CircPVT1在子癇前期中的表達意義及其對胎盤絨毛外滋養層細胞的功能影響和作用機制

劉 巖,陳琪珍,鄒倩茹,陳佳靜,張 瑜,陳 雄

(上海市寶山區吳淞中心醫院婦產科,上海 200940)

子癇前期(preeclampsia,PE)是妊娠期所特有的一種高血壓疾病,在世界范圍內孕產婦中的發病率介于3%～5%,是導致孕產婦和圍產兒死亡的主要原因[1]。目前,治療PE最有效的方法是分娩。PE對孕產婦和圍產兒的嚴重危害以及治療措施的缺乏,使對PE發生發展中相關的分子機制進行深入研究的任務變得十分緊迫。PE的發病機制復雜,現已知胎盤滋養層細胞的凋亡和異常侵襲是PE發生的基礎[2]。近年來研究[3-4]發現,母胎界面環狀RNAs(circular RNAs,circRNAs)的異常與胎盤絨毛外滋養層(extravillous trophoblasts,EVTs)細胞凋亡、增殖、血管形成、侵襲、遷移、免疫等生物學行為相關,可能參與PE的發生和發展,但此方面研究尚處于起步階段。有研究[5]顯示,circPVT1在胃癌、非小細胞肺癌和乳腺癌等腫瘤中表達升高,促進腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和血管形成等過程。鑒于胎盤病理在PE中的重要作用,結合EVTs細胞與癌細胞具有相似的生物學功能(增殖、遷移和侵襲等)[6],且目前尚未見circPVT1在PE中的研究報道,本研究擬探究circPVT1在PE胎盤組織中的表達意義,以及在EVTs細胞中的作用及作用機制,為探索PE診療的新靶點提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月至2020年12月上海市寶山區吳淞中心醫院收治的無宮縮行剖宮產分娩的孕婦60例為研究對象,其中PE組和Con組(拒絕陰道試產的健康孕婦)各30例。入組標準:1)符合PE診斷標準[7];2)孕婦本人簽署知情同意書。排除標準:雙胎妊娠、妊娠合并內外科疾病和其他妊娠并發癥。本研究經本院倫理委員會審批通過。

1.2 取材和檢測方法

1.2.1 胎盤樣本采集

標本采集于胎盤娩出后5 min內迅速完成。從胎盤母面的中心區域切取大小約1 cm×1 cm×1 cm 組織,置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 細胞培養和穩轉細胞株的建立

人絨毛膜滋養層細胞株(HTR-8/SVneo)購于美國模式培養物集存庫(American type culture collection,ATCC),細胞復蘇后,在含10%FBS(胎牛血清,賽默飛世爾科技(中國)有限公司)的RPMI-1640培養基(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)中培養,培養條件37 ℃,5%CO2。將circPVT1過表達、干擾和相應的對照含有嘌呤抗性的慢病毒(購自上海吉瑪制藥技術有限公司)分別轉染適宜密度的HTR-8/SVneo細胞,72 h后,使用嘌呤霉素對穩轉細胞株進行篩選,定期換液、細胞傳代。2周后,利用qRT-PCR技術,對circPVT1穩定表達的效率進行檢測,獲得circPVT1的穩定干擾細胞株(lv-shcircPVT1)和穩定過表達細胞株(oe-circPVT1),用于后續實驗。

1.2.3 RNA提取和qRT-PCR分析

使用Total RNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取胎盤組織和EVTs細胞的total RNA,并使用逆轉錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)將1 mg RNA用于合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq檢測circPVT1和miR-145-5p的表達。GAPDH和u6分別用于使circRNA和miRNA的相對表達水平正?；?。使用2-ΔΔCt方法計算不同基因的相對表達水平。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列如下:circPVT1,上游認識5′-GGTTCCACCAGCGTTATTC-3′,下游5′-CAACTTCCTTTGGGTCTCC-3′;GAPDH(內參照),上游5′-GGA-GCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游5′-GGCTG-TTGTCATACTTCTCATGG-3′;U6(內參照),上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AAC-GCTTCACGAATTTGC-3′;MiR-145-5p,上游5′-GUCCAGUUUUCCCAGGA-3′,下游5′-GTGCA-GGGTCCGAGGT-3′;Wnt3a,上游5′-ATGAACC-GCCACAACAAC-3′,下游5′-GCTTCTCCACCA-CCA-TCT-3′;Wnt5a,上游5′-CTTGGTGGTCG-CTAGGTA-3′,下游5′-TCGGAATTGATACTGGCATT-3′;β-catenin,上游5′-ACACCAAGAAGCAGAGATG-3′,下游5′-CGAATCAATCCAAC-AGTAGC-3′。

1.2.4 細胞增殖能力測定

將上述circPVT1過表達或者干擾的穩轉細胞株(oe-circPVT1組、lv-shcircPVT1組),以及對應的陰性對照細胞系(lv-NC組)分別接種在96孔板中,待細胞完全貼壁后進行檢測(每12 h),檢測前2 h,每孔加10 μL的CCK-8試劑(江蘇凱基生物技術股份有限公司),酶標儀采集OD450值。

1.2.5 細胞遷移能力檢測

細胞消化、重懸后,將上述穩轉細胞系均勻接種于6孔板中,次日待細胞貼壁后用微量加樣器槍頭垂直于6孔板底做標記,分別于劃痕后0、24和48 h拍照,劃痕愈合率代表細胞遷移能力。

1.2.6 細胞侵襲能力檢測

基質膠溶液均勻鋪在transwell上室(康寧(上海)管理有限公司),向24孔板孔內加入含10%FBS的培養基作為趨化因子誘導細胞穿膜。將各組細胞消化、收集、離心并重懸在不含FBS的培養基中,接種至上室內,培養24 h,用棉簽擦去殘留在上室的細胞,已侵入底部隔室的細胞經固定、染色后,在顯微鏡下拍照并計數。

1.2.7 MicroRNA的合成與瞬時轉染

miR-145-5p的mimics和inhibitor試劑由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成,引物序列如下:Mimics NC,上游5′-UUAUCAGAAUCUCCAGG-GGUAC-3′,下游5′-GUACCCCUGGAGAUUCU-GAUAA-3′;MiR-145-5p mimics,上游5′-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3′,下游5′-AGGG-AUUCCUGGGAAAACUGGAC-3′;Inhibitor NC,5′-AUAUCUUAAUCUCUCUCAUCCAA-3′;MiR-145-5p inhibitor,5′-AGGGAUUCCUGGGA-AAACUGGAC-3′。利用Lipofectamine3000(美國英杰生命技術有限公司)進行瞬時轉染HTR-8/SVneo細胞,構建表達miR-145-5p NC、miR-145-5p mimics、miR-145-5p inhibitor的絨毛膜滋養層細胞株。

1.2.8 雙熒光素酶報告系統驗證miR-145-5p與circPVT1的靶向調控關系

環狀RNA相互作用數據庫(https://circinteractome.nia.nih.gov和http://starbase.sysu.edu.cn)預測circPVT1與miR-145-5p之間有結合位點,利用雙熒光素酶報告系統實驗進行驗證。通過分子克隆技術將WT-circPVT1和MUT-circPVT1分別克隆進入熒光素酶報告質粒(pGL3-basic)中,篩選陽性克隆,測序,擴增克隆并提純質粒備用,將WT-circPVT1、MUT-circPVT1分別轉染上述構建的表達miR-145-5p NC(WT-circPVT1+miR-145-5p NC組、MUT-circPVT1+miR-145-5p NC組)、miR-145-5p mimic(WT-circPVT1+miR-145-5p mimics組、MUT-circPVT1+miR-145-5p mimics組)的絨毛膜滋養層細胞株,24 h后熒光素酶報告實驗檢測細胞內的熒光素酶活性。

1.2.9 免疫印跡實驗

用RIPA裂解液裂解各組細胞,收集各組細胞總蛋白,蛋白定量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉膜。4 ℃封閉膜過夜、洗膜、4 ℃搖床孵育一抗過夜、洗膜、室溫搖床避光孵育二抗1 h、洗膜、化學發光顯色、灰度值分析(β-actin作為內參)。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 Con組和PE組孕婦一般臨床資料比較

2組孕婦的分娩年齡、分娩時體重指數(body mass index,BMI)和是否吸煙比較,差異均無統計學意義(P>0.05),2組孕婦收縮壓、舒張壓、尿蛋白、分娩孕周和新生兒出生體重比較,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 Con組和PE組孕婦一般臨床資料比較

2.2 CircPVT1表達與孕婦一般臨床資料相關性分析

胎盤組織中circPVT1 mRNA表達與孕婦收縮壓、舒張壓和尿蛋白呈負相關(均P<0.01),與孕婦分娩孕周和新生兒出生體重呈正相關(均P<0.01),與孕婦年齡和分娩時BMI無明顯相關性(均P>0.05)。見表2。

表2 circPVT1表達與孕婦一般臨床資料相關性分析

2.3 CircPVT1在Con組和PE組孕婦胎盤組織標本中的表達水平

qRT-PCR實驗結果顯示,Con組和PE組胎盤組織中circPVT1相對表達量分別為1.00±0.08、0.517±0.07,2組比較差異有統計學意義(t=7.569,P=0.002)。

2.4 CircPVT1對EVTs細胞生物學功能的影響

CCK-8增殖實驗表明,在HTR-8/Svne細胞中,與lv-NC組相比,oe-circPVT1組細胞增殖能力顯著增加、lv-shcircPVT1組細胞增殖能力顯著降低(P<0.01),見圖1A。細胞劃痕實驗表明,在HTR-8/Svne細胞中,與lv-NC組[24、48 h劃痕愈合率分別為(61.67±2.89)%、(79.33±1.15)%]相比,oe-circPVT1組[24、48 h劃痕愈合率分別為(75.00±5.00)%、(87.67±2.52)%]細胞遷移能力顯著增加(P=0.016、P=0.006),lv-shcircPVT1組[24、48 h劃痕愈合率分別為(54.00±3.61)%、(65.00±5.00)%]細胞遷移能力顯著降低(P=0.045、P=0.008),見圖1B。Transwell實驗表明,在HTR-8/Svne細胞中,與lv-NC組(343.33±35.19)相比,lv-shcircPVT1組(466.67±30.55)細胞侵襲能力顯著增加(P=0.010),而lv-shcircPVT1組(240.00±20.00)細胞侵襲能力顯著降低(P=0.011),見圖1C。

A:CCK-8增殖實驗檢測circPVT1過表達或抑制circPVT1表達后HTR-8/Svneo細胞增殖能力的變化,n=3,*P<0.05,**P<0.01; B:細胞劃痕實驗檢測circPVT1過表達或抑制circPVT1表達后HTR-8/Svneo細胞遷移能力的變化。

C:transwell實驗檢測circPVT1過表達或抑制circPVT1表達后HTR-8/Svneo細胞侵襲能力的變化。

2.5 circPVT1對miR-145-5p的調控

公共數據庫預測提示miR-145-5p與circPVT1之間存在結合位點,見圖2A。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示,在HTR-8/Svneo細胞中,WT-circPVT1+miR-145-5p NC組和WT-circPVT1+miR-145-5p mimics組相對熒光素酶活性分別為1.00±0.10、0.40±0.10,2組比較差異有統計學意義(t=7.348,P=0.002),而MUT-circPVT1+miR-145-5p NC組和MUT-circPVT1+miR-145-5p mimics組相對熒光素酶活性分別為1.00±0.17、1.00±0.10,2組比較差異無統計學意義(P=1.000),見圖2B。同時,qRT-PCR結果顯示,miR-145-5p在Con組和PE組患者胎盤組織中相對表達量分別為1.00±0.20、1.93±0.40,2組比較差異有統計學意義(t=-3.585,P=0.023),見圖2C;在HTR-8/Svneo細胞中,與lv-NC組(1.00±0.20)相比,oe-circPVT1組(0.50±0.10)miR-145-5p的表達降低(P=0.018),而lv-shcircPVT1組(2.50±0.50)miR-145-5p的表達增加(P=0.008),見圖2D。

A:miR-145-5p與circPVT1和突變的miR-145-5p預測結合位點示意圖;B:在HTR-8/Svneo細胞中,利用雙熒光素酶報告實驗驗證circPVT1與miR-145-5p的結合關系,n=3;C:qRT-PCR檢測miR-145-5p在Con組(n=30)和PE組(n=30)患者胎盤組織中的表達情況;D:qRT-PCR檢測circPVT1過表達和抑制circPVT1表達后miR-145-5p的表達情況,n=3。*P<0.05,**P<0.01。

2.6 circPVT1通過miR-145-5p/Wnt/β-catenin通路促進EVTs細胞增殖和侵襲

qRT-PCR和western blot實驗分別顯示,circPVT1過表達能夠促進Wnt3a、Wnt5a和β-catenin mRNA和蛋白表達,然而這種情況可以被miR-145-5p的類似物所抑制(P<0.01),見圖3A—B。CCK-8實驗顯示,miR-145-5p抑制物能夠挽救circPVT1沉默介導的HTR-8/Svneo細胞增殖能力降低(P<0.01),見圖3C。

A:western bolt實驗檢測HTR-8/Svneo細胞轉染oe-circPVT1和(或)miR-145-5p mimics后Wnt3a、Wnt5a和β-catenin蛋白表達情況;B:qRT-PCR實驗檢測HTR-8/Svneo細胞轉染oe-circPVT1和(或)miR-145-5p mimics后Wnt3a、Wnt5a和β-catenin mRNA表達情況;C:CCK-8實驗檢測,HTR-8/Svneo細胞轉染lv-shcircPVT1和(或)miR-145-5p inhibitor后細胞增殖能力的變化。n=3,*P<0.05,**P<0.01。1:lv-NC組;2:oe-circPVT1組;3:oe-circPVT1+miR-145-5p mimics組。

3 討論

近年來,學界普遍認為PE發生的首要病因是胎盤發育異常,滋養細胞淺植入和不完全浸潤是PE的基本病因[8]。CircRNAs是共價閉合的單鏈轉產物,隨著高通路測序和生物信息學技術的發展,circRNAs被證實參與調控多種細胞類型的不同生物學過程[9]。例如,ZHOU等[10]發現circZDHHC20通過結合miR-144上調GRHL2的表達,從而阻斷滋養細胞的增殖、遷移和侵襲能力。另有研究[11]報道,環狀RNA circ_0111277通過調控miR-494/HTRA1/Notch-1信號通路減弱PE人滋養細胞的侵襲和遷移。以上研究顯示,circRNAs的異常表達與胎盤滋養細胞的生物學行為異常相關,提示circRNAs可能在PE發病機制中發揮重要作用。

CircPVT1又稱hsa_circ_0001821,源于癌基因長鏈非編碼RNA PVT1的第2個外顯子,該基因位于chr8:128902834—128903244,一個癌癥易感基因座[5],circPVT1可充當miR-125a、miR-145-5p、miR-149和miR-203等miRNAs的海綿,還可調節PI3K/AKT和Wnt5a/Ror2等信號通路的活性,在胃癌、非小細胞肺癌和乳腺癌等多種腫瘤的發生、藥物耐藥和預后過程中發揮至關重要的作用[12]。胎盤滋養層細胞與癌細胞有相似的生物學活性,即增殖、遷移和侵襲性等,胎盤滋養細胞的功能失調被認為是PE的基本病因[2]。CircPVT1在PE及其胎盤滋養層細胞中表達水平和臨床意義尚未見報道。本研究利用qRT-PCR檢測,發現相比于正常胎盤組織,circPVT1在PE胎盤組織中低表達,臨床數據統計分析結果顯示,胎盤組織中circPVT1表達與孕婦收縮壓、舒張壓和尿蛋白呈負相關,與孕婦分娩孕周和新生兒出生體重呈正相關。提示circPVT1可能參與了PE的發生,可能是PE不良妊娠結局的潛在分子標志物。有研究[13]報道,在胃癌中,circPVT1通過miR-423-5p/Smad3通路介導上皮-間充質轉化調控細胞遷移和侵襲。本研究為探討circPVT1在PE胎盤滋養層細胞中的生物學功能,首先利用慢病毒侵染并構建了circPVT1的穩定干擾細胞株(lv-shcircPVT1)和穩定過表達細胞株(oe-circPVT1),并進行了一系列細胞功能實驗,結果顯示,circPVT1過表達后EVTs細胞的增殖、遷移和侵襲能力增強,而抑制circPVT1表達后EVTs細胞的增殖、遷移和侵襲能力降低。

CircPVT1促進EVTs細胞增殖、遷移和侵襲能力的作用已經明確,但其中的作用機制尚需進一步探討。MicroRNA(miRNAs)是一種非編碼的小RNA,在轉錄后水平調控基因的表達,與疾病的發生發展密切相關[14]。有研究[15]顯示,circRNAs通過對miRNAs海綿吸附作用,阻止miRNAs對特定mRNAs結合,進而影響細胞功能,導致疾病的發生。本研究通過生物信息學分析,發現miR-145-5p是circPVT1潛在的靶miRNAs之一。應用雙熒光素酶報告實驗和挽救實驗在EVTs細胞中檢驗circPVT1與miR145-5p之間的相互作用,結果顯示circPVT1可以海綿吸收并負向調控miR-145-5p。Wnt信號通路是一種復雜的途徑,以高度依賴細胞和組織的方式調節許多信號轉導途徑,并調節多種生物功能,在人類中有3種Wnt信號通路:典型的Wnt/β-catenin通路,非典型的Wnt/Ca2+通路和非典型的平面細胞極性通路[16]。最近的研究[17]表明,Wnt/β-catenin信號通路的失調可能與PE有關。另有研究[18]報道,miR-145-5p通過調控Wnt/β-catenin信號通路抑制銀屑病的發展。此外,circRNA和Wnt/β-cateinin通路在多種生物學過程之間有很多聯系[19]。例如,ZHANG等[20]證實,circRNA_069718通過激活Wnt/β-cateinin通路介導三陰性乳腺癌的進展。本研究發現,在EVTs細胞中circPVT1顯著促進Wnt/β-Catenin mRNA和蛋白表達,然而這種情況可以被miR-145-5p的類似物所抑制。隨后的細胞增殖實驗顯示miR-145-5p抑制物能夠挽救circPVT1沉默介導的EVTs細胞增殖能力降低。以上結果表明,circPVT1可能通過調控miR-145-5p/Wnt/β-catenin信號通路促進EVTs細胞增殖和侵襲參與PE發生。

綜上所述,circPVT1在PE患者胎盤中低表達,與PE患者的不良妊娠結局相關。CircPVT1過表達后EVTs細胞的增殖、遷移和侵襲能力增強,而抑制circPVT1表達后EVTs細胞的增殖、遷移和侵襲能力降低,可能是通過miR-145-5p/Wnt/β-catenin信號通路發揮作用。這些發現可為探索PE診療的潛在靶點提供參考。然而本研究尚存在一定的局限性,如樣本量偏少、circPVT1具體的作用機制有待完善,需要更深入的體內外實驗進一步驗證其在PE中的臨床價值。