三種腎陰虛證動物模型造模方法比較研究

王志鑫，崔艷艷，宋婷婷，高田田，申 琦，戚語宸，李敏潔，王杰瓊

（山東中醫藥大學，山東 濟南 250355）

陰虛是臨床上諸多病證的基本病機［1］，腎陰虛證指腎陰虧損，失于滋養，虛熱內擾，以五心煩熱、腰膝酸軟、形體消瘦、口干舌燥、眩暈耳鳴等為常見癥的證候［2］。 腎陰虛證造模方法多種多樣，通過查閱文獻發現，目前最常用的造模方法有三種，分別以甲狀腺片、甲狀腺片聯合利血平及腎上腺皮質激素氫化可的松注射液灌胃［3］，造模結束后，均能表現腎陰虛證的主要癥狀，但三種造模方法哪種更加穩定可靠，鮮見研究。 本文通過比較三種模型制備方法，探究腎陰虛證的最佳模型制備方案，旨在為腎陰虛證的研究提供可靠穩定的動物模型。

1 材料

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級雌性KM 種小鼠40 只，6～8 周齡，體質量（20±2）g；SPF 級雌性SD 大鼠60只，6～8 周齡，體質量（200±20）g。 大鼠、小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）2016-0011。 動物入室后常規飼養于獨立通氣籠（IVC）環境中，使用許可證號SYXK（魯）20170022。 動物自由飲食飲水，12/12 h 光暗照射，室溫（22±3）℃，相對濕度為40%～60%。 涉及到動物實驗相關的內容和程序都已通過山東中醫藥大學動物倫理委員會審批（審批號：DWSY201703013）。

1.2 藥物和試劑

甲狀腺片（上海中華藥業有限公司，國藥準字H31022151）；復方利血平片（亞寶藥業集團股份有限公司，國藥準字H14023613）；氫化可的松注射液（天津金耀藥業有限公司，國藥準字H12020887）；生理鹽水（辰欣藥業股份有限公司，國藥準字H3702 2336）；Mouse cAMP ELISA KIT（江蘇科晶生物科技有限公司，批號KJ-2757B）；Mouse cGMP ELISA KIT（江蘇科晶生物科技有限公司，批號KJ-3280B）；大鼠環磷酸腺苷（cAMP）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號H164-1-2）；大鼠環磷酸鳥苷（cGMP）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號H163-1-2）。

1.3 主要儀器

歐普士MS 紅外測溫儀（深圳市歐普士電子技術有限公司，型號粵制00000573），高速冷凍離心機［賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號YZB/GER 1841-2014］，酶聯免疫分析儀（BIOBASE，山東博科干細胞應用研究院有限公司，型號BK-EL10C），基因研究型超純水機（青島富勒姆科技有限公司，型號FJY1002-UVF-P）。

2 實驗方法

2.1 三種腎陰虛證小鼠模型制備

2.1.1 造模及取材

2.1.1.1 動物造模［4-8］

適應性飼養1 周后，將40 只KM 種小鼠隨機分為對照組、甲狀腺片組、甲狀腺片聯合利血平組（聯合組）、氫化可的松組4 組，每組10 只。 灌胃給藥量為每只0.2 mL·10 g-1，對照組給予等量生理鹽水14 d；甲狀腺片組給予甲狀腺片混懸液160 mg·kg-1，給藥14 d；聯合組灌胃甲狀腺片150 mg·kg-1及利血平1 mg·kg-1混懸液，給藥7 d；氫化可的松灌胃組灌胃50 mg·kg-1，給藥4 d。

2.1.1.2 取材

4 組小鼠造模結束后摘眼球取血，血清于室溫靜置0.5 h，離心，分離血清，同時頸椎脫臼處死各組小鼠，取卵巢、子宮、腎上腺，測量臟器指數。

2.1.2 檢測指標

2.1.2.1 一般情況觀察

觀察各組小鼠一般活動情況及其皮毛色澤、進食量、大便形態等。

2.1.2.2 小鼠體質量和體溫變化［9-10］

每天上午9∶00 給藥前測定小鼠體質量，至造模結束取材前，并計算小鼠體質量變化率，公式為：在給藥后半小時內測定小鼠面溫、尾溫，平行測定3 次，取平均值進行顯著性分析。

2.1.2.3 血清cAMP、cGMP 含量檢測

采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清cAMP、cGMP 含量，按照試劑盒說明書進行測定。

2.1.2.4 小鼠臟器指數檢測

頸椎脫臼處死小鼠，剖腹取出子宮、卵巢及腎上腺，生理鹽水沖洗表面血漬后，吸水紙吸干殘留水分，稱定重量，依照下式計算各臟器指數。

臟器指數= 臟器濕重/體質量×100%。

2.1.3 統計學方法

所有數據均采用GraphPad Prism 8.3 進行統計處理，各組計量數據均以表示，采用單因素方差分析，取α=0.05 作為檢驗水準。

2.2 腎陰虛證大鼠模型驗證

根據小鼠模型研究（具體見“實驗結果3.1 項下”），發現甲狀腺片灌胃及甲狀腺片聯合利血平灌胃兩種造模方法效果比較好。 基于此，進一步驗證大鼠腎陰虛模型最佳造模方法，以適應不同實驗研究的需求，具體方法如下。

2.2.1 大鼠造模［6，11］

適應性飼養1 周后，將60 只SD 雌性大鼠隨機分為對照組、甲狀腺片組、聯合組3 組，每組20 只。于每日上午8∶30 灌胃，各組分別灌胃純水、甲狀腺片混懸液（160 mg·kg-1）、甲狀腺片聯合利血平混懸液（150 mg·kg-1+1 mg·kg-1），灌胃體積為1 mL·100 g-1。對照組及甲狀腺片組灌胃14 d，聯合組灌胃7 d。

2.2.2 指標檢測

觀察大鼠一般情況、體質量變化、體溫變化及血清cAMP、cGMP 含量，檢測方法同2.1.2 項下所列內容。

2.2.3 統計學方法

同2.1.3 項下所列方法。

3 實驗結果

3.1 三種腎陰虛證小鼠模型比較研究結果

3.1.1 一般情況

對照組小鼠一般狀況良好，攝食、飲水正常，毛色光潔，反應靈敏，活動自如，體質量顯著增加。 模型組小鼠毛色黃且無光澤，飲食量減少，大便干燥，小便發黃，抓握時反應劇烈，易激惹。

3.1.2 各組小鼠體質量變化率比較

與對照組比較，三種模型制備方法造模完成后，各組小鼠體質量變化率均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠體質量變化率比較（，%）

表1 各組小鼠體質量變化率比較（，%）

注：與同時段對照組比較，＊P＜0.05。

第4 天 第7 天 第14 天對照組 10 25.97±5.15 31.00±5.63 42.67±11.15甲狀腺片組 10 18.48±2.97＊25.95±6.55 29.87±6.25＊聯合組 10 12.22±4.01＊22.20±6.99＊ -氫化可的松組 10 20.26±3.65＊ - -組別 只數

3.1.3 各組小鼠面溫變化情況

造模結束后，甲狀腺素組小鼠面溫較對照組顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），其他組小鼠面溫與對照組比較，具有升高趨勢，但差異無統計學意義。 見圖1、表2。

圖1 不同造模方法各組小鼠面溫與對照組比較

表2 各組小鼠面溫變化比較（，℃）

表2 各組小鼠面溫變化比較（，℃）

注：與同時段對照組比較，*P＜0.05。

組別 只數 第4 天 第7 天 第14 天對照組 10 28.99±0.97 29.20±0.39 29.41±0.31甲狀腺片組 10 30.06±0.67* 29.81±0.53* 30.49±0.26*聯合組 10 29.23±0.61 29.67±0.34 -氫化可的松組 10 29.56±0.53 - -

3.1.4 各組小鼠尾溫變化情況

造模結束后，甲狀腺片組小鼠尾溫較對照組顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），而其他組小鼠尾溫有升高趨勢，但差異無統計學意義。 見圖2、表3。

圖2 不同造模方法組小鼠尾溫與對照組比較

表3 各組小鼠尾溫變化比較（，℃）

表3 各組小鼠尾溫變化比較（，℃）

注：與同時段對照組比較，*P＜0.05。

組別 只數 第4 天 第7 天 第14 天對照組 10 31.06±0.42 30.56±0.67 31.67±0.23甲狀腺片組 10 30.95±0.66 31.00±0.44 32.65±0.49*聯合組 10 30.50±0.38 30.69±0.60 -氫化可的松組 10 31.32±0.47 - -

3.1.5 各組小鼠血清cAMP、cGMP 含量比較

與對照組比較，甲狀腺片組小鼠血清cAMP 含量顯著升高（P＜0.05），符合腎陰虛證臨床癥狀，氫化可的松組小鼠血清cAMP 含量有上升趨勢，但差異無統計學意義。 與對照組比較，甲狀腺片組小鼠cGMP 含量有上升趨勢，但差異無統計學意義，聯合組小鼠血清cGMP 含量降低（P＜0.05），符合腎陰虛證臨床癥狀。 見表4。

表4 各組小鼠血清cAMP、cGMP 含量比較（，pg/mL）

表4 各組小鼠血清cAMP、cGMP 含量比較（，pg/mL）

注：cAMP 為環磷酸腺苷，cGMP 為環磷酸鳥苷。與對照組比較，＊P＜0.05。

組別 只數 cAMP cGMP對照組 10 7.016±4.334 1.044±1.040甲狀腺片組 10 27.630±16.300＊ 2.139±0.670聯合組 10 4.677±0.870 0.081±0.020＊氫化可的松組 10 18.400±15.490 0.205±0.196

3.1.6 各組小鼠臟器指數比較

與對照組比較，甲狀腺片組卵巢和腎上腺指數變化差異無統計學意義，但子宮指數降低（P＜0.05）；聯合組小鼠卵巢和腎上腺臟器指數均升高（P＜0.05），子宮指數降低（P＜0.05）；氫化可的松組卵巢指數顯著升高（P＜0.05），但子宮和腎上腺指數顯著降低（P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠卵巢、子宮及腎上腺臟器指數比較（，%）

表5 各組小鼠卵巢、子宮及腎上腺臟器指數比較（，%）

注：與對照組比較，＊P＜0.05。

組別 只數 卵巢指數 子宮指數 腎上腺指數對照組 10 0.032±0.007 0.456±0.150 0.031±0.004甲狀腺片組 10 0.025±0.005 0.249±0.129＊ 0.037±0.007聯合組 10 0.066±0.010＊ 0.243±0.088＊ 0.038±0.006＊氫化可的松組 10 0.058±0.012＊ 0.191±0.077＊ 0.023±0.002＊

綜合各造模方法下小鼠一般情況及體溫（面溫、尾溫）、血清指標（cAMP、cGMP）、臟器指數等結果，給予小鼠灌服甲狀腺片及甲狀腺片聯合利血平兩種方法造模結果較為良好。 所以，將在大鼠上進行這兩種造模方法的復測與比較。 結果如下。

3.2 腎陰虛證大鼠模型驗證結果

3.2.1 各組大鼠體質量變化率比較

與對照組比較，甲狀腺片組及聯合組大鼠體質量變化率顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表6。

表6 各組大鼠體質量變化率比較（，%）

表6 各組大鼠體質量變化率比較（，%）

注：與對照組比較，＊P＜0.05。

第7 天 第14 天對照組 20 11.48±1.67 16.44±1.53甲狀腺片組 20 9.21±1.67 10.60±1.53＊聯合組 20 -0.96±1.67＊ -組別 只數

3.2.2 各組大鼠面溫、尾溫比較

造模第7 天時，與對照組比較，甲狀腺片組及聯合組大鼠面溫、尾溫均顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。 造模第14 天時，與對照組比較，甲狀腺片組大鼠面溫和尾溫均顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表7。

表7 各組大鼠面溫、尾溫比較（s，℃）

表7 各組大鼠面溫、尾溫比較（s，℃）

注：與同時段對照組比較，＊P＜0.05。

組別 只數 面部溫度 尾部溫度第7 天 第14 天 第7 天 第14 天對照組 20 30.99±1.05 31.78±0.36 25.57±1.09 27.32±1.05甲狀腺片組 20 32.35±0.40＊ 33.00±0.33＊ 26.98±1.02＊ 30.05±1.17＊聯合組 20 32.51±0.31＊ - 30.13±1.36＊ -

3.2.3 各組大鼠血清cAMP、cGMP 含量比較

造模結束后，與對照組比較，甲狀腺片組血清cAMP 含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05），符合腎陰虛證臨床癥狀。 與對照組比較，聯合組血清cGMP 含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05），符合腎陰虛證臨床癥狀。 見表8。

表8 各組大鼠血清cAMP、cGMP 含量比較（，mol/mL）

表8 各組大鼠血清cAMP、cGMP 含量比較（，mol/mL）

注：cAMP 為環磷酸腺苷，cGMP 為環磷酸鳥苷。與對照組比較，＊P＜0.05。

組別 只數 cAMP cGMP對照組 20 54.44±9.33 60.95±29.31甲狀腺片組 20 63.43±13.02＊ 53.52±32.74聯合組 20 50.57±10.40 95.42±25.19＊

4 討論

腎陰虛證作為中醫基本證型之一，多見于骨質疏松癥、2 型糖尿病及原發性高血壓等疾?。?2］。 腎陰虛的形成常見以下幾種原因：稟賦不足，腎陰素虧；或情志內傷，五志過極，化火傷陰；或失血耗液，過服壯陽溫燥之品，耗傷腎陰。 《素問·六節藏象論》曰：“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也，其華在毛，其充在皮?！蹦I陰不足，使機體失去濡養，則表現為毛發枯燥，形體消瘦；腎陰虧虛，陰虛不能制陽，陽氣上亢而虛熱內生，虛邪在里，發為潮熱，手足濈濈汗出，五心煩熱，顴紅面赤；陰虛火旺，膀胱化源不足，則見小便短赤；陰液不足，大腸失去濡潤，則大便干結。

目前，腎陰虛證模型制備方法有甲狀腺素類激素、腎上腺素類激素、溫燥性中藥灌胃以及行勞傷陰等方法［13-15］，且實驗對象多為嚙齒類哺乳動物［16］，又因臨床腎陰虛證患者多為女性［17］，故本實驗采用雌性小鼠、大鼠作為模型載體進行研究。 溫燥性中藥灌胃造模是最為符合中醫病因的造模方法，制備的模型為病因模型，但因其造模時間比較長，造模后體溫升高不明顯等原因，在實際應用中該造模方法使用較少［16］。行勞傷陰法制備腎陰虛模型主要是利用長時期超負荷運動，造成動物體內陰氣大量損耗，陰不制陽，陽氣亢盛，從而表現出體溫升高、體質量降低、大便干燥等癥狀。 該造模方法在病因上比較符合臨床，且人為干擾較少，但由于造模時間難以把控，且容易出現陽虛現象，故而限制了該造模方法的應用［18］。 大劑量給予甲狀腺素或腎上腺皮質激素等激素造模方法屬于病理模型制備方法，此兩種造模方法制備的模型可以反映出臨床腎陰虛癥狀，且具有造模時間短、操作方便、模型穩定等優勢，在實際應用中較為普遍［19］。因此，本研究針對上述兩種腎陰虛模型制備方法進行比較。

本實驗研究結果顯示，與對照組比較，各組小鼠分別灌胃甲狀腺片、甲狀腺片聯合利血平以及氫化可的松后，均能引起小鼠體質量降低，且體質量變化率差異有統計學意義。 同時，給予大鼠甲狀腺片及甲狀腺片聯合利血平后，體質量同樣明顯降低。 這可能是因為體內高甲狀腺素含量，使得機體蛋白質、糖原和脂肪分解增加，基礎代謝率升高，身體產熱量增加，小鼠體質量下降，體溫顯著升高［20］。 小鼠和大鼠面溫及尾溫實驗結果顯示，給予甲狀腺片能夠很好地模擬出臨床腎陰虛患者潮熱汗出的現象，但給予氫化可的松后，小鼠面溫和尾溫變化不明顯，未能表現出腎陰虛證潮熱顴紅、五心煩熱的癥狀。 給予小鼠甲狀腺片及利血平灌胃可能會引起小鼠子宮、卵巢和腎上腺臟器指數發生變化，這可能與腎上腺能神經介質水平降低，負反饋性調節體內性激素水平升高，促使卵巢分泌更多的性激素，導致卵巢生理性增大相關［21］。 過量皮質激素可能會導致腎上腺組織發生皮質變薄、球狀帶和束狀帶變小、體積縮小、部分壞死等不良反應，故而實驗結果顯示氫化可的松組腎上腺臟器指數降低［7］。

現代研究發現，腎陰虛與下丘腦-垂體-靶腺軸（甲狀腺、腎上腺）有關，環核苷酸（cAMP，cGMP）是細胞間第二信使，正常機體中cAMP 和cGMP 相互拮抗、相互制約，處于動態平衡狀態，參與調節生物體不同的生理活動及生化代謝［22-24］。cAMP、cGMP 的平衡失調，會引起細胞功能明顯改變，導致疾病的發生［25］。 血清cAMP 和cGMP 含量變化是目前判斷腎陰虛證最常用的客觀指標［9，26］。 實驗結果顯示，與對照組比較，甲狀腺片組小鼠和大鼠血清cAMP 含量顯著上升，差異有統計學意義。 聯合組小鼠血清cAMP含量變化無明顯差異，但cGMP 含量顯著降低，且差異有統計學意義。 在大鼠實驗中，實驗結果顯示，血清cGMP 含量顯著升高，從而反映了聯合組造模雖然可以減少模型制備時間，但模型穩定性有降低的風險。 本實驗結果顯示，小鼠給予氫化可的松灌胃后，血清cAMP、cGMP 含量雖有升高及降低趨勢，但與對照組比較，差異無統計學意義，故而氫化可的松灌胃制備的腎陰虛證模型表征較差，且氫化可的松制備腎陰虛模型需要注意給藥劑量及給藥時間，低劑量可造成腎陽虛模型，而高劑量可制備腎陰虛動物模型［3，27］。 同時，腎上腺皮質類藥物制備腎陰虛動物模型時，有時會出現前期表現為腎陰虛而后期表現為腎陽虛的現象，具有模型穩定性差的隱患［28］。

綜上所述，甲狀腺片灌胃小鼠、大鼠均可以較好地制備腎陰虛動物模型，腎陰虛模型表征明顯，穩定性高，操作簡單，且對子宮、卵巢、腎上腺等臟器影響較小，而甲狀腺片聯合利血平及氫化可的松灌胃造模具有一定的局限性。 因此，甲狀腺片灌胃小鼠、大鼠是一種比較理想的腎陰虛模型制備方法，可用于中醫藥相關領域的深入研究。