基于PI3K/Akt 信號通路探討重樓皂苷Ⅶ對人結直腸癌細胞增殖的影響

侯亞妮，孫中華，劉志勇，褚志杰，白克運

（山東中醫藥大學，山東 濟南 250355； 2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014）

結直腸癌（CRC）是世界范圍內癌癥相關死亡的主要原因之一，是最常見的消化道惡性腫瘤，85%以上CRC 由息肉發展為腺瘤再轉為腺癌，其發病率和病死率呈逐年上升的趨勢［1-3］。 由于前期發病癥狀不明顯，CRC 發現時多已進入中晚期，臨床中多采用手術切除，輔以放療、化療，但是治療周期長，不良反應明顯，且術后復發率高，嚴重影響患者生活質量。

近年來中藥在癌癥治療中發揮了重要作用。 通過查詢2020 年《中國藥典》得知，重樓的重要組成成分為重樓皂苷（PP），包含重樓皂苷Ⅰ（PPⅠ）、重樓皂苷Ⅱ（PPⅡ）以及重樓皂苷Ⅶ（PPⅦ）。 PP 有抑制腫瘤細胞增殖和轉移、促進細胞凋亡和自噬、抑制新生血管形成、逆轉腫瘤多藥耐藥和調節機體免疫功能等作用［4］。 與經典的細胞毒性藥物相比，現代抗癌藥物更傾向于針對癌癥中作用突出的各種信號通路。磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路在腫瘤發生、發展方面起到重要作用，與癌細胞增殖和凋亡、周期調控、血管形成、侵襲、轉移密切相關［5］。 網絡藥理學分析表明，PI3K/Akt 信號通路是PP 抗CRC 的核心通路，具有重要研究價值［6］。 然而，關于PPⅦ是否能夠通過調控PI3K/Akt 信號通路抑制CRC 發生發展，尚未見報道。 本研究旨在闡明PPⅦ對CRC 細胞增殖的抑制作用和潛在分子機制，為PP 類藥物的研發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人結直腸癌細胞HT29 由山東中醫藥大學附屬醫院遲莉麗課題組惠贈，人結直腸癌細胞LoVo 購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心，PPⅠ（A0386）、PPⅡ（A0387）、PPⅦ（A0390）購自成都曼斯特生物科技有限公司。RPIM-1640 培養基（CM10040）、Ham’s F-12K 培養基（CM10025）、胰蛋白酶（CC017-500）、青霉素-鏈霉素（CC004）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（CC008）均購自中科邁晨科技有限公司，胎牛血清（04-001-1ACS）購自Biological Industries，BeyoClickTM EdU 細胞增殖檢測試劑盒（C0088S）、SDS-PAG 凝膠配置試劑盒（P0012A）均購自碧云天生物技術有限公司，BCA 濃度檢測試劑盒購自大連美侖生物技術有限公司，抗體蛋白激酶B（Akt，＃4685）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt，＃4060）、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K，＃4257）、磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶（p-PI3K，＃4228）均購自賽信通生物試劑有限公司，甘油醛3 磷酸脫氫酶（GAPDH）（60004-1-Ig）購自武漢三鷹生物技術有限公司，山羊抗鼠（ZB-2305）、山羊抗兔（ZB-2301）均購自北京中杉金橋科技生物有限公司，增強型化學發光液（WBKLS0500）購自默克密理博實驗室設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

在培養基中添加10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗，配置成完全培養基，HT29 細胞株常規培養于RPMI-1640 培養基中，LoVo 細胞株常規培養于Ham’s F-12K培養基中，細胞置于37 ℃、含5% CO2的細胞培養箱中培養，細胞生長融合至細胞培養皿面積的80%～90%，按照1∶3（HT29）和1∶2（LoVo）的比例胰酶消化傳代。 取對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2.2 重樓皂苷配置

取1 mg 藥物溶解到1 mL DMSO 中，獲得終質量濃度為1 mg/mL 的藥物母液，存于-20 ℃長期避光保存。 取10 μL 藥物母液用每種細胞所需培養基定容至1 mL，獲得終質量濃度為100 μg/mL 的藥物母液，短期4 ℃避光保存，用前以培養基稀釋。

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測細胞活力

取對數生長期的HT29 和LoVo 細胞，PBS 沖洗兩遍，胰酶消化離心后，加入完全培養基制備成細胞懸液計數。 將細胞接種于96 孔板，調整每孔細胞濃度為8×103個細胞，定容至100 μL，培養過夜后細胞生長融合至細胞培養孔板面積的50%，并加入梯度濃度的PPⅠ、PPⅡ、PPⅦ和順鉑，每種藥物設置1 個主孔與4 個復孔，處理48 h，隨后每孔加入0.5%的MTT 溶液20 μL，繼續培養4 h。 加入DMSO 150 μL，放入酶標儀檢測490 nm 處吸光度。 分析并計算藥物的最大半抑制濃度值（IC50值）。

1.2.4 克隆形成實驗

取對數生長期的HT29 和LoVo 細胞，PBS 沖洗兩遍，胰酶消化離心后，加入完全培養基制備成細胞懸液計數。 將細胞以500 個/孔接種到6 孔板，培養24 h 后，設空白組（0 μg/mL）及PPⅦ給藥組，給藥組加入梯度濃度的PPⅦ（0.375 μg/mL、0.750 μg/mL），置于37 ℃，5% CO2的培養箱中繼續培養，每3 d 更換含藥的完全培養基1 次，10 d 后終止培養，4%甲醇固定30 min，0.5%結晶紫染色20 min，PBS 沖洗兩遍，拍照并計數。 克隆抑制率（%）=［（空白組克隆形成率- 給藥組克隆形成率）/空白組克隆形成率］×100%。

1.2.5 EdU 細胞增殖檢測（TMB 法）

取對數生長期的HT29 和LoVo 細胞制備成細胞懸液并計數。 將細胞接種于96 孔板，調整細胞濃度為8×103個細胞每孔，定容至100 μL，培養過夜后細胞密度達50%，并加入梯度濃度的PPⅦ（0 μg/mL、3 μg/mL、6 μg/mL）干預48 h 后終止培養，每孔加入2×EdU 工作液100 μL，37 ℃孵育2 h，去除培養基，加入4%甲醇固定15 min，PBS 沖洗3 次，每次5 min，加入100 μL 通透液，孵育15 min，PBS 沖洗2 次，每次5 min，加入內源性過氧化物酶100 μL，孵育20 min，PBS 沖洗3 次，每次2 min，制備Click 反應液，每孔加入50 μL，避光孵育30 min，PBS 沖洗3 次，每次5 min，制備Streptavidin-HRP 工作液，每孔加入20 μL，孵育30 min，PBS 沖洗3 次，每次2 min，加入100 μL TMB 顯色液，孵育30 min，放入酶標儀檢測450 nm處吸光度（OD）。 細胞增殖率（%）=（對照組OD 值-實驗組OD 值）/對照組OD 值。

1.2.6 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測蛋白表達

取對數生長期的HT29 和LoVo 細胞制備成細胞懸液并計數。 將細胞以8×106個/孔接種于6 孔板，培養24 h 后，加入梯度濃度的PPⅦ（0 μg/mL、3 μg/mL、6 μg/mL）干預48 h 后終止培養，將細胞刮下收集到EP 管中，離心去上清液，僅保留細胞團，按照裂解液∶蛋白酶抑制劑PMSF∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1的比例混勻，配置到EP 管中，冰上裂解30 min。 4 ℃條件下，13 200 r/min 離心15 min，離心半徑為6 cm，取上清液，BCA 法檢測蛋白濃度，根據結果使用PBS調整蛋白濃度，95 ℃加熱5 min 使蛋白變性。 每個泳道上樣30 μg 蛋白，80 V 恒壓條件下10% SDS-PAGE膠分離蛋白后，260 mA 轉膜（PVDF 膜）2 h，用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液封閉1 h（磷酸化指標用5%BSA 封閉1 h）。 分別孵育PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 抗體（1∶1000），4 ℃條件下孵育過夜。 TBST 洗膜3 次，每次10 min。 室溫孵育二抗1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL 發光液顯影。

1.3 統計方法

結果采用Graph Pad Prism 8.0 統計軟件進行統計分析，數據均以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t 檢驗。 取α=0.05為檢驗水準。

2 實驗結果

2.1 重樓皂苷對HT29 和LoVo 細胞活力的影響

重樓皂苷對細胞活力的影響，用MTT 法進行檢測。 采用梯度濃度的重樓皂苷和順鉑（陽性對照）分別干預HT29 細胞和LoVo 細胞48 h，MTT 法檢測細胞活力。 結果表明，PPⅦ能有效降低HT29 和LoVo 細胞的活力。 見圖1。 通過對IC50值分析發現，PPⅦ干預HT29 細胞的IC50值為（6.94±0.52）μg/mL，干預LoVo 細胞的IC50值為（5.75±0.31）μg/mL。低于順鉑干預的HT29 細胞（12.18±1.33）μg/mL 和LoVo 細胞（11.80±1.66）μg/mL，而PPⅠ和PPⅡ對應數值均高于順鉑，見表1。 據此，后續實驗選用PPⅦ進行。

圖1 重樓皂苷（PP）Ⅰ、PPⅡ、PPⅦ、順鉑對人結直腸癌細胞HT29 和LoVo 活力的影響

表1 重樓皂苷與順鉑對應的IC50 值比較

2.2 PPⅦ抑制HT29 和LoVo 細胞的克隆形成能力

由于克隆實驗細胞種植數量較少，設定質量濃度3 μg/mL、6 μg/mL 均無法產生細胞團，故依次減少藥物質量濃度直至0.75 μg/mL 可形成細胞團。結果顯示，與0 μg/mL 組比較，0.75 μg/mL 組能顯著抑制HT29 的克隆形成數目（P＜0.01）。 對LoVo 細胞，0.375 μg/mL、0.750 μg/mL 劑量組的PPⅦ可顯著抑制其克隆形成數目（P＜0.05）。說明隨著PPⅦ質量濃度的增加，細胞克隆形成數目減少，對克隆形成的抑制率升高。 見表2。

表2 不同質量濃度重樓皂苷Ⅶ對細胞克隆形成情況影響的比較（）

表2 不同質量濃度重樓皂苷Ⅶ對細胞克隆形成情況影響的比較（）

注：與0 μg/mL 組比較，＊P＜0.05；與0.375 μg/mL 組比較，＃P＜0.05。

組別 克隆形成數/個 克隆抑制率/%HT29 細胞 LoVo 細胞 HT29 細胞 LoVo 細胞0 μg/mL 組 152.00±16.39 74.00±3.27 - -0.375 μg/mL 組 120.67±16.98 57.00±2.45＊ 20.89±3.97＊ 22.97±0.09＊0.750 μg/mL 組 25.67±11.26＊＃ 27.33±2.05＊＃ 83.62±6.54＊＃ 62.95±3.63＊＃

2.3 PPⅦ抑制HT-29 和LoVo 細胞的增殖能力

使用BeyoClickTM EdU 細胞增殖檢測試劑盒檢測PPⅦ對細胞增殖情況的影響，PPⅦ干預HT29細胞的IC50值為（6.94±0.52）μg/mL，干預LoVo 細胞的IC50值為（5.75±0.31）μg/mL，故選擇梯度濃度PPⅦ（0 μg/mL、3 μg/mL、6 μg/mL）干預細胞48 h后，檢測450 nm 處吸光度。 發現與0 μg/mL 組比較，PPⅦ質量濃度為3 μg/mL、6 μg/mL 組增殖率均降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。 與3 μg/mL 組比較，6 μg/mL 組HT29 細胞增殖率降低不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05），LoVo 細胞增殖率降低明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。 結果說明隨著PPⅦ質量濃度增加至IC50值，細胞增殖能力顯著減弱。見表3。

表3 不同質量濃度重樓皂苷Ⅶ對細胞增殖影響比較（）

表3 不同質量濃度重樓皂苷Ⅶ對細胞增殖影響比較（）

注：與0 μg/mL 組比較，＊P＜0.05；與3 μg/mL 組比較，＃P＜0.05。

組別 增殖率/%HT29 細胞 LoVo 細胞0 μg/mL 組 - -3 μg/mL 組 -0.35±0.11＊ -0.33±0.10＊6 μg/mL 組 -0.44±0.09＊ -0.60±0.07＊＃

2.4 PPⅦ對HT-29 和LoVo 細胞中PI3K/Akt 信號通路的影響

用梯度濃度的PPⅦ（0 μg/mL、3 μg/mL、6 μg/mL）處理HT29 和LoVo 細胞48 h，PPⅦ可以下調PI3K、Akt 的磷酸化水平。 見表4、表5、圖2。

圖2 重樓皂苷Ⅶ處理人結直腸癌細胞HT-29 和LoVo 細胞48 h 后PI3K/Akt 信號通路中的蛋白表達

表4 重樓皂苷Ⅶ對HT29 細胞PI3K/Akt 通路相關蛋白表達的影響（）

表4 重樓皂苷Ⅶ對HT29 細胞PI3K/Akt 通路相關蛋白表達的影響（）

注：GAPDH 為甘油醛3 磷酸脫氫酶，Akt 為蛋白激酶B，p-Akt 為磷酸化蛋白激酶B，PI3K 為磷脂酰肌醇3 激酶，p-PI3K 為磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶。與0 μg/mL 組比較，＊P＜0.05，與3 μg/mL 組比較，＃P＜0.05。

組別 Akt/GAPDH p-Akt/GAPDH p-Akt/Akt PI3K/GAPDH p-PI3K/GAPDH p-PI3K/PI3K 0 μg/mL 組 0.97±0.10 1.02±0.14 1.05±0.07 1.04±0.13 1.20±0.13 1.16±0.05 3 μg/mL 組 0.92±0.04 0.70±0.09＊ 0.76±0.06＊ 0.99±0.12 0.80±0.08＊ 0.81±0.02＊6 μg/mL 組 1.03±0.13 0.34±0.06＊＃ 0.34±0.08＊＃ 1.06±0.15 0.51±0.13＊ 0.49±0.14＊＃

表5 重樓皂苷Ⅶ對LoVo 細胞PI3K/Akt 通路相關蛋白表達的影響（）

表5 重樓皂苷Ⅶ對LoVo 細胞PI3K/Akt 通路相關蛋白表達的影響（）

注：GAPDH 為甘油醛3 磷酸脫氫酶，Akt 為蛋白激酶B，p-Akt 為磷酸化蛋白激酶B，PI3K 為磷脂酰肌醇3 激酶，p-PI3K 為磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶。與0 μg/mL 組比較，＊P＜0.05；與3 μg/mL 組比較，＃P＜0.05。

組別 Akt/GAPDH p-Akt/GAPDH p-Akt/Akt PI3K/GAPDH p-PI3K/GAPDH p-PI3K/PI3K 0 μg/mL 組 1.04±0.02 0.99±0.02 0.96±0.02 0.98±0.00 1.06±0.03 1.08±0.03 3 μg/mL 組 1.01±0.04 0.99±0.02 0.98±0.01 0.76±0.04＊ 0.83±0.03＊ 1.08±0.02 6 μg/mL 組 1.06±0.04 0.25±0.01＊＃ 0.23±0.00＊＃ 1.01±0.04＃ 0.61±0.02＊＃ 0.61±0.01＊＃

3 討論

CRC 是胃腸道中常見的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，隨著病情的進展患者逐漸出現便血、排便習慣改變、腹瀉、腹瀉與便秘交替、腹痛等表現，進展到晚期則會出現貧血、體質量減輕等全身癥狀。 根據臨床表現，可將CRC 歸屬于中醫學積聚、腸澼、腸覃等病證范疇［7］。 CRC 的發生與先天稟賦不足、后天失養有關，慢性腸道疾病可損傷陽氣，耗傷氣陰，使陰陽失調，主要病機為濕熱蘊結、氣滯血瘀、正氣虧虛等［8］。 但是近年來隨著癌毒理論的提出，對腸息肉病因的認識不斷深入，魏小曼等［9］認為，脾氣虧虛是大腸癌發生發展的內在基礎，濕熱瘀毒是大腸癌發生發展的重要條件，故治療中抗癌解毒是關鍵點。

研究表明，中藥及其提取物對腫瘤具有抑制作用，具體體現在抗增殖、促凋亡、抗轉移、抗血管生成、調節自噬、逆轉多藥耐藥等方面［10］。 重樓具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效，藥理作用研究發現其具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、止血、鎮痛、抑制精子活性、治療淋巴結結核潰瘍等作用［11］，重樓軟堅湯輔助放化療可以提高肺癌患者近遠期療效，2 年生存率顯著提高［12］。 近年來，國內外研究證明，在治療惡性腫瘤方面，PP 及其提取物可以抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制細胞侵襲和遷移［13］。張特等［14］研究發現，PPⅠ可以通過直接靶向抑制表皮生長因子受體，以阻斷其下游信號通路起到治療乳腺癌的作用。 張亮等［15］研究發現，PPA 與轉錄因子家族-1 相互結合可以阻斷蛋白磷酸酶2A 癌性抑制因子/蛋白激酶B 信號通路，從而抑制胃癌細胞的增殖并誘導凋亡。 何昊等［16］研究發現，PPⅦ能夠抑制人胰腺癌PANC-1 細胞的增殖、遷移和侵襲，并且下調程序性死亡分子配體-1 蛋白表達，參與免疫調節，從而抑制胰腺癌的發展。

CRC 最主要的惡性生物學特征為淋巴轉移和遠端轉移，而去分化、失去黏附約束以及運動性和侵襲性增強，都是腫瘤增加惡性質的標志［17］。 研究發現，PI3K/Akt/mTOR 通路與CRC 的發病、轉移、耐藥和干細胞相關，該通路是藥物治療的首選靶點［18］。PI3K/Akt 信號通路激活是調節腫瘤細胞增殖和凋亡的經典信號通路之一，該通路與卵巢癌、膀胱癌及CRC 的發展密切相關［19-21］。He 等［22］研究報道，PPⅦ通過下調PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 的表達阻斷PI3K/Akt通路激活，進而抑制人肺癌A549 細胞增殖并誘導細胞凋亡。 因此，通過抑制PI3K/Akt 信號通路的水平治療癌癥可能會成為未來治療CRC 的發展方向。在本實驗中，采用MTT 比色法驗證了PPⅦ對CRC細胞增殖的抑制作用，結果表明CRC 細胞HT29 和LoVo 經PPⅦ干預48 h 后，藥物濃度越高，腫瘤細胞的活力越差，細胞克隆實驗、細胞增殖實驗表明，隨著藥物濃度的增加，細胞的增殖能力逐漸降低，說明PPⅦ可隨著劑量增大有效抑制CRC 細胞的惡性生物學行為。

PI3K/Akt 信號通路由磷酸化磷脂酰肌醇3-羥基的脂類激酶活性PI3K 及下游Akt 組成，PI3K 是由p110 和p85 亞基組成的異源二聚體，可被各種生長因子受體和癌基因啟動，通過磷酸化Akt 的Ser473和Thr308 位點從而將其激活［23］。 因此，抑制PI3K/AKT 信號通路是多種藥物對抗CRC 作用的機制。研究證實，從紫草中分離的脫氧紫草素可以通過下調PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路抑制CRC 的發展，蓮房原花青素可能是通過抑制Ras相關C3 肉毒菌毒物底物1（RAC1）/PI3K/AkT 信號通路實現抑制腫瘤惡性生物學行為的作用，紫花前胡素可能通過抑制PI3K/Akt 信號通路的激活影響CRC 細胞的增殖、凋亡及遷移［24-25］。在本研究中我們發現PPⅦ下調人結直腸癌細胞HT29 和LoVo 中PI3K 和Akt 蛋白磷酸化表達水平，結果提示PPⅦ可能通過降低PI3K 和Akt 磷酸化水平抑制PI3K/Akt通路的激活，從而抑制HT29 和LoVo 細胞的增殖并誘導細胞凋亡。

綜上所述，PPⅦ對CRC 細胞的增殖具有明顯抑制作用，且隨著藥物濃度的提高抑制作用越發顯著，其機制可能與通過下調PI3K、Akt 的磷酸化水平，抑制PI3K/Akt 信號通路有關。 該研究為PPⅦ治療CRC 提供實驗依據和新的思路，并且為天然植物成分進行CRC 的治療提供了一定的理論依據，下一步將對PPⅦ治療CRC 的分子機制進行更加深入研究。