體外受精胚胎移植嬰兒先天性聾臨床和基因檢測分析

胡民強 譚東輝 楊曙 朱倩晨 賴若沙 謝華平 鄧健航 鄧忠 謝鼎華 伍偉景*

1 中南大學湘雅二醫院耳鼻咽喉頭頸外科（長沙 410011）

2 中南大學耳科研究所（長沙 410011）

3 湘南學院附屬醫院（郴州 423000）

4 湖南師范大學生命科學學院（長沙 410081）

5 中南大學湘雅醫學院附屬株洲醫院耳鼻咽喉頭頸外科（株洲 412000）

越來越多的夫妻通過輔助生殖技術來幫助懷孕，其中體外受精胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）最為常見，通常被稱為“試管嬰兒”技術[1]。臨床上試管嬰兒技術不僅用于解決生育障礙的困境，對于某些單基因遺傳病可通過體外阻斷，達到優生優育的目的。試管嬰兒并非自然生殖，研究發現通過輔助生育技術育出的嬰兒出生缺陷的幾率比自然受孕的嬰兒要高[2]，這些缺陷的出現是受到輔助生育技術處理流程的影響，還是由遺傳因素所致，目前尚無明確結論[3]。

臨床上時常遇到，采取IVF-ET 技術妊娠的夫妻，即使雙方沒有耳聾病史和家族史，也會生育出先天性聾的嬰兒。本文對3 個IVF-ET 先天性聾家庭進行了詳盡的臨床資料收集、遺傳特征分析及遺傳學檢測，對包括4 名先天性感音神經性聾（sensorineural hearing loss,SNHL）患兒在內的5 名嬰兒及其父母進行了全外顯子組基因測序（whole exome sequencing,WES）和Sanger測序分析，以期為明確這些嬰兒出現先天性SNHL 的原因，避免IVFET生育聽力缺陷嬰兒提供指導。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究收集2020年1月至5月在中南大學湘雅二醫院就診的3 個IVF-ET 先天性耳聾家庭，均為父母親本供精供卵。3 個家庭共生育5 名嬰兒，家庭1 和家庭2 為異卵孿生，足月剖宮產，家庭3 為單胎，足月順產。其中家庭1男嬰和女嬰，家庭2女嬰，家庭3 男嬰出生時新生兒聽力篩查均未通過，家庭2男嬰聽力篩查通過。

對3 個家庭成員的家族史、遺傳史、臨床表現等資料進行收集，排除相關病毒感染、缺氧及病理性黃疸等致聾病因，對所有嬰兒及其父母共11 名成員分別進行相關耳科和全身檢查，全面聽力學評估，簽署知情同意書后，采取外周靜脈血進行遺傳基因檢測。嬰幼兒聽力評估采取聽性腦干反應、多頻穩態反應、耳聲發射和聲導抗測試為主，結合聲場測聽進行主觀聽力評估；成人聽力評估采取純音測聽、聲導抗和耳聲發射測試。確診為雙耳極重度SNHL 的4 名嬰兒均進行耳部高分辨率CT 和磁共振成像檢查，并接受人工耳蝸植入。該研究得到中南大學湘雅二醫院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 全外顯子組測序

采用基因組DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，經Qubit3.0 熒光定量儀鑒定，所提取的DNA濃度和純度合格，可用于后續實驗。

應用基于目標序列捕獲的二代測序技術進行WES 測序鑒定。實驗流程包括：文庫構建，分選純化DNA及片段化，末端修復，3’末端加A，連接測序接頭，文庫純化和片段大小篩選，PCR擴增文庫，全外顯子芯片雜交，雜交文庫清洗及純化，PCR 擴增外顯子DNA文庫，文庫質量檢測，上機測序。

1.2.2 生物信息分析

對測序數據進行匯總，獲取每個樣本原始序列數量和測序讀長，以“Q20(%)”和“Q30(%)”分別表示原始數據中測序質量值Q 不低于20和30的序列堿基比例。通過對三組家庭進行WES，分析發現數據量在13GB～18GB 之間，平均測序深度在155X，目標測序區域10X 覆蓋堿基覆蓋比例約99%，Q20 的比例均在97%以上，Q30 的比例在92%以上。

堿基質量評估，比對，使用BWA 工具將測序序列比對到hg19。比對完成使用Picard 工具進行Q20，Q30 平均測序深度等數據統計。使用GATK Haplotype Caller 方法檢測樣本的SNV/InDel。通過annovar 工具對突變進行基因功能等注釋。運用SNPscan 分型技術檢測96個高頻位點，驗證全外顯子組測序的準確性。

1.2.3 致病基因篩選

針對全部的SNV/InDel 位點，保留符合這些條件的位點用于進一步分析：①頻率性數據庫選擇低頻突變：1000Genomes的頻率低于0.01；②屬于外顯子突變或剪切位點突變的所有不是同義突變的位點；③突變在保守性數據庫（Sift,POLYPhen V2,Mutation Taster,Cadd,Dann,dbscSNV）中預測為有害；④基于基因功能以及基因與疾病篩選和耳聾相關的基因。

1.2.4 Sanger測序驗證

在WES 的基礎上對10 個樣本的7 個位點進行了測序驗證，總共設計了7 對引物。①DNA 樣本取1l 1%agarose 電泳對其樣本進行質量及濃度估計，再根據濃度將樣本稀釋到工作濃度5-10ng/l，沒有DNA 條帶的樣本保持原濃度。②設計PCR 反應，包括PCR 引物和設計PCR 條件。③利用SAP 和Exo I 進行PCR 純化。④測序產物上ABI3730XL 測序儀，測序文件用Polyphred 軟件分析，最后人工校對，整理出結果。

2 結果

2.1 臨床結果

3 個家庭父母聽力均正常，家族中無耳聾患者。家庭1母親受孕時31歲，有宮外孕史，患“甲狀腺功能減退”8年。家庭2 母親受孕時29 歲，患“多囊卵巢綜合征”，月經紊亂。家庭3 母親受孕時32歲，患“輸卵管不通，多囊卵巢綜合征”，月經紊亂，有不明原因流產史。

聽力評估結果表明，家庭1 雙胞胎男嬰和女嬰均為雙耳極重度SNHL；家庭2 雙胞胎中男嬰聽力正常，女嬰為雙耳極重度SNHL；家庭3 男嬰為雙耳極重度SNHL。

影像評估顯示家庭1 兩名耳聾嬰兒內耳發育無畸形，家庭2 耳聾女嬰為Mondini 畸形并前庭水管擴大（圖1）。家庭3 耳聾男嬰雙側內聽道狹窄（圖2）。

圖1 家庭2聾兒耳部CT顯示Mondini畸形并前庭水管擴大。Fig.1 CT scan of deaf infant in Family 2 showing Mondini malformation and enlarged vestibular conduct.

圖2 家庭3聾兒耳部CT顯示內聽道狹窄。Fig.2 CT scan of deaf infant in Family 3 showing stenosis of internal auditory canal.

2.2 基因檢測結果

運用WES 對約20000 個基因測序后發現突變候選基因3193個，分析篩選出4個常見與耳聾相關基因，其他為目前認為與耳聾無相關性的隱性基因和新生突變基因。

2.2.1 三組家庭耳聾相關基因突變

三組家庭11 名成員WES 基因檢測共發現4 個基因7 個突變位點，包括MYO3A、MYO15A、SLC26A4和TPO基因（表1）。

表1 基因檢測結果（人）,n=11Table 1 Genetic test results(human),n=11

2.2.2 三組家庭父母及患兒的耳聾基因突變位點

家庭1患兒父母均為MYO3A雜合突變，其突變位點相同，為MYO3A:NM_017433:exon32:c.4462A＞G:p.K1488E（圖3A,B）。其父母同時還攜帶突變位點不同的MYO15A雜合突變，父親突變位點為：MYO15A:NM_016239:exon22:c.5638G＞A:p.G1880R（圖4A）；母親突變位點為：MYO15A:NM_016239:exon4:c.3693-2A＞G（圖4B），該兩處突變位點位于剪切區，不參與蛋白質的合成，過去未見報道。

圖3 家庭1 MYO3A 基因測序圖。A：先證者父親擁有雜合突變:c.4462A＞G；B：先證者母親擁有雜合突變:c.4462A＞G；C：男先證者擁有純合突變:c.4462A＞G；D：女先證者擁有雜合突變:c.4462A＞G。Fig.3 MYO3A gene sequencing of Family 1.A:Proband's father owns heterozygous mutation:c.4462A＞G ; B: Proband's mother owns heterozygous mutation:c.4462A＞G; C: Male proband owns homozygous mutation:c.4462A＞G; D: Female proband owns heterozygous mutation:c.4462A＞G.

圖4 家庭1 MYO15A 基因測序圖。A：先證者父親和男女患兒擁有雜合突變:c.5638G＞A；B：先證者母親和男女患兒擁有雜合突變c.3693-2A＞G。Fig.4 Gene sequencing of Family 1 MYO15A.A: Proband's father the male and female probands own heterozygous mutation:c.5638G＞A; B: Proband's mother and the male and female probands own heterozygous mutation:c.3693-2A＞G.

家庭1 男患兒為MYO3A基因純合突變，與父母共有突變位點MYO3A: NM_017433: exon32:c.4462A＞G:p.K1488E（圖3C），同時還攜帶其父母的MYO15A突變位點，表現為復合雜合突變，與母親共有突變位點MYO15A:NM_016239:exon4:c.3693-2A＞G，與父親共有突變位點MYO15A:NM_016239:exon22:c.5638G＞A:p.G1880R。女患兒為MYO3A基因雜合突變，突變位點與其父母相同（圖3D），同時也攜帶來自其父母的MYO15A基因突變位點，表現為復合雜合突變，與其父親共有突變位點MYO15A:NM_016239:exon22:c.5638G＞A:p.G1880R，與母親共有突變位點MYO15A:NM_016239:exon4:c.3693-2A＞G。

家庭2 中父母均為SLC26A4雜合突變，但雙方突變位點并不相同。父親突變位點為：SLC26A4:NM_000441:exon10:c.1229C＞T:p.T410M（圖5A）；母親突變位點為：SLC26A4: NM_000441: exon19:c.2168A＞G:p.H723R（圖5B）。家庭2 中女患兒攜帶來自父母的SLC26A4基因突變位點，表現為復合雜合突變；與其父親共有的突變位點為：SLC26A4:NM_000441:exon10:c.1229C＞T:p.T410M；與其母親共有的突變位點為：SLC26A4:NM_000441: exon19:c.2168A＞G:p.H723R。家庭2 中另一男嬰經篩選為野生型。

圖5 家庭2 SLC26A4 基因測序圖。A: 患兒和父親共有雜合突變:c.1229C＞T;B:患兒和母親共有雜合突變:2168A＞G。Fig.5 Family 2 SLC26A4 gene sequencing.A: The female deaf infant and her father own heterozygous mutation:c.1229C＞T; B: The female deaf infant and her mother own heterozygous mutation:2168A＞G.

家庭3 中父母均為TPO雜合突變，雙方突變位點不同。父親突變位點為：TPO:NM_175721:exon13:c.2404C＞T:p.R802W（圖6A）；母親突變位點為：TPO:NM_175721:exon14:c.2515C＞T:p.P839S（圖6B）。家庭3 患兒攜帶來自其父母的TPO基因突變，表現為復合雜合突變。與父親共有的突變位點為TPO:NM_175721:exon13:c.2404C＞T:p.R802W；與母親共有的突變位點為TPO:NM_175721:exon14:c.2515C＞T:p.P839S。

圖6 家庭3 TPO 基因測序圖。A:患兒和父親共有雜合突變:c.2404C＞T;B:患兒和母親共有雜合突變:c.2515C＞T。Fig.6 TPO gene sequencing of family 3.A: The deaf infant and his father own heterozygous mutation: c.2404C＞T; B:The deaf infant and his mother own heterozygous mutation:c.2515C＞T.

本組病例WES基因測序表明，家庭1男患兒攜帶耳聾相關突變基因MYO3A，為純合突變，同時攜帶MYO15A突變基因，為復合雜合突變。女患兒攜帶MYO15A突變基因，為復合雜合突變。家庭2 中女患兒攜帶SLC26A4基因突變位點，為復合雜合突變。家庭3 中男患兒攜帶TPO突變基因，為復合雜合突變。以上突變均由其父母提供，所有先證者其耳聾的產生符合遺傳規律。

3 討論

臨床上通過輔助生殖技術生育出先天性缺陷嬰兒并非少見，逐漸引起人們關注。不孕不育會增加試管嬰兒出生缺陷的風險，國外研究報道IVFET 或胞漿內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）的出生缺陷率分別為8.6% 和9.0%[3]，但另一項研究指出在考慮包括母親年齡在內的父母因素的多變量分析后，IVF-ET 和出生缺陷之間并無明顯關聯[4]。輔助生殖技術伴隨著出生缺陷風險增加，可能涉及的因素包括潛在的低生育能力、誘導排卵藥物、顯微操作技術等[5]。

目前國內外關于IVF-ET與出生缺陷的研究較多，但對其與聽力缺陷的關系報道較少。Ludwig等[6]通過前瞻性、對照、盲法隨訪研究發現運用ICSI與自然受孕對照組的聽力和視力發育無差異。而Liang 等[7]報道，與自然受孕相比，IVF-ET 或ICSI 技術單胎妊娠眼、耳、臉和頸部畸形的風險增加20%。Kim 等[8]報道IVF-ET 技術導致聽力篩查失敗可能有以下幾個原因，如IVF-ET 技術程序本身的直接影響，或者與IVF-ET技術程序相關的處理（如輔助孵化、囊胚培養）以及與不孕癥本身有關。研究者發現運用IVF-ET或ICSI技術可能引起基因突變導致異常甲基化，進而引起表型的改變，并報道RIPOR2突變引起甲基化異?？赡芘c聽力缺陷有關，因為它編碼毛細胞纖毛的質膜相關蛋白[9]。齊月娥等[10]報道，試管嬰兒與正常妊娠出生的新生兒聽力檢查結果無明顯統計學差異，孟曄等[11]通過基因測序發現運用IVF-ET或ICSI技術子代遺傳性耳聾基因突變發生率與自然妊娠組子代相似。我們在近年的臨床實踐中，發現IVF-ET 生育先天性聾兒的實例并非罕見，而且在這些家系中，父母及家族成員均無耳聾，亦未調查出遺傳家族史。

基于在遺傳性聾中，非綜合征性隱性遺傳所占比例最高，在考慮輔助生殖技術伴發先天性聾的病因時，遺傳因素必須引起高度重視。雖然這些家庭可能沒有耳聾家族史，父母聽力表現正常，但其攜帶隱性遺傳耳聾基因的可能性值得注意。在本組IVF-ET 先天性聾病例的遺傳學探查與分析中，根據文獻報道及在線人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、人類遺傳學數據庫（Human Gene Mutation Database HGMD）等數據庫篩選出4 種耳聾相關致病基因MYO15A、MYO3A、SLC26A4、TPO，這4 種基因突變與三組家庭出現耳聾患兒的相關性極大。值得注意的是，家庭1 同時存在MYO3A和MYO15A兩種耳聾相關基因突變，根據ACMG 指南MYO3A:NM_017433:exon32:c.4462A＞G:p.K1488E 變異的致病性分級為良性，提示該突變位點可能不是致聾原因，但Wu等[12]曾報道該基因純合突變的感音神經性聾。另外，MYO15A的2 個新突變位點的致病性有待進一步驗證，可對新發現的突變位點進行克隆，進一步構建載體，再通過顯微注射到胚胎，或者通過CRISPR/Cas9 基因敲出技術摸擬突變位點，觀察表型的改變。TPO基因突變被認為是自身免疫性甲狀腺疾病的常見原因，Kara 等[13]報道TPO突變可能與甲狀腺功能減退癥伴先天性聾有關。本組家庭3 患兒未檢測出甲狀腺功能異常，需追蹤觀察，其TPO基因突變與耳聾的關系待進一步驗證。

本組病例中，除了上述4 種耳聾相關基因外，還發現三個家庭均攜帶有其他隱性遺傳突變基因，如家庭1 中還有CYP1A1純合突變，DMXL1、HMCN2、MUC16復合雜合突變，家庭2 有PDE4DIP純合突變，HERC2、HMCN2、MIA3、TGFBRAP1、OBSCN、TTC37復合雜合突變，家庭3 有AHNAK復合雜合突變。通過查閱相關文獻和OMIM、HGMD數據庫，這些基因突變與耳聾關系不大，可能參與其他表型[14]。

總之，3 組家庭父母攜帶有MYO15A、MYO3A、SLC26A4、TPO與耳聾相關的基因突變，患病嬰兒的臨床表現符合遺傳規律。因此，臨床上開展輔助生殖技術時，與自然受孕一樣，應高度重視對候選夫妻進行廣泛耳聾基因的篩查，且不僅限于目前常見的4 種基因，做好產前診斷，以減少聽力缺陷嬰兒的出生，達到優生優育的目的。