清化涼血護絡湯預防大鼠急性放射性腸炎的作用及機制研究

董豆,朱琳,王堅,沈偉生,殷華芳,顧一航,殷泉忠,沈衛東

(1.南通大學 醫學院,江蘇 南通 226000; 2.南通大學 附屬江陰醫院,江蘇 江陰 214400)

放射治療是盆腔惡性腫瘤不可或缺的治療手段,射線對腫瘤起殺傷作用的同時也可能會引起腫瘤周圍危及器官的放射性損傷,其中以放射性腸炎(radiation enteritis,RE)較為常見[1]?；颊叱３霈F腹痛、大便次數增多、便血、惡心嘔吐等不適,遷延不愈者可能進一步引起消化道大出血、穿孔、梗阻、腸瘺等嚴重并發癥[2]。目前針對RE的臨床治療主要以保守對癥、腸道營養治療為主,必要時行手術、內鏡治療?？傮w療效并不十分理想,無有效預防和治愈的措施。由于中藥療法本身有著藥物副作用較小、并發癥較少等優點,可長期改善病人RE癥狀,減少了病人痛苦[3]。

江蘇省名中醫沈偉生致力于研究中醫藥治療放射性肺炎、放化療所致心臟損傷等方面的問題[4-5],在中醫藥防治放化療毒副反應領域取得了豐富成果。沈偉生名中醫認為,盆腔放療引起放射性損傷,其主要病機為邪熱(火毒)下注、濕熱蘊結、血熱灼絡而表現為大便頻數、腹痛、里急后重、血便、直腸瘺等消化系統癥狀。針對RE基本病機,其自擬清化涼血護絡湯應用于預防和治療盆腔惡性腫瘤放療引起的RE,具體方藥如下:黃柏10 g,蒼術10 g,黃芩10 g,白芍30 g,老鸛草15 g,仙鶴草30 g,紫草30 g,紅景天30 g,地榆10 g,敗醬草15 g,大血藤30 g,馬齒莧15 g。清化涼血護絡湯前期在臨床探索中已取得滿意的療效,盆腔放療患者聯合該藥方治療后RE的發生率降低,消化道癥狀減輕,患者的生活質量有所提高?；诖吮緦嶒炌ㄟ^建立急性RE模型,進一步探討清化涼血護絡湯對大鼠急性RE的預防作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康成年SPF級Wistar大鼠36 只,體重(200±20)g,由常州卡文斯公司提供。

1.1.2 藥物 清化涼血護絡湯組方:黃柏、蒼術、黃芩、白芍、老鸛草、仙鶴草、紫草、地榆、敗醬草、大血藤、馬齒莧。以上中藥均為顆粒劑,由江陰天江藥業有限公司提供。

1.1.3 主要試劑及儀器試劑 試劑:蘇木素(Sigma),伊紅(水溶性)、無水乙醇、二甲苯、鹽酸、中性樹膠(中國醫藥集團有限公司)。儀器:Synergy直線加速器(瑞典醫科達醫療器械有限公司),倒置顯微鏡(OLYMPUS)。環氧合酶-2(COX-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和熱休克蛋白90α(Hsp90α)酶聯免疫吸附分析(ELISA)檢測試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物分組及給藥

所有大鼠按照隨機數字表法分為對照組、模型組、低劑量組及高劑量組,每組9只,隨機編號稱重。適應性飼養1周后進行實驗。根據人與動物體表面積換算法[6],將自擬清熱涼血組方煎制成湯劑,高劑量組按照0.08 g·ml-1·kg-1的劑量,于建模前7 d開始按照2 次·d-1、1 ml·次-1灌胃給藥,照射后12 h繼續給予清化涼血護絡湯灌胃10 d,低劑量組按高劑量組劑量稀釋4倍進行灌胃給藥(方法同上);對照組與模型組大鼠給予相同體積生理鹽水灌胃。建模給藥后第4、7、10 天每組分別隨機處死3 只大鼠,腹主動脈取血保存血清,取腸組織保存備用。

1.3 RE大鼠模型制備

所有大鼠適應性喂養3 d,禁食禁水12 h后稱重。采用10%水合氯醛麻醉,麻醉后以仰臥體位將其四肢固定于特制照射板上,采用6 MV直線加速器對大鼠進行腹部X線照射,照射自恥骨聯合至肛門,照射野面積2 cm×5 cm,其余部位用5 cm厚鉛板遮擋,100 cm源皮距,行單次照射600 cGy·min-1,總體照射劑量17.5 Gy,建立大鼠急性RE模型。照射后大鼠出現攝食、飲水量減少,體重下降,精神萎靡,蜷縮少動、稀便及血便,表明造模成功[7]。

1.4 一般情況觀察

觀察并記錄各組大鼠每日的攝食攝水及體重。根據相關文獻[8-9]擬定對建模后第4、7、10 天大鼠一般情況的評分標準,見表1。

表1 大鼠一般情況評分

1.5 HE染色觀察回腸及直腸黏膜病理變化

(1) 回腸:取照射部位回腸2 cm左右,用甲醛固定,固定后用預冷的生理鹽水洗凈血液,包埋、切片、染色。顯微鏡下觀察組織學變化,計數各組小腸絨毛隱窩細胞數、隱窩深度、絨毛長度及單位面積的腸腺,并計算建模后腸腺存活率,腸腺存活率=照射腸片上腸腺絨毛比/正常腸片上腸腺絨毛比×100%[10]。(2) 直腸:將10%甲醛固定好的2 cm直腸上段乙醇脫水,浸蠟包埋,HE染色,參照Hovdenak評分標準[11],光鏡下觀察黏膜上皮表面、腺體、固有層結構,根據其特征進行評估,最低分為0分, 最高分為12分, 分值越高代表黏膜病理改變越嚴重。

1.6 ELISA檢測大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6、Hsp90α含量

于建模給藥后第4、7、10 天對照組、模型組、高劑量組分別隨機處死3 只大鼠,腹主動脈取血保存血清,采用COX-2、TNF-α、IL-6和Hsp90αELISA檢測試劑盒,嚴格按照說明書操作,在酶標儀上檢測并分析其含量。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠攝食、攝水和體重觀察結果

高劑量組、低劑量組及模型組建模后5 d攝食和攝水均小幅度下降,第6 天開始逐漸恢復;且各組大鼠各時間段體重無明顯變化。見圖1。

圖1 建模后各組大鼠攝食攝水及體重變化

2.2 建模后第4、7、10天各組大鼠一般征象評分結果

低劑量組及高劑量組各時間段評分均顯著低于模型組,且高劑量組評分更低,差異有統計學意義(P<0.01),見表2。提示清化涼血護絡湯可控制炎癥滲出,有效改善大鼠腹瀉及黏液等癥狀,且高劑量改善效果更為顯著。

表2 建模后第4、7、10 天各組一般征象評分 分

2.3 回腸HE染色結果

2.3.1 回腸腸腺存活率 建模后高劑量組、低劑量組及模型組回腸腸腺存活率較對照組顯著下降(P<0.01);低劑量組顯著高于模型組,高劑量組較低劑量組更能有效提高腸腺存活率,差異均有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 建模后第4、7、10天各組回腸腸腺存活率的變化 %

2.3.2 回腸絨毛高度及隱窩深度 對照組小腸絨毛上皮細胞形態正常,排列有序,腺體豐富;模型組絨毛變短、稀疏,上皮不完整,上皮細胞脫落,腺體裸露,隱窩深度降低,炎癥細胞浸潤;低劑量組可見絨毛及隱窩深度有較輕程度的病理損害,高劑量組僅有輕微黏膜上皮細胞壞死脫落,見圖2。建模給藥第10天低劑量組及高劑量組絨毛高度、隱窩深度均高于模型組,差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01),見表4。說明清化涼血護絡湯能提高腸組織絨毛高度及隱窩深度,對大鼠腸道黏膜損傷具有顯著防治作用,且作用強度與藥物濃度有相關性。

黑色箭頭為絨毛高度,白色箭頭為隱窩深度圖2 各組大鼠回腸絨毛高度及隱窩深度(HE染色 主圖×200,右上角小圖×40)

表4 照射后第4、7、10 天各組絨毛高度和隱窩深度的變化 μm

2.4 直腸病理變化及Hovdenak評分

光鏡下觀察直腸黏膜上皮表面、腺體、固有層結構特征,可以看到大量炎癥性浸潤,隱窩細胞及杯狀細胞消失,見圖3。采用Hovdenak評分系統量化評分,結果提示模型組得分較對照組顯著升高;高劑量組、低劑量組相對于模型組而言能顯著降低直腸Hovdenak評分,且高劑量組降低更明顯,差異均有統計學意義(P<0.01),見表5。

圓形為炎性浸潤,三角形為隱窩消失,橢圓形為杯狀細胞消失圖3 各組大鼠直腸變化(HE染色 主圖×200,右上角小圖×40)

表5 照射后第4、7、10天各組直腸Hovdenak評分變化 分

2.5 各組大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6、Hsp90α水平的比較

對照組大鼠腹主動脈血清COX-2、TNF-α、IL-6、Hsp90α水平均低于模型組及高劑量組,而高劑量組低于模型組,組間差異均有統計學意義(P<0.01),見圖4。

3 討 論

腹盆腔腫瘤在放射性治療時,常會對腸道等鄰近非腫瘤組織造成損傷,且這些損傷往往是不可避免的,從而導致RE等嚴重并發癥[12]。RE的發生與照射劑量、照射方式、是否聯合化療、是否有合并癥等密切相關,如患者合并高血壓、糖尿病、慢性炎癥性腸病、系統性紅斑狼瘡等疾病時,往往會增加放療腸道毒性[1]。臨床主要表現為惡心嘔吐、腹痛腹瀉、便血等,長期甚至可出現梗阻、膿腫、穿孔、瘺管等并發癥[13]。目前主要結合臨床表現、病史,通過CT腸造影術或磁共振的橫斷面成像及內鏡等輔助檢查來確診;治療策略主要是緩解癥狀和處理新出現的并發癥。臨床缺乏系統、標準化的診治方案[14]。

中醫上將RE歸屬于“泄瀉”“便血”等范疇,類似腸風、臟毒等病。其病因為原發惡性腫瘤疾病的致病根本,即正氣虛虧、臟腑失調,加之放射線照射,外感熱毒,引動內生癌毒、邪熱入血,虛實夾雜,痰濕淤毒阻塞腸腑,導致本病[3,15]。針對RE基本病機,沈偉生名中醫自擬清化涼血護絡湯應用于臨床,方中白芍養血緩急柔腸、增加應激能力為君藥;黃柏、蒼術化濁、清下焦濕熱為臣藥;紫草、紅景天、地榆、仙鶴草具涼血通絡、護絡收斂、防血溢之效,且紅景天經現代藥理研究具有提高放射閾的作用,共為佐藥;敗醬草、老鸛草、大血藤、馬齒莧善清下焦熱毒、防瀉痢共為使藥。

RE的發病機制目前仍不明確,大多學者認為快速分裂的腸上皮,特別是對輻射高度敏感的隱窩干細胞,直接暴露于輻射產生了的細胞毒性效應,導致了細胞凋亡、腸道黏膜屏障結構及功能發生損害;過程中產生的活性氧、激活促炎細胞因子、趨化因子和生長因子,如COX-2、TNF-α、IL-6等,招募免疫細胞,造成炎癥風暴[16-18],從而導致了RE的發生。NO作為重要的炎癥介質及氧自由基,在RE的發生發展中也擔任了不可或缺的角色。電離輻射后,NO合酶活性增強,從而誘導產生大量的NO,通過介導炎癥反應、抑制cAMP生成、過氧化等作用導致細胞能量代謝受損,DNA、蛋白質等大分子物質合成障礙[19-20]。Hsp90α在非應激狀態下占細胞蛋白質的1%～2%,在應激狀態下高達4%～6%[21],同時正向調節NO的合成[22],可參與炎癥、細胞凋亡等過程,造成腸組織損傷。最近研究表明供應腸道的微血管內皮細胞的損傷、腸道菌群改變也可能是RE產生的原因[23]。

本實驗采用電離輻射大鼠腹部模擬急性RE,模型組大鼠出現攝食、飲水量減少及體重下降等癥狀,鏡下可見腸絨毛厚度及隱窩深度變淺,伴水腫和炎癥細胞浸潤,少量絨毛上皮細胞脫落及凋亡,血清中COX-2、TNF-α、IL-6等含量增加,提示急性RE大鼠模型構建成功。通過記錄大鼠每日糞便形態、肛周皮毛及精神狀態,電鏡下觀察腸黏膜改變包括腸腺存活率、絨毛高度、隱窩深度,測定大鼠腹主動脈血清中炎癥因子含量來探討清化涼血護絡湯預防大鼠RE的療效及其可能機制。結果顯示,清化涼血護絡湯能有效預防大鼠急性RE,顯著改善大鼠腹瀉、精神萎靡等癥狀,較好地維持大鼠腸黏膜結構及功能完整性,且其效果與給藥濃度有關,藥物濃度高對腸黏膜保護作用更強。清化涼血護絡湯可以降低COX-2、TNF-α、IL-6、NO、Hsp90α等炎癥因子及介質,進而抑制炎癥反應,減少上皮細胞凋亡,維持細胞間緊密完整性,穩定腸黏膜機械屏障,這些可能是其預防RE的機制所在。本研究結果可為清化涼血護絡湯應用于RE的臨床預防及治療提供基礎數據。