ZMPSTE24表達水平與原發性膠質瘤的關系:一項基于CGGA數據庫的研究

王長峰,陳顯俊,朱 瀅,歐 躍,劉如恩,2

(1.江西省人民醫院、南昌醫學院第一附屬醫院神經外科,南昌 330006; 2.北京大學人民醫院神經外科,北京 100044; 3.南昌大學基礎醫學院,南昌 330006)

膠質瘤是最常見的原發性顱內腫瘤,全球年發病率約6/10萬,男女比例約為1.6：1[1]。在病理學上,膠質瘤可分為星形細胞瘤、少突膠質瘤、室管膜瘤或混合膠質瘤,其中星形細胞瘤最常見[2]。依據世界衛生組織的劃分,神經膠質瘤根據其惡性程度分為四級(Ⅰ—Ⅳ)。其中,Ⅰ級和Ⅱ級膠質瘤是低級別腫瘤,如果能完全切除,預后良好;而Ⅲ級和Ⅳ級膠質瘤屬于高級別腫瘤,惡性度高,切除困難,易復發[3]。膠質瘤發展到晚期(Ⅳ)時可能演變為膠質母細胞瘤(GBM)。目前手術切除、化療和放射治療是神經膠質瘤的標準治療方法,但術后膠質瘤復發率高,預后較差。在傳統治療模式遭遇瓶頸的現狀下,基于組織學結合分子標記物的膠質瘤診斷、預后評估和治療已成為疾病管理的重要里程碑。相關研究[4]已經表明,膠質瘤的形成與細胞信號通路異常密切相關,因此尋找相關分子標記物在膠質瘤的診治過程中具有重要意義。

ZMPSTE24是一種膜鋅金屬蛋白酶,最初在酵母中發現,是層黏連蛋白A成熟過程中所需的酶[5]。有研究[6]表明,ZMPSTE24缺陷小鼠的細胞表現出延遲的DNA損傷反應、非整倍體增加和基因組不穩定性升高,是癌細胞的行為特征。ZMPSTE24通過突變途徑和表達途徑共同參與具有MSI-H表型的胃癌和結直腸癌的發生發展[7]。ZMPSTE24是參與人類早衰癥病理機制的關鍵蛋白酶,同時參與抗病毒免疫途徑的組成,進而調節免疫水平[8]。目前,ZMPSTE24表達水平對腦膠質瘤患者的意義鮮有研究。本研究應用生物信息學方法分析中國膠質瘤基因組圖譜計劃(Chinese glioma genome atlas,CGGA)數據庫中的數據[9],探究ZMPSTE24在腦膠質瘤中的表達及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 數據來源

從CGGA中下載325例膠質瘤患者的臨床數據和mRNA測序數據[9-10]。提取ZMPSTE24基因表達量與臨床數據配對合并,同時剔除部分臨床數據缺失的病例(32例)。使用R軟件(4.2.1)提取ZMPSTE24基因的表達量,使用Mann-WhitneyU檢驗分析2組之間基因表達水平的差異。根據膠質瘤患者的發病狀態,分為原發性膠質瘤(210例)和復發性膠質瘤(83例)。依據ZMPSTE24基因在原發性膠質瘤患者組織中表達量的中位值(18.61)將入選病例分為高表達組(105例)和低表達組(105例),用于進一步分析ZMPSTE24基因表達量在不同類型原發性膠質瘤患者中的臨床意義。ZMPSTE24高表達和低表達組原發性膠質瘤患者的基線資料比較見表1。

1.2 統計學方法

所有統計分析均使用R軟件(4.2.1)進行。臨床因素與ZMPSTE24表達之間的相關性采用Wilcoxon符號秩檢驗和Logistic回歸進行評估。使用Cox回歸和Kaplan-Meier方法確定與低級別膠質瘤患者總生存率相關的臨床因素。進一步進行時間依賴性受試者操作特征(ROC)曲線分析,以確定ZMPSTE24的預測準確性。多變量Cox分析用于探討ZMPSTE24表達在生存預測中的作用以及其他臨床特征(年齡、分級、性別)。采用Shapiro-Wilk檢驗連續變量的正態性。正態分布數據的結果以平均值(標準差)表示,非參數數據的結果則以中值(四分位間距或IQR)表示。分類變量以計數(百分比)表示,并使用Pearsonχ2檢驗或Fisher精確概率法進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

1.3 功能富集分析

為了研究ZMPSTE24表達影響原發性膠質瘤進展的潛在機制,使用R軟件(V.4.2.1)進行基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)篩選ZMPSTE24高表達和ZMPSTE24低表達組之間存在顯著差異的生物通路[11]。對于每一個分析,基因組排列被執行1000次。假發現率(FDR)<0.05和調整后P<0.05的基因組被認為顯著富集,同時鑒定出顯著富集的基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路。

1.4 共表達分析

用limma軟件包收集與ZMPSTE24表達相關的基因。共表達的閾值為相關指數>0.5和P<0.001。此外,利用Corrplot和Circlize軟件包描述與ZMPSTE24共表達的基因。

1.5 蛋白質相互作用網絡的構建與樞紐基因的選擇

ZMPSTE24被導入STRING數據庫(版本:11.5b,https://string-db.org),以識別物理和功能相互作用的基因和蛋白質[12]。以綜合評分>0.45構建蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡,并通過Cytoscape進行進一步可視化。利用Cytoscape version 3.9.1(http://www.cytoscape.org/)的CytoHubba插件,通過最大集團中心度(maximal clique centrality,MCC)算法篩選出PPI網絡中交互作用程度最高的前5個中心性基因。

1.6 免疫細胞浸潤分析

采用TIMER2.0數據庫分析ZMPSTE24表達與B細胞、CD+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、髓系樹突狀細胞(myeloid dendritic cells,DCs)的關系[13]。P<0.001為ZMPSTE24與免疫細胞浸潤顯著相關的閾值。

1.7 免疫組織化學分析

應用來自人類蛋白圖譜數據庫(The human protein atlas,HPA,http://www.proteinatlas.org)的免疫組織化學數據比較正常腦組織和膠質瘤組織中ZMPSTE24的蛋白表達水平。

1.8 蛋白印跡實驗

臨床收集的膠質瘤標本病理診斷分別為H1(Ⅱ級膠質瘤)、H2(Ⅱ級膠質瘤)、H3(Ⅲ級膠質瘤)、H4(Ⅲ級膠質瘤)、H5(Ⅳ級膠質瘤)。將液氮中的病理組織用研缽研磨后,使用蛋白提取液在4 ℃、12 000 g的條件下離心15 min。提取上清保存于-80 ℃進行分析。蛋白濃度測定采用BCA法(Beyotime)。等量的蛋白質裝載在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳,然后通過電泳轉移到聚偏氟乙烯膜上。用5%牛血清白蛋白在室溫下孵育2 h,ZMPSTE24一抗(FineTest)在4 ℃下孵育過夜。將Tris緩沖鹽水與吐溫-20洗滌液混合3次(5 min·次-1),加入1：20萬稀釋雙熒光抗體,室溫孵育1 h。使用SPECTRA MAX SoftMax Pro分析軟件檢測薄膜上各波段的光密度(OD)信號強度。用β-肌動蛋白作為負荷控制和標準化。

2 結果

2.1 ZMPSTE24的表達與原發性膠質瘤臨床特征的關系

分析CGGA數據庫中210例原發性膠質瘤患者的mRNA表達譜,結果表明ZMPSTE24的表達量與原發性膠質瘤患者的WHO分級、年齡分組、是否化療、IDH分型高度相關(均P<0.001),與性別、是否放療無相關性(均P>0.05)。見圖1。

A:ZMPSTE24在不同腫瘤分級患者中的表達;B:ZMPSTE24在不同年齡患者中的表達;C:ZMPSTE24在不同性別患者中的表達;D:ZMPSTE24在是否化療患者中的表達;E:ZMPSTE24在是否放療患者中的表達;F:ZMPSTE24在不同IDH分型患者中的表達。

2.2 ZMPSTE24的表達與原發性膠質瘤患者總生存率的關系

在原發性膠質瘤患者中,ZMPSTE24的表達量與總生存率相關,ZMPSTE24低表達組的總生存時間較ZMPSTE24高表達組明顯延長(圖2A)。在Ⅱ、Ⅲ級原發性膠質瘤患者和Ⅳ級原發性膠質瘤患者中,ZMPSTE24表達水平與總生存率同樣相關(圖2B—C)。預測原發性膠質瘤患者1、3和5年預后的ZMPSTE24曲線下面積(AUC)值分別為0.768、0.850和0.858(圖2D)。分析Ⅱ、Ⅲ級原發性膠質瘤患者和Ⅳ級原發性膠質瘤患者1、3和5年預后的ZMPSTE24曲線下面積(AUC)值分別為0.853、0.810、0.810和0.545、0.776、0.748(圖2E—F)。提示ZMPSTE24預測Ⅱ、Ⅲ級原發性膠質瘤患者生存期的能力更強。

A:ZMPSTE24表達與原發性膠質瘤患者總生存率的相關性;B:ZMPSTE24表達與Ⅱ、Ⅲ級患者總生存率的相關性;C:ZMPSTE24表達與Ⅳ級患者總生存率的相關性;D:原發性膠質瘤患者的時間依賴性ROC曲線;E:Ⅱ、Ⅲ級患者的時間依賴性ROC曲線;F:Ⅳ級患者的時間相關ROC曲線。

2.3 原發性膠質瘤的單因素和多因素COX回歸分析

單因素Cox回歸分析顯示:年齡、腫瘤分級、是否化療、IDH分型和ZMPSTE24表達量與總生存期存在相關關系(均P<0.05)。性別和是否放療與總生存期無相關關系(均P>0.05)。多因素Cox回歸分析顯示:腫瘤分級、IDH分型和ZMPSTE24表達量與總生存期存在相關關系(均P<0.05);年齡、性別、是否化療、是否放療與患者總生存期無相關關系(均P>0.05)。見表2。

表2 原發性膠質瘤的單因素和多因素COX回歸分析結果

2.4 GSEA富集分析

與MTMR14高表達密切相關的6個KEGG途徑為:基底轉錄因子、RNA降解、卵母細胞減數分裂、泛素介導的蛋白水解作用、N-多糖生物合成、細胞周期(圖3)。各富集通路富集分數及校正q值見表3。

基底轉錄因子、RNA降解、卵母細胞減數分裂、泛素介導的蛋白水解作用、N-多糖生物合成、細胞周期與MTMR14表達正性相關。

表3 基于ZMPSTE24表達的KEGG富集分析

2.5 ZMPSTE24的共表達分析

圖4顯示與ZMPSTE24負相關的前3個基因以及正相關的前6個基因。結果表明,ZMPSTE24的表達水平與SLC35F5、FPGT、SLC39A1、SF3A3、SEC22B、SERBP1呈正相關關系(Cor>0.5,P<0.001),與MT-ND4、MT-RD4、GABBR1呈負相關(Cor<-0.5,P<0.001)。

2.6 蛋白質相互作用和免疫細胞浸潤分析

ZMPSTE24的蛋白網絡圖見圖5A。通過CytoHubba插件確定的前5個中心性基因,并按照MCC評分進行排序,確定連接最緊密的蛋白(圖5B)。TIMER2.0顯示ZMPSTE24的表達與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、髓系樹突狀細胞(DCs)有顯著差異(partiral.cor>0.45,P<0.001)(圖5C)。

A:ZMPSTE24的蛋白網絡圖,連線表示蛋白之間存在相互作用,線段粗細表示蛋白相互作用的程度;B:排名前5位的中心性基因分別為ZMPSTE24、ICMT、RCE1、FNTA和LMNB2(紅色的強度表示等級)。

C:ZMPSTE24與B細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突細胞的評分及相關趨勢。

2.7 免疫組織化學分析

從HPA中檢索免疫組織化學染色數據。在正常腦組織中,腦細胞通常具有較弱ZMPSTE24染色(圖6A);原發性膠質瘤組織具有較強的ZMPSTE24染色(圖6B)。利用5例臨床采集的腫瘤組織,進行蛋白印跡實驗,結果表明腫瘤級別越高,ZMPSTE24表達水平相對越高(圖6C)。

A—B:從HPA中檢索免疫組織化學染色數據,A為正常腦組織(患者ID:2512);B為原發性膠質瘤組織(患者ID:3120);C:蛋白印跡實驗(n=5)。

3 討論

在中樞神經系統腫瘤中,膠質瘤是最常見的類型。在世界衛生組織依據其惡性程度的分級中,級別越高,意味著更大的治療難度、更容易復發以及更高的病死率[14]。因此,準確地評估預后對于在疾病早期選擇最合適的治療以改善患者預后至關重要。有研究[15]表明,基于生物標志物的癌癥治療可以有效改善某些惡性腫瘤的預后。因此,本研究主要分析ZMPSTE24與原發性膠質瘤的關聯和潛在機制。本研究結果顯示,ZMPSTE24表達水平與原發性膠質瘤的發生發展、惡性程度及預后密切相關。尤其ZMPSTE24表達水平越高,意味著原發性膠質瘤的惡性程度越高。同時,ZMPSTE24高表達的原發性膠質瘤患者總生存期比ZMPSTE24低表達組顯著降低。

ZMPSTE24是一種膜鋅金屬蛋白酶,參與人類早衰癥病理機制[16]。最新研究[7]表明,ZMPSTE24通過突變途徑和表達途徑共同參與了具有MSI-H表型的胃癌和結直腸癌的發生發展。通過PPI網絡構建與樞紐基因篩選,獲得ZMPSTE24相互作用的蛋白分子,同時以MCC評分為準,篩選出ZMPSTE24蛋白網絡中重要的節點蛋白,如異戊烯基內肽酶(RCE1)、異戊二烯基半胱氨酸羧基甲基轉移酶(ICMT)等。其中,RCE1在真核生物多種信號通路中扮演著非常重要的角色,參與了真核細胞的增殖、分化和癌變等過程[17]?，F有研究表明RCE1與膠質瘤[18]、膀胱癌[19]、前列腺癌、舌鱗癌[20]等的發生發展密切相關。同時,有研究[21]表明ICMT參與了肝癌的轉移過程和舌鱗癌的發生發展。此外,有研究[22-23]發現與ZMPSTE24共表達的SEC22B、SLC39A1、SERBP1等基因,與肝癌、胃癌、膠質瘤以及神經細胞修補密切相關?；诨蚋患治霭l現,ZMPSTE24可能參與泛素介導的蛋白水解作用、基底轉錄因子、細胞周期、RNA降解等重要分子通路。此外,依據TIMER2.0數據庫研究數據,ZMPSTE24的表達與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、髓系樹突狀細胞(DCs)有顯著差異,這意味著ZMPSTE24可能通過某種作用機制,影響膠質瘤的免疫浸潤程度,進而對原發性膠質瘤的發生發展和預后產生相關影響。為進一步驗證mRNA水平研究的可靠性,本研究通過HPA和臨床病理組織免疫印跡實驗發現,ZMPSTE24在膠質瘤組織的表達水平高于正常腦組織,且ZMPSTE24的表達水平與膠質瘤病理分級呈正相關。

本研究存在一些局限性。首先,僅在人類基因轉錄組水平上研究了膠質瘤中ZMPSTE24的特征,沒有進一步研究其在體內或體外的功能;其次,ZMPSTE24在這些過程中的具體分子機制需要進一步探索。

總之,高水平的ZMPSTE24提示原發性膠質瘤的惡性程度較高,生存率較低,尤其在Ⅱ、Ⅲ級原發性膠質瘤中ZMPSTE24表達量可以用于預測患者的預后。因此,筆者推測ZMPSTE24可能是膠質瘤發病和發展的重要基因,或許可以作為原發性膠質瘤的獨立預后因子和潛在治療靶點。