血清外泌體中miR-301a與糖尿病腎病腹膜透析后心腦血管事件的相關性

衛志鋒,韓小麗,智云霞,劉俊芬,潘 星,程錦繡,金玉杰,劉圣君

(河北北方學院附屬第一醫院腎內科,河北張家口 075000)

據調查顯示,全球約30%～50%終末期腎病患者病因為糖尿病腎病[1],中國中老年人終末期腎病的首要病因亦是糖尿病腎病[2]。心腦血管事件是糖尿病腎病腹膜透析死亡的首要原因,約40%～60%死亡與其有關[3]。探究糖尿病腎病腹膜透析患者發生心腦血管事件的預測指標有著重要意義。

外泌體是一種由細胞分泌的具備脂質雙層膜結構的囊泡,內含蛋白、微小RNAs(microRNAs,miRNAs)等多種物質,主要負責細胞間信息傳遞[4]。miRNAs是一類由18～24個核苷酸構成的RNA,可通過調控靶基因參與疾病發生發展[5]。miR-301a作為其中一員,已被證實與心臟損傷及修復、血管內皮細胞凋亡、炎癥及氧化應激損傷等有關[6-9]。上述因素均與心腦血管事件密切相關,推測miR-301a參與了糖尿病腎病腹膜透析后心腦血管事件。目前鮮有研究分析miR-301a與糖尿病腎病腹膜透析后心腦血管事件的關系。本研究主要分析糖尿病腎病患者血清外泌體中miR-301a與腹膜透析后心腦血管事件的關系,以期為心腦血管事件的預防和管理提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取河北北方學院附屬第一醫院2019年6月至2020年6月接受腹膜透析治療的211例糖尿病腎病患者作為研究對象。納入標準:①因糖尿病腎病進展為終末期腎病;②接受腹膜透析治療時間＞3個月。排除標準:①有心腦血管疾病家族史、惡性腫瘤;②入組前3個月內有腹膜炎及感染性疾病史;③臨床資料不完整;④血液系統疾病或自身免疫性疾病;⑤入組前3個月內有冠心病史、急性心力衰竭史或腦卒中史等。本研究為前瞻性隊列研究,患者均簽署知情同意書,符合《赫爾辛基宣言》,獲醫學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

Exosome提取試劑盒購自美國SBI公司;Trizol試劑和逆轉錄試劑盒購自日本Takara公司;miR-301a和U6引物由上海吉瑪制藥技術有限公司設計。

1.3 信息收集

收集患者年齡、性別、體質量指數(body mass index,BMI)、吸煙史、糖尿病病程、高血壓史、透析時長、入組時的血清白蛋白和超敏C 反應蛋白(highsensitivity C -reactive protein,hs-CRP)水平等信息。

1.4 血清外泌體鑒定及其中miR-301a水平檢測

于患者入組后首次透析前,抽取肘部靜脈血10 m L,離心后提取血清,置于-80℃冰箱中保存。用Exosome提取試劑盒提取血清中外泌體,用透射電鏡觀察、粒徑分析和蛋白標志物CD63 鑒定外泌體。用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTqPCR)法檢測血清外泌體中miR-301a 水平。用Trizol試劑提取RNA,用逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA。用PCR 儀擴增cDNA,擴增條件95℃預變性30 s,95℃變性15 s,55℃退火20 s,72℃延伸20 s,40 個 循 環。miR-301a 上 游 引 物:5＇-GCCGAGCAGTGCAATAGTATTG-3＇,下 游 引 物:5＇-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3＇;U6 上 游 引 物:5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇,下游引物:5＇-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇。用 2-ΔΔCt法 計 算miR-301a相對內參U6的表達水平。

1.5 隨訪及心腦血管事件的定義

于患者首次透析后3個月采用復診和電話方式隨訪,每3個月隨訪1次,隨訪2年,隨訪終點為隨訪期間發生心腦血管事件或至末次隨訪結束。心腦血管事件包括急性冠脈綜合征、心力衰竭、持續性心律失常、腦卒中、外周血管疾病及心腦血管相關死亡。

1.6 統計學處理

研究數據用SPSS 23.0軟件分析。正態分布的計量資料用均數±標準差(±s表示,非正態分布的計量資料用中位數和四分位數間距[M(Q1,Q3)]表示。高miR-301a組與低miR-301a組的組間比較分別用獨立樣本t檢驗和Mann-WhitneyU檢驗分析。計數資料用例(%)表示,組間差異用χ2檢驗分析。用Spearman分析miR-301a與hs-CRP相關性。用線性回歸分析miR-301a 的相關影響因素。用Kaplan-Meier和Log-Rank比較miR-301a不同水平組間的累積心腦血管事件發生率,用COX回歸和限制性立方樣條分析miR-301a與糖尿病腎病腹膜透析后心腦血管事件的水平-效應關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 患者的臨床資料及預后

患者中位年齡47(41,52)歲;男性118例,女性93例;中位BMI為25.91(22.81,28.01)kg/m2;吸煙史102例;中位糖尿病病程7(7,8)年;高血壓史51例;中位透析時長6(5,8)月;血清白蛋白(38.05±6.82)g/L;中位hs-CRP為5.82(4.59,7.03)mg/L。

末 次 隨 訪 時 間2022 年6 月28 日,期 間37 例(17.54%)發生心腦血管事件,其中急性冠脈綜合征16例,心力衰竭3例,持續性心律失常1例,腦卒中10例,外周血管疾病2例,心血管相關死亡5例。

2.2 血清外泌體鑒定結果

透射電鏡下外泌體形態呈盤狀(圖1A),多數粒徑約為100 nm(圖1B),蛋白標志物CD63陽性(圖1C)。

圖1 外泌體鑒定結果Fig.1 Exosome identification results

2.3 患者miR-301a水平及分組情況

RT-qPCR 實驗結果顯示,患者中位miR-301a水平為1.46(1.31,1.60)。根據miR-301a中位數將患者分為低miR-301a組(≤1.46,n=108)和高miR-301a組(＞1.46,n=103)。

2.4 miR-301a不同水平組間患者的臨床資料比較

2組的年齡、性別構成、BMI、吸煙史占比、高血壓史占比、糖尿病病程和血清白蛋白水平差異均無統計學意義(P＞0.05)。低miR-301a組的hs-CRP水平和透析時長均低于高miR-301a組(P＜0.05,表1)。

表1 2組臨床資料的比較Tab.1 Comparison of the clinical data in the two groups

2.5 miR-301a的相關影響因素

miR-301a與hs-CRP呈正相關關系(rs=0.237,P=0.001,圖2)?；颊適iR-301a水平不服從正態分布,故將其進行對數轉換。將hs-CRP和透析時長納入線性回歸進行分析,結果顯示,hs-CRP 與miR-301a獨立相關(P＜0.05,表2)。

表2 miR-301a的相關影響因素Tab.2 Factors associated with the effect of miR-301a

圖2 miR-301a與hs-CRP散點圖Fig.2 Scatter plot of miR-301a and hs-CRP

2.6 2組累積心腦血管事件發生率的比較

低miR-301a組的累積心腦血管事件發生率為3.70%(4/108),低于高miR-301a組[32.04%(33/103),Log-Rankχ2=29.508,P＜0.001,圖3]。

圖3 2組的累積心腦血管事件發生情況Fig.3 Cumulative cardiovascular events in the two groups

2.7 糖尿病腎病腹膜透析后發生心腦血管事件的風險因素分析

將是否發生心腦血管事件作為因變量,將年齡、性別、BMI、吸煙史、高血壓史、糖尿病病程、血清白蛋白、hs-CRP、透析時長和miR-301a作為自變量,分別納入COX 回歸分析。結果顯示,血清白蛋白、hs-CRP和miR-301a與糖尿病腎病腹膜透析后發生心腦血管事件有關(表3)。將是否發生心腦血管事件作為因變量,將血清白蛋白、hs-CRP和miR-301a作為自變量,一并納入COX 回歸分析。結果顯示,高血清白蛋白水平是糖尿病腎病腹膜透析后發生心腦血管事件的獨立保護因素,高hs-CRP 水平和miR-301a＞1.46是糖尿病腎病腹膜透析后發生心腦血管事件的獨立危險因素(表3)。

表3 糖尿病腎病腹膜透析后發生心腦血管事件的風險因素分析Tab.3 Analysis of risk factors for cardiovascular and cerebrovascular events after peritoneal dialysis in diabetic nephropathy

2.8 miR-301a與糖尿病腎病腹膜透析后心腦血管事件的水平-效應關系

限制性立方樣條擬合COX 回歸分析結果顯示,當miR-301a節點個數為3時,赤池信息準則值最小(346.175),此時,miR-301a與糖尿病腎病腹膜透析后心腦血管事件有關(χ2=12.91,P=0.002),呈非線性關系(χ2=5.97,P=0.015)。以miR-301a中位數作為參考點,當miR-301a＜1.46時,糖尿病腎病腹膜透析后發生心腦血管事件風險低;當miR-301a＞1.46時,糖尿病腎病腹膜透析后發生心腦血管事件風險高(圖4)。

圖4 miR-301a與糖尿病腎病腹膜透析后心腦血管事件的水平-效應關系Fig.4 Level-effect relationship between miR-301a and cardiovascular and cerebrovascular events after peritoneal dialysis in diabetic nephropathy

3 討 論

心腦血管并發癥是糖尿病腎病患者的主要并發癥之一,亦是其死亡的主要原因。有研究報道,紅細胞分布寬度、天冬氨酸轉氨酶/丙氨酸轉氨酶比值及可溶性人基質裂解素2等與腹膜透析心血管事件有關,但不同研究結論不盡相同[10-13]。目前,可用于預測腹膜透析后心腦血管事件發生的證據十分有限。本研究主要分析糖尿病腎病患者血清外泌體中miR-301a與腹膜透析后心腦血管事件的關系。

既往關于miR-301a的研究多集中在腫瘤方面,其被報道與非小細胞肺癌、三陰性乳腺癌及膠質母細胞瘤等進展有關[14-16],鮮有關于其與糖尿病腎病腹膜透析后心腦血管事件的報道。miR-301a可調控磷酸酶和張力蛋白同源物/磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路誘導細胞周期G1/S轉換,促進心肌細胞增殖,從而修復心肌梗死后心臟損傷[6]。miR-301a在Toll樣受體激活的巨噬細胞中的表達降低,其可通過靶向核因子κB抑制因子調控核因子κB 活性及其下游促炎基因表達,如環氧化酶-2、前列腺素E2和白細胞介素6等[8]。此外,miR-301a-3p還可通過靶向KLF樣轉錄因子7加重氧化型低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈內皮細胞氧化應激、炎癥和細胞凋亡[9]。本研究結果顯示,低miR-301a組的hs-CRP 水平低于高miR-301a 組,miR-301a 與hs-CRP 呈 正 相 關 關系,hs-CRP 與miR-301a獨立相關。上述結果提示miR-301a與炎癥損傷密切相關。氧化應激、炎癥及其誘發的血管內皮細胞凋亡等與心腦血管事件密切相關[17],推測miR-301a通過調控炎癥因子表達,如hs-CRP,參與血管內皮損傷,進而誘發心腦血管事件。本研究結果還顯示,低miR-301a組的累積心腦血管事件發生率低于高miR-301a組,提示miR-301a與糖尿病腎病腹膜透析后心腦血管事件有關。此外,COX 回歸分析結果顯示,miR-301a＞1.46是糖尿病腎病腹膜透析后發生心腦血管事件的獨立危險因素,限制性立方樣條擬合COX 回歸分析結果顯示,miR-301a與糖尿病腎病腹膜透析后心腦血管事件呈非線性關系。上述結果進一步說明miR-301a與糖尿病腎病腹膜透析后心腦血管事件有關,miR-301a高水平提示患者發生心腦血管事件風險增加。

既往研究結果顯示,血清白蛋白和hs-CRP水平與腹膜透析患者心血管事件有關,低血清白蛋白和高hs-CRP 水平的患者發生心血管事件的風險增加[18-19]。本研究結果顯示,高血清白蛋白水平是糖尿病腎病腹膜透析后發生心腦血管事件的獨立保護因素,高hs-CRP水平是糖尿病腎病腹膜透析后發生心腦血管事件的獨立危險因素,與上述報道結果一致。

本研究尚存在一定不足,如僅檢測了單次miR-301a水平,未對其進行縱向研究;為單中心研究,隨訪時間有限,還需開展多中心、長期隨訪研究以驗證結論。此外,未開展基礎研究分析miR-301a參與糖尿病腎病腹膜透析后心腦血管事件的病理生理機制。課題組后續將針對上述不足進行補充。

綜上所述,hs-CRP與糖尿病腎病腹膜透析患者miR-301a獨立相關。miR-301a水平高提示糖尿病腎病腹膜透析后發生心腦血管事件風險高。