老年性癡呆患者血清miR-375、SP1水平與認知功能的相關性

夏君燕,李亞男,章雋,高永紅

(北京航天總醫院 老年醫學科, 北京 豐臺 100076)

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年4月至2022年4月在本院就診的老年性癡呆患者120例為疾病組,其中男49例,女71例,年齡60～88歲,平均(71.85±9.65)歲。根據臨床癡呆評定量表(CDR)評分將患者分為輕度組(CDR評分=1分)42例、中度組(CDR評分=2分)43例、重度組(CDR評分=3分)35例。納入標準:(1) 符合老年性癡呆的相關診斷標準[7];(2) CDR評分≥1分[8];(3) 簡易精神狀態量表(MMSE)評分<26分[9];(4) 肝、腎功能正常;(5) 臨床資料完整。排除標準:(1) 腦部接受過手術治療的患者;(2) 其他神經系統疾病引起的癡呆患者;(3) 參加本研究前接受過相關治療的患者;(4) 伴有器質性病變患者;(5) 不能配合完成研究的患者。另選取同期健康體檢志愿者120例作為對照組,其中男56例,女64例,年齡62～87歲,平均(72.30±9.42)歲。所有受試者對本研究內容知情并簽署書面同意書。本研究通過醫院倫理委員會審批。

1.2 細胞與主要試劑

人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y(貨號:CC-Y1459)購自美國ATCC公司。Trizol試劑盒(貨號:15596026)購自賽默飛世爾科技公司;逆轉錄試劑盒(貨號:RRO47AA)購自日本TaKaRa公司;實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(貨號:Code NO. RR420L)購自日本TaKaRa公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號:T002)購自威格拉斯生物技術(北京)有限公司;Lipofectamine?3000轉染試劑(貨號:L3000-015)購自美國Invitrogen公司;SP1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號:ab227383、ab181602)購自英國Abcam公司;噻唑藍(MTT)(貨號:M8180-1)購自北京索萊寶科技有限公司;異硫氰酸熒光素標記膜聯蛋白-V(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(貨號:WK304)購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 一般資料收集 收集兩組一般資料。(1) 人口學資料:性別、年齡、教育年限、吸煙史、飲酒史;(2) 基礎疾病:高血壓、高血脂、糖尿病;(3) 生化指標:總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、β-淀粉樣蛋白肽1-42(Aβ1-42)、磷酸化tau(P-tau)蛋白。

1.3.2 樣本采集 BD真空采血管收集所有研究對象清晨空腹狀態下的靜脈血10 ml,4 ℃ 3 000 r·min-1離心15 min,分離血清,置-80 ℃冰箱保存待測。

1.3.3 血清miR-375、SP1 mRNA表達水平檢測 按Trizol試劑盒說明書操作,提取血清中總RNA,使用M-MLV反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA,以cDNA為模板,采用qRT-PCR儀檢測血清miR-375、SP1 mRNA的相對表達水平。PCR反應體系20 μl:cDNA模板1 μl、ddH2O 7 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、2×Taq PCR master mix 10 μl;反應條件為95 ℃初始變性30 s;95 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,40個循環。每組實驗重復3次。使用2-ΔΔCt方法分析血清miR-375、SP1 mRNA表達水平。miR-375以U6作為內參基因,SP1 mRNA以GAPDH作為內參基因,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。引物序見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 雙熒光素酶報告基因實驗 分別構建SP1野生型質粒(WT-SP1)及突變型質粒(MUT-SP1),將WT-SP1和MUT-SP1分別與mimic NC或miR-375 mimic共轉染于293t細胞,48 h后檢測熒光素酶活性。

1.3.5 細胞分組、轉染與老年性癡呆體外細胞模型構建 SH-SY5Y細胞采用含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。生長狀態良好且處于對數生長期的SH-SY5Y細胞分為對照組、模型組、mimic NC組和miR-375 mimic組。其中,mimic NC組和miR-375 mimic組細胞使用Lipofectamine?3 000轉染試劑分別轉染mimic NC或miR-375 mimic,轉染48 h后使用含5 μmol·L-1β-淀粉樣蛋白肽25-35(Aβ25-35)的DMEM培養基處理細胞24 h以構建老年性癡呆體外細胞模型[10];模型組細胞僅使用含5 μmol·L-1Aβ25-35的DMEM培養基處理細胞24 h;對照組細胞不進行任何特殊處理。處理結束后收集細胞,qRT-PCR法檢測細胞中miR-375、SP1 mRNA表達水平(具體操作步驟參照1.3.3);蛋白質印跡法檢測細胞中SP1蛋白表達水平;MTT法檢測細胞活力;流式細胞術檢測細胞凋亡率。

1.3.6 蛋白質印跡法檢測各組SH-SY5Y細胞中SP1蛋白表達水平 收集處理后的各組SH-SY5Y細胞,使用裂解液充分裂解后提取細胞中總蛋白。SDS-PAGE電泳分離等量變性蛋白,將分離的蛋白電轉移至聚偏二氟乙烯膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后添加一抗(SP1、GAPDH抗體)4 ℃孵育過夜,添加二抗室溫孵育1.5 h,化學發光試劑顯色,凝膠成像分析系統掃描圖像,Image J軟件分析蛋白條帶灰度(GAPDH為內參蛋白)。

夜很靜。盡管街道上有車，有人，但這一切對我來說，都是無聲的。夏夜的涼風吹在我身上，這是我對外界的唯一感知。我很緊張。我即將去完成一件大事，生死攸關的大事。

1.3.7 MTT法檢測各組SH-SY5Y細胞活力 將處理后的各組SH-SY5Y細胞以3 000個·孔-1接種于96孔板中,常規培養24、48、72 h后每孔添加20 μl MTT溶液(5 mg· ml-1),繼續培養4 h后棄去培養液,添加150 μl二甲基亞砜(DMSO)充分混勻并孵育15 min,使用酶標儀檢測各孔細胞在490 nm波長處的OD值(OD490 nm),以OD490 nm表示細胞活力。

1.3.8 流式細胞術檢測各組SH-SY5Y細胞凋亡率 收集處理后的各組SH-SY5Y細胞,將5×104個細胞使用185 μl Annexin V-FITC結合液重懸,隨后添加10 μl Annexin V-FITC、5 μl PI室溫避光孵育10 min、5 min,使用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組一般資料的比較

兩組性別、年齡、吸煙史、飲酒史、高血壓、高血脂、糖尿病、TC、TG、HDL-C、LDL-C、BUN、Scr比較差異無統計學意義(P>0.05),兩組受教育年限、Aβ1-42、P-tau蛋白比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組一般資料的比較(n=120)

2.2 兩組血清miR-375、SP1mRNA表達水平及MMSE評分比較

疾病組血清miR-375表達水平、MMSE評分顯著低于對照組,SP1 mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.001),見表3。

表3 兩組血清miR-375、SP1mRNA表達水平及MMSE評分比較

2.3 不同病情程度組血清miR-375、SP1mRNA表達水平及MMSE評分比較

重度組、中度組血清miR-375表達水平、MMSE評分顯著低于輕度組,SP1 mRNA表達水平顯著高于輕度組(P<0.05);重度組血清miR-375表達水平、MMSE評分顯著低于中度組,SP1 mRNA表達水平顯著高于中度組(P<0.05)。見表4。

表4 不同病情程度組血清miR-375、SP1表達水平及MMSE評分比較

2.4 疾病組血清miR-375與SP1 mRNA表達水平及兩者與MMSE評分的相關性

Pearson相關分析顯示,疾病組血清miR-375與SP1 mRNA表達水平呈負相關(r=-0.627,P<0.05);Spearman相關分析顯示,血清miR-375表達水平與MMSE評分呈正相關(r=0.664,P<0.05),血清SP1 mRNA表達水平與MMSE評分呈負相關(r=-0.472,P<0.05)。見圖1。

A.miR-375與SP1 mRNA的相關性;B.miR-375與MMSE評分的相關性;C.SP1 mRNA與MMSE評分的相關性圖1 血清miR-375與SP1 mRNA表達水平及兩者與MMSE評分的相關性

2.5 多因素Logistic回歸分析影響老年性癡呆發生的危險因素

以是否發生老年性癡呆為因變量,以受教育年限、MMSE評分、miR-375和SP1 mRNA表達水平為自變量建立多因素Logistic回歸模型,結果顯示,低MMSE評分、miR-375低表達、SP1 mRNA高表達是影響老年性癡呆發生的危險因素(P<0.05),見表5。

表5 多因素Logistic回歸分析影響老年性癡呆發生的危險因素

2.6 ROC曲線分析血清miR-375、SP1 mRNA表達水平和MMSE評分對老年性癡呆患者病情進展為重度的預測價值

以老年性癡呆患者病情是否進展為重度為狀態變量,血清miR-375、SP1 mRNA表達水平和MMSE評分以及三者聯合預測概率值(通過二元Logistic回歸分析得到)為檢驗變量繪制ROC曲線,結果顯示,血清miR-375、SP1 mRNA表達水平和MMSE評分預測老年性癡呆患者病情進展為重度的AUC分別為0.823(95%CI0.750～0.896)、0.780(95%CI0.689～0.871)、0.851(95%CI0.781～0.921),臨界值分別為0.65、1.60、15,敏感度分別為91.43%、68.57%、85.71%,特異性分別為68.24%、77.65%、65.88%;三者聯合預測的AUC為0.938(95%CI0.879～0.974),顯著高于血清miR-375、SP1 mRNA表達水平和MMSE評分單獨預測的AUC(Z=2.734、3.150、2.113,P<0.05),且敏感度高達97.14%,特異性為78.82%。見圖2。

圖2 血清miR-375、SP1 mRNA表達水平和MMSE評分預測老年性癡呆患者病情進展為重度的ROC曲線

2.7 miR-375靶向調控SP1

TargetScanHuman網址預測miR-375與SP1間存在結合位點,見圖3。與mimic NC和WT-SP1共轉染組比較,miR-375 mimic和WT-SP1共轉染組細胞熒光素酶活性降低(P<0.05);與mimic NC和MUT-SP1共轉染組比較,miR-375 mimic和MUT-SP1共轉染組細胞熒光素酶活性變化差異無統計學意義(P>0.05),見表6。

圖3 TargetScanHuman網址預測miR-375與SP1結合位點

表6 熒光素酶活性比較

2.8 過表達miR-375對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞中SP1 mRNA和蛋白表達的影響

與對照組比較,模型組SH-SY5Y細胞中miR-375表達水平顯著降低,SP1 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,mimic NC組SH-SY5Y細胞中miR-375以及SP1 mRNA和蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05);與模型組、mimic NC組比較,miR-375 mimic組SH-SY5Y細胞中miR-375表達水平顯著升高,SP1 mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖4、表7。

A.對照組;B.模型組;C.mimic NC組;D.miR-375 mimic組圖4 蛋白質印跡法檢測過表達miR-375對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞中SP1蛋白表達的影響

表7 過表達miR-375對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞中SP1 mRNA和蛋白表達的影響

2.9 過表達miR-375對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞活力和凋亡率的影響

與對照組比較,模型組SH-SY5Y細胞活力顯著降低,凋亡率顯著升高(P<0.05);與模型組比較,mimic NC組SH-SY5Y細胞活力和凋亡率差異無統計學意義(P>0.05);與模型組、mimic NC組比較,miR-375 mimic組SH-SY5Y細胞活力顯著升高,凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5、表8。

圖5 流式細胞術檢測過表達miR-375對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡率的影響

表8 過表達miR-375對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞活力和凋亡率的影響

3 討 論

65歲以上老人老年性癡呆的發病率為5%左右[11],臨床主要表現為記憶障礙、認知衰退、視空間能力損害,給患者日常生活造成困擾。老年性癡呆發病機制復雜,臨床進展受多種因素影響,目前缺乏有效的診斷和治療手段[6,12],已成為21世紀醫學界急需解決的重大健康問題。尋找新的生物標志物,有助于臨床評估患者病情,制定靶向治療方案,延緩病情進展,提高患者生活質量。

阿爾茨海默病患者腦脊液中的Aβ能夠在神經細胞外異常沉積,引起神經突退縮和神經元變性,同時還會造成血管平滑肌變性。tau蛋白能夠與微管結合維持微管的穩定性,微管系統是神經骨架的主要成分,tau蛋白過度磷酸化后,神經骨架受到損壞,正常的軸突轉運受損,造成神經元功能損傷。腦脊液中低水平Aβ1-42和高水平P-tau蛋白是臨床推薦的阿爾茨海默病的生物標志物[13]。本研究發現,疾病組Aβ1-42水平低于對照組,P-tau蛋白水平高于對照組,與腦脊液中兩者變化趨勢一致[13],提示臨床可通過檢測血清中Aβ1-42和P-tau蛋白水平進行判斷,與檢測腦脊液中兩者水平比較更容易獲取檢測樣本。

此外,多種miRNA已被證實與阿爾茨海默病相關,可作為該疾病的生物標志物[12,14]。本研究中,疾病組miR-375表達降低,且MMSE評分越低miR-375水平越低,表明miR-375在老年性癡呆中起保護作用。研究證實,miR-375/SIX軸可接受lncRNA WT1-AS的調控,參與阿爾茨海默病的神經元氧化應激損傷和細胞凋亡[15]。Ashmwe等[16]采用體外沖擊波治療脊髓損傷大鼠,治療后miR-375表達增加,表明miR-375具有神經保護作用。SP1已被證實是阿爾茨海默病的關鍵調控基因[17],且SP1能通過結合促炎轉錄因子如核因子-E2相關因子2(Nrf2)、核因子κB(NF-κB)和p53等調節阿爾茨海默病中重要基因如Aβ前體蛋白(APP)和β-分泌酶1(BACE1)的表達,同時也可能接受與阿爾茨海默病發病相關的重要細胞因子白介素-1β(IL-1β)的調節[18]。在帕金森病大鼠模型中,上調miR-375能夠抑制SP1的表達,改善多巴胺能神經元的損傷,并且能夠減輕炎癥反應和氧化應激[19]。Xu等[20]研究發現,miR-375/SP1軸可接受lncRNA 01138的調控,在神經膠質瘤的有氧糖酵解和細胞增殖中發揮作用。本研究中,老年性癡呆患者血清SP1 mRNA表達水平顯著升高,且病情越嚴重SP1 mRNA表達水平越高,提示SP1高表達可能在老年性癡呆發生和病情進展中起促進作用。進一步分析顯示,老年性癡呆患者血清miR-375與SP1 mRNA表達水平呈負相關,miR-375低表達、SP1高表達均是影響老年性癡呆發生的危險因素,表明miR-375可能通過負向調控SP1在老年性癡呆發生和病情進展過程中發揮作用。此外,血清miR-375、SP1 mRNA表達水平和MMSE評分以及三者聯合預測老年性癡呆患者病情進展為重度的曲線下面積(AUC)分別為0.823、0.780、0.851、0.938,三者聯合預測的AUC顯著高于單個指標預測的AUC,且三者聯合預測的敏感度高達97.14%,特異性為78.82%,表明血清miR-375、SP1 mRNA表達水平和MMSE評分均具有一定預測老年性癡呆患者病情進展為重度的價值,且三者聯合預測的價值較高。以上研究結果提示,血清miR-375、SP1 mRNA具有成為評估老年性癡呆發生及病情嚴重程度輔助指標的潛力。

TargetScanHuman網址預測發現miR-375與SP1間存在結合位點,雙熒光素酶實驗證實miR-375能夠直接靶向SP1。老年性癡呆、帕金森病和神經膠質瘤均屬于神經系統疾病,推測miR-375、SP1可能通過miR-375/SP1軸調節神經細胞增殖、凋亡、分化等生物學過程,進而在老年性癡呆發生發展中協同發揮作用。本研究以人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y(老年性癡呆發病機制研究常用細胞模型之一[21])為研究對象,通過Aβ25-35誘導構建老年性癡呆體外細胞模型初步探究miR-375、SP1在老年性癡呆中的具體作用機制。結果顯示,Aβ25-35誘導后,SH-SY5Y細胞中miR-375表達水平、細胞活力降低,而SP1 mRNA和蛋白表達水平以及細胞凋亡率升高,此結果與miR-375、SP1在老年性癡呆患者血清中的表達趨勢一致,提示miR-375、SP1可能通過相互作用參與Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞損傷過程。進一步分析顯示,過表達miR-375能夠升高Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞活力,同時降低SP1 mRNA和蛋白表達以及細胞凋亡率,該結果進一步證實了miR-375可能通過負靶向調控SP1表達影響Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞增殖、凋亡,進而參與調控老年性癡呆發生發展。

綜上所述,老年性癡呆患者血清miR-375表達水平明顯降低,SP1 mRNA表達水平明顯升高,兩者呈負相關,且均與患者病情及認知功能具有一定的相關性。但本研究樣本量較小,試驗數據可能存在一定的偏倚。同時由于研究條件的限制,本研究僅初步分析了miR-375對SP1的靶向調控作用以及二者參與老年性癡呆的作用機制。后續可擴大樣本數量,并結合更多的細胞實驗、動物實驗等基礎研究對兩者的具體作用機制進行深入探討。