白楊素衍生物通過DAF-16 調節線蟲抵御細菌感染能力的研究

羅路，陳夢婷，陳映之，周俊杰，楊寶盈，馮娜

（五邑大學 生物科技與大健康學院，廣東 江門 529020）

白楊素（Chysin）是一種從紫葳科木蝴蝶種子里分離提純得到的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗焦慮、治療糖尿病以及抗癌等廣泛藥理作用[1-4]. 白楊素是性能良好的抗氧化劑，能有效清除自由基[5]. Vaya 等[6]通過對白楊素的研究發現白楊素在體外能夠清除AAPH 分解的陽離子型自由基，還能減少銅離子的氧化. 白楊素及其衍生物具有抑菌、免疫調節等活性. Patel 等[7]采用丁基鏈與哌嗪、嗎啉和哌啶等取代合成的白楊素衍生物具有清除DPPH 和ABTS 自由基的能力，并且能抑制癌細胞的增殖. Zhu 等[8]合成的白楊素-β-D-吡喃半乳糖苷對H22 細胞系的活性抑制，和對羥基自由基、DPPH 自由基、超氧陰離子的清除能力，以及對細菌和真菌的抑制作用均比白楊素強.

近幾十年，已有很多學者開始將秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，以下簡稱線蟲）作為宿主模型用于體內病原微生物的毒力及致病機制的研究. 在線蟲中，天然免疫反應一方面是通過釋放殺菌物質直接殺死病原微生物；另一方面是通過觸發天然免疫信號通路，調節宿主體內生理平衡，保護自身免受病原微生物感染的危害. 最近的研究結果顯示，活性氧（reactive oxygen species，ROS）參與了上述兩方面[9]. ROS 是一類含有氧原子的自由基和非自由基的分子或離子化合物的總稱[10].Malhotra 等[11]發現生物體內的ROS 水平與囊腫纖維化（CF）肺部疾病有關；Li 等[12]發現感染腸病毒71 型（EV71）會誘導不同細胞系的凋亡，同時細胞會產生大量ROS，而外源添加NAC 可降低EV71 感染細胞的凋亡和炎癥水平，減少EV71 的增殖，這些結果表明ROS 水平與機體的感染和恢復有關.

白楊素及其衍生物的抗氧化活性及免疫調節作用提示其在抗菌方面具有有益作用，因此針對白楊素的衍生化有望為發展新型抗菌劑提供思路. 本文利用線蟲-病原菌感染模型對白楊素衍生物在天然免疫中的作用進行探討，以期為了解動物抗感染機制、開發新的抗感染策略提供幫助.

1 實驗方法

1.1 線蟲株系和菌株

線蟲N2 (Bristol)、TJ356 zIs356 [daf-16p::daf-16a/b::GFP+rol-6(su1006)]、CF1553 muIs84 [(pAD76)sod-3p::GFP+rol-6(su1006)]和菌株E.coliOP50、E.faecalis均由蘭州大學支德娟老師惠贈，菌株S.aureus、Proteus由五邑大學魏萍老師惠贈，P.aeruginosaPA14 由云南大學鄒成鋼老師惠贈.

1.2 白楊素衍生物體外抗氧化活性檢測

參考文獻[13]的方法對 DPPH 自由基清除能力進行檢測. 吸取不同濃度的待測樣品100 μL 和0.1 mM DPPH 乙醇溶液100 μL 于96 孔板，搖勻，在室溫避光放置30 min，在517 nm 處測定吸光值記為At；取不同濃度的待測樣品100 μL 和 100 μL H2O，測定其吸光值記為Ar；吸取100 μL DPPH 和100 μL H2O，測定其吸光值記為A0. 按以下公式計算DPPH 自由基清除率：

參考文獻[14]的方法對ORAC（總抗氧化能力）進行檢測，在96 孔板中加入50 μL 待測樣品，加入50 μL 75 mM 的PBS 溶液代替樣品作為空白組，以及50 μL VE 溶液代替樣品作為標準組，避光加入100 μL FL 工作液，放入酶標儀進行檢測（激發波長485 nm，吸收波長535 nm），初始熒光值記為0F；37°C 溫育箱振蕩3 min 后繼續溫育10 min，迅速加入50 μL 153 mM 的AAPH 溶液啟動反應，放入酶標儀檢測孔動力學，檢測過程中每隔150 s 測定一次熒光值記為nF，直至熒光值衰減至直線.按以下公式計算標準曲線和總抗氧化能力指數：

VE 的濃度作為X軸，NetAUCVE作為Y軸繪制Trolox 標準曲線，將 NetAUCSample代入Trolox 的線性方程中進行計算，結果以VE 的當量mM 來表示，得到樣品的ORAC 值，即為樣品的總抗氧化能力指數，記為mM TE/g DW.

1.3 96 孔板法測定白楊素衍生物的抑菌率

參考文獻[15]的方法，將復蘇的菌株用MHB 培養基培養至F2 代菌，再用MHB 稀釋菌液得到與0.5 單位麥氏比濁液OD610 相當的菌液，定義為細菌濃度 1.5 ×108CFU/mL ，再用MHB 將菌液100×稀釋得到最終濃度 1.5 ×106CFU/mL 的菌懸液. 然后吸取50 μL 待測樣品、50 μL 菌懸液、50 μL MHB 于96 孔板，立刻置于多功能酶標儀上在600nm條件下測定其吸光度，記為OD0，然后將96孔板置于37°C恒溫培養箱培養12h后在相同波長條件下測定吸光度，記為OD12.其中以MHB10×稀釋的DMSO 代替樣品作為陰性對照. 按以下公式計算抑菌率：

1.4 PA14 Killing 實驗

PA14 Killing 實驗參考文獻[16]的方法設計，挑取30 條大小形態相似的不同處理的L4 期成蟲至PA14/NGM 板上，然后置于25°C 培養，每天對線蟲的存活進行評定，將活著的線蟲轉移至新的PA14/NGM 板上，直到全部死亡為止，按以下公式對線蟲的存活率進行計算：

1.5 線粒體活性氧檢測

參考文獻[17]的方法設計實驗，將不同處理的 L4 期線蟲用 M9 緩沖液洗 3 次，再用終濃度1 μM MitoSOXTMRed 于20°C染色20 min，然后用M9 緩沖液洗3 次后加入適量 NaN3麻痹線蟲，用瓊脂糖進行封片，于BX63 生物熒光顯微鏡（正置）下選擇RFP 模式進行觀察，并攝取圖片，用ImageJ量化分析.

1.6 熒光定量PCR

按照總RNA 提取試劑盒說明書[18]提取不同處理的線蟲RNA，然后配制Master Mix 混合RNA樣品在PCR 混合儀上分別進行Step1（42°C ，2 min）和Step2（85°C ，5 s）兩步反應，逆轉錄成穩定的cDNA，然后將Mix 和cDNA 樣品溶液混合，置于PCR 擴增儀上，程序如下：

Stage 1：預變性（95°C ，30 s）

Stage 2：PCR 反應40 Cycles（95°C ，3 s；60°C ，30 s）

1.7 突變株線蟲轉基因熒光可視化及熒光定量分析

本文使用TJ356 和CF1553 兩種突變株線蟲分別進行DAF-16 核定位實驗和SOD-3 蛋白表達分析. 實驗步驟如下：將不同處理的L4 期線蟲用M9 緩沖液洗3 次后加入適量 NaN3麻痹線蟲，用瓊脂糖進行封片，于BX63 生物熒光顯微鏡（正置）下選擇GFP 模式進行觀察，并攝取圖片，用ImageJ量化分析.

2 結果分析

2.1 白楊素衍生物能有效清除自由基

體外測定抗氧化活性實驗具有高效、簡便、快捷等優點[19]，適用于大量化合物的篩選. 對圖 1所示的白楊素及13 種白楊素衍生物（a -m）的抗氧化活性進行研究，分別采用DPPH 法和ORAC法進行評價，結果如表1 所示：對照VC 對0.1 mM DPPH 自由基的IC50為12.47±0.78μM ，而白楊素及其衍生物對DPPH 自由基的IC50都比VC 的高（p＜0.001），這表明，白楊素衍生物對DPPH 自由基的清除能力相對較弱；其中衍生物h 對0.1 mM DPPH 自由基的IC50值最小，衍生物c 的最大.

圖1 白楊素及其衍生物（a-m）結構式

表1 白楊素及其衍生物（a-m）對0.1 mM DPPH 自由基的IC50 值

體外抗氧化活性實驗結果如圖2 所示：白楊素及其衍生物的總抗氧化能力指數均低于VC(55.47±4.84) mM TE/g DW，p＜0.001）；50 μM 衍生物h 表現出與白楊素相當的抗氧化能力；衍生物h（4-甲氧基芐溴白楊素醚）的總抗氧化能力指數最高(28.79 ±3.75)mM TE/g DW ），比相同濃度下白楊素的總抗氧化能力指數(23.10 ±6.40) mM TE/g DW）高24.63%；其余12 種白楊素衍生物總抗氧化能力指數均比白楊素低（p＜0.001）.

圖2 白楊素及其衍生物（a-m）的總抗氧化能力指數

2.2 白楊素衍生物 h 能抑制細菌生長，但殺菌能力較弱

研究表明，白楊素具有良好的抑菌活性[8]，為了評價白楊素衍生物h 的抑菌活性，分別檢測了100、200、400 μM 衍生物h 對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、普通變形桿菌（Proteus）和銅綠假單胞菌PA14（Pseudomonas aeruginosaPA14）的體外抑菌效果，結果如圖3 所示（圖中所有數據均為（平均值±SEM））：1）圖3-a 和3-c 中，400 μM 衍生物h 對金黃色葡萄球菌和普通變形桿菌的抑菌率分別為（76.32 ±11.16）%、（72.95 ±11.56）%，均大于70%，說明高濃度衍生物h 能抑制細菌的生長；而中低濃度衍生物h 對金黃色葡萄球菌和普通變形桿菌均沒有明顯的抑制作用. 2）圖3-b 和3-d 中，不同濃度衍生物h 對糞腸球菌和銅綠假單胞菌PA14 的抑菌率均小于70%，表明衍生物h 不具有抑制糞腸球菌和銅綠假單胞菌PA14 生長的作用.

圖3 白楊素衍生物h 對不同細菌的抑制率

圖4 白楊素衍生物h 對PA14 感染后線蟲存活率的影響

體外抑菌實驗結果表明，衍生物h 對糞腸球菌和銅綠假單胞菌PA14 沒有明顯的活性抑制，鑒于它的抗氧化活性，我們推測衍生物h 可能通過免疫調節途徑來增強宿主的抗感染能力.

2.3 白楊素衍生物h 延長了PA14 感染后線蟲的壽命

研究表明，銅綠假單胞菌PA14 可以感染線蟲，該病原—宿主模型廣泛用于研究宿主天然免疫與細菌感染的關系. PA14 感染后的線蟲分別用10 μM 和50 μM 衍生物h 處理或不處理，其存活情況如圖 4所示（圖中所有數據均表示為（平均值 ±SEM），使用t檢驗計算p值，*p＜0.01，**p＜0.001，ns 無顯著性差異）：在感染PA14 的情況下，未處理組線蟲平均生存時間為(2.00 ± 0.14) d ；10 μM 衍生物h 處理組線蟲平均生存時間為(2.13 ± 0.17) d ，比未處理組線蟲壽命延長了6.50%（無統計學差異，ns）；50 μM衍生物h 處理組線蟲平均生存時間為(2.44 ± 0.05) d ，比未處理組線蟲壽命延長了22.00%（p＜0.001）. 該結果表明，10 μM 衍生物h 不能顯著延長PA14感染線蟲的壽命，而50 μM 衍生物h 處理后，顯著提高PA14 感染線蟲的壽命.

2.4 白楊素衍生物h 部分恢復PA14 感染導致的線粒體活性氧水平的降低

ORAC 實驗結果表明白楊素衍生物h具有一定的抗氧化活性，已有研究表明宿主體內的ROS 水平對宿主抵御細菌感染的能力有影響[20]. 本文檢測了衍生物h對PA14 感染后線蟲體內MitoROS 水平的影響，結果如圖5 所示（圖中所有數據均為（平均值 ±SEM），使用t檢驗計算p值，與N2 比較，##p＜0.001；與N2/PA14 比較，p＜0.01）.

圖5 白楊素衍生物h 對PA14 感染后N2 線蟲線粒體活性氧水平的影響

如圖5-b 所示：與未處理N2 組相比，50 μM 衍生物h處理后線蟲ROS 水平顯著降低（p＜0.001），PA14 感染組的線蟲ROS 水平也顯著降低（p＜0.001），PA14 感染后的線蟲經50 μM 衍生物h處理后ROS 水平與PA14 感染組相比顯著上調（p＜0.001），部分恢復了PA14 感染導致的ROS 降低. 有研究表明，銅綠假單胞菌有規避先天免疫防御的能力，它通過清除中性粒細胞來規避先天免疫反應中ROS 的產生[21]. 在本文中，衍生物h能降低宿主的ROS 水平，這說明衍生物h具有抗氧化活性，與體外的抗氧化實驗結果一致；而PA14 感染后線蟲的ROS 水平進一步降低，給藥處理后ROS 水平顯著回升，這可能是衍生物h對宿主的ROS 水平具有調節作用，ROS 作為信號分子誘導了宿主免疫反應，調動下游效應因子增強宿主抵御PA14 感染的能力.

2.5 白楊素衍生物h 上調PA14 感染后線蟲的免疫相關基因

DAF-16/FOXO 信號通路參與介導線蟲的先天免疫應答，DAF-16 核轉位啟動免疫相關基因的表達，以防御病原體感染并延長線蟲的壽命[22]. 金屬硫蛋白同系物mtl- 1和線粒體超氧化物歧化酶基因sod- 3作為DAF-16 的下游基因，參與調節宿主的免疫功能[23].

為了進一步研究白楊素衍生物h在線蟲體內發揮抗感染作用的機制，對線蟲體內氧化應激相關基因（sod- 1、sod- 2、sod- 3、sod- 4、sod- 5）與抗菌相關基因（mtl- 1）的表達量進行檢測，分析衍生物h對線蟲體內DAF-16 及其下游靶基因的影響，結果如圖6 所示（圖中所有數據均為（平均值 ±SEM），使用t檢驗計算p值，與空白組比較，#p＜0.01，##p＜0.001；與PA14 組比較，p＜0.01，p＜0.001）.

圖6 白楊素衍生物h 對PA14 感染后線蟲免疫相關基因、DAF-16 核轉位和SOD-3 蛋白表達量的影響

如圖6-a 所示，與陽性對照N2/PA14 組相比，50 μM 衍生物h處理后線蟲的daf- 16（p＜0.001）、sod- 1（p＜0.001）、sod- 2（p＜0.01）、sod-3（p＜0.001）、sod- 4（p＜0.001）、sod-5（p＜0.001）、mtl- 1（p＜0.001）的mRNA 水平上調，說明衍生物h 通過上調抗氧化相關基因（sod- 1、sod- 2、sod- 3、sod- 4、sod- 5）和抗菌相關基因（mtl- 1）的表達量發揮抗PA14的作用.

線蟲中 DAF-16 在抗應激方面起重要的作用，上游激酶的失活導致DAF-16 從細胞質向細胞核移位[24]. 因此，我們在DAF-16::GFP 標記的突變株線蟲TJ356 上分析衍生物h對轉錄因子 DAF-16 核轉位的影響.圖6-b 是線蟲DAF-16 熒光圖像；圖6-c 是對不同處理的線蟲DAF-16 核轉位的量化，對照TJ356 組，DAF-16發生核轉運的線蟲占比3.85%；PA14感染后發生核轉運的線蟲占比59.41%，比對照TJ356 組高14.43 倍（p＜0.001）；經50 μM 衍生物h處理后發生核轉運的線蟲占比71.43%，發生核轉運的線蟲比PA14組高20.23%（p＜0.01）. 說明衍生物h能促進DAF-16 從細胞質到細胞核的易位，在抗感染的過程中通過激活DAF-16 轉錄因子發揮積極作用.

DAF-16 調節的抗氧化酶SOD-3和CTL-2 通過保護線蟲的腸道細胞在感染期間免受ROS 的影響而促進免疫[21]，SOD-3 是DAF-16 的下游蛋白之一. 因此，我們使用SOD-3::GFP標記的突變株線蟲CF1553 分析衍生物h對 SOD-3 蛋白表達的影響. 圖6-d 是不同處理線蟲SOD-3 熒光圖像，其熒光量化結果如圖6-e 所示，PA14 感染激活了線蟲體內的天然免疫系統，與對照組 CF1553 相比，PA14/CF1553 組線蟲SOD-3 表達量上調2.74%（p＜0.01）；經50 μM 衍生物h處理后，線蟲的天然免疫增強，與PA14/CF1553 組相比，SOD-3 表達量上調1.80%（p＜0.01），說明衍生物h可以上調線蟲SOD-3 水平.

3 結論

白楊素衍生物h具有抗氧化活性，并且能夠延長銅綠假單胞菌 PA14 感染的線蟲壽命（p＜0.001），說明衍生物h具有抗感染活性. 衍生物h處理顯著上調了PA14 感染后宿主ROS 水平和daf-16、sod-1、sod-2、sod-3、sod-4、sod-5、mtl- 1免疫相關基因的mRNA，這表明，ROS 作為信號分子通過促進下游效應因子表達從而激活其他信號通路來增強自身免疫反應，保護宿主抵御PA14 感染. 綜上，白楊素衍生物h通過激活轉錄因子DAF-16 并調控下游免疫相關基因的表達來發揮抗感染作用，機制如圖7 所示.

圖7 白楊素衍生物h 抗感染作用機制圖