命活動起到的調控作用有限,CWF19L1還可能通過作用于miRNA進而調節細胞過程,有實驗[14-16]證明CWF19L1可調控細胞中miR-132-3p水平,對骨髓間充質干細胞的成骨分化加以調控,從而對成骨作用產生調控。臨床亦有報道[17]稱CWF19L1突變導致胎兒脊柱畸形與六指畸形,更確定了其在成骨過程中的調控作用。

敲低CWF19L1表達腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力均有所提高,但產生這種提高的可能原因有CWF19L1蛋白質對細胞周期的直接作用以及CWF19L1通過調控miRNA間接對腫瘤細胞的各種生理過程產生影響[18-21],但其具體調控機制或哪條途徑對腫瘤惡性功能的影響更大,需要通過后續實驗加以驗證,探究新的CWF19L1相關調控軸。敲低CWF19L1改變腫瘤細胞特性也可能是通過調控軸實現,最終促進腫瘤的增殖、遷移與侵襲。應用相關藥物改變調控軸中各分子的含量,從而定向調控細胞的各項生命活動,為限制腫瘤的進展,甚至達到治愈腫瘤提供了新的治療靶點[22]。

綜上所述,CWF19L1作為抑癌基因,其表達與細胞周期緊密聯系,因此通過調控膠質瘤細胞中該蛋白的表達,能顯著影響細胞周期,對腫瘤細胞的增殖,遷移及浸潤產生作用,可作為治療膠質瘤的潛在靶點。