鐵摻雜碳點pH熒光探針的構建及分析應用

路雯婧，郭艷嬌，雙少敏，董川

（山西大學 化學化工學院，山西 太原 030006）

0 引言

細胞內pH 水平對于維持細胞的正常運行以及生理系統的穩定性具有重要作用［1］。細胞內酶的活性，信號的傳導，離子的轉運和調節，細胞的生長和凋亡以及系統的穩態平衡等都與pH 緊密相關［2-3］。pH 的微小變化可能會導致細胞器功能出現障礙，例如溶酶體的pH 值一般維持在4.5～6.5 的酸性環境中［4-6］，pH 異常會影響大分子的代謝和細胞正?；顒?，進而影響細胞的正常凋亡，甚至會導致痛風、阿爾茲海默癥、癌癥等多種疾?。?-10］。由于pH 對所有生命體而言都至關重要，因此精確監測pH 的變化至關重要。目前，已開發出多種技術手段用于測定pH 值，例如微電極、核磁共振、吸收光譜等方法［11-12］。其中，熒光光譜法由于靈敏度高、信噪比高、響應速度快、成本低、操作簡單和實時監測等優點被廣泛應用于化學生物傳感領域［13］。然而，大多數pH 熒光探針都是基于有機小分子熒光團設計合成的，存在光穩定性差、生物相容性差、毒性高、制備過程復雜等缺點，限制了其在生物體系中的廣泛應用。因此，開發用于監測生理環境中pH 變化的新型熒光探針對于研究受pH 影響的相關的疾病具有重要意義。

碳基納米材料由于具有良好的化學穩定性、生物相容性和低毒性等突出的優點，受到越來越多的關注并被廣泛應用于各個領域［14-15］。碳點（CDs）作為一種新興的具有熒光特性的碳基納米材料，在2004 年被Walter A.Scrivens 等［16］在碳納米管電泳實驗中偶然發現。2006 年Sun Ya-Ping 課題組［17］將其定義為“碳點”并建議鈍化表面以優化其性能。由于CDs 優良的熒光特性、易于功能化、制備原料來源廣泛、制備方法多樣等諸多優點，已經在生物、化學、材料等領域得到廣泛的應用［18-23］。同時，CDs 通常具有較低的細胞毒性和良好的生物相容性，作為熒光探針在檢測生理環境中的小分子應用中具有良好的發展潛力。其中，最為突出的是用于pH 熒光探針。通過pH 變化導致碳點表面結構或電子分布的改變，從而引起熒光信號改變的機理，可以設計用于監測細胞環境不同區域的pH 變化過程。然而，若未經修飾或鈍化等步驟的CDs 仍然存在量子產率較低、表面功能基團較少等問題，從而限制其在pH 傳感領域的應用。為了拓寬其應用范圍，研究發現對CDs 表面進行功能化修飾和化學摻雜是改善其缺點的兩個非常有效的途徑［24-26］。功能化修飾一般要經過復雜的合成和純化步驟，所得的產率較低并會影響CDs 的固有性質，這大大限制了其在分析傳感中的應用［27-28］?；瘜W摻雜（金屬元素摻雜和非金屬元素摻雜）則由于制備過程簡便和高效的優點而被廣泛應用，其中摻雜金屬元素可以有效地改善CDs 的內部結構或電子分布，從而影響其物理或化學性質［29］。不同金屬離子的摻雜會對CDs 的熒光量子產率（QYs）造成不同程度的影響，這可能源于摻雜的金屬離子改變了CDs 的幾何結構或電子結構［30-31］。因此，制備新型金屬摻雜碳點，探索其作為熒光探針在不同pH 范圍內的響應情況，對監測細胞內不同區域pH 的動態變化及其對相關疾病的影響非常重要。

本文以鄰苯二胺和血紅素為前驅體通過一步水熱法制備了表面多種官能團的鐵摻雜黃色熒光碳點（Fe-CDs），通過多種分析表征證明Fe-CDs 具有良好的水溶性和穩定的光學性能。由于其表面豐富的氨基、羧基等官能團及鐵元素的摻雜，Fe-CDs 可以作為熒光探針用于酸性環境下的pH 檢測。同時Fe-CDs 具有較低的細胞毒性，易于被細胞攝取，可通過熒光成像手段監測細胞內pH 的水平變化，并且在研究因pH 波動而影響的生理變化中表現出良好的應用潛力。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

主要試劑：鄰苯二胺，血紅素購自美國Sigma-Aldrich 試劑有限公司。所有實驗用藥品均為分析純，且使用時未經附加處理。實驗用水為由美國Milli-Q 超純水儀制得的超純水。

主要儀器：JEM-2100 型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社JEOL）；Cary670 型傅里葉變換紅外光譜儀（美國安捷倫科技公司）；U-2910 型紫外可見吸收光譜儀（HITACHI LTD）；F-4500 型熒光/磷光分光光度計（HITACHI LTD）；Zetasizer Nano ZS90 型粒度電位儀（Malven）；AXIS ULTRA DLD 型 X-射線光電子能譜儀（日本Kratos 公司）；FV1000 型激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司）。

圖1 Fe-CDs的合成路徑及應用示意圖Fig.1 The synthetic procedure and application schematic diagram of the Fe-CDs

1.2 Fe-CDs的制備方法

分別稱取0.01 g 血紅素和0.1 g 鄰苯二胺，置于含20 mL 無水乙醇的錐形瓶中，攪拌后超聲15 min 使其充分溶解，將溶液轉移至水熱反應釜后置于烘箱內，180 ℃反應10 h，待水熱反應釜完全冷卻至室溫。隨后將反應產物過濾后旋蒸除去乙醇溶劑，并重新分散在超純水中，超聲使其完全溶解，再用0.22 μm 濾膜過濾后得到黃褐色碳點溶液。將上述黃褐色碳點水溶液冷凍干燥48 h，即得到Fe-CDs 固體狀粉末。

1.3 熒光量子產率的測定

Fe-CDs 的熒光量子產率（QY）根據文獻［32］中方法測定，以溶解于乙醇中的羅丹明6G（QY=95%）為參比溶液。Fe-CDs 的QY 由以下等式計算：

ΦS和ΦR分別代表Fe-CDs 和參比溶液羅丹明6G 的QY；n表示熒光發射峰的積分面積；A表示吸光度；η表示溶劑的折射率（水為1.33，乙醇為1.36）。為減小自吸收效應，限定激發波長下的吸光度A＜0.05（λex=488 nm，熒光發射范圍λem為500 nm～650 nm）。

1.4 Fe-CDs熒光穩定性的測定

配置一系列濃度為0.1 mg/mL，pH=7 的Fe-CDs 溶液，分別加入10 μL，0.1 mol/L 的15種金屬離子及17 種氨基酸，測量并記錄Fe-CDs 的熒光強度變化，研究在生物體中共存物對Fe-CDs 熒光的影響。

1.5 Fe-CDs檢測pH的方法

配置濃度為0.1 mg/mL 的Fe-CDs 儲備液及不同pH 值（2～12）的BR 緩沖溶液，將150 μL Fe-CDs 儲備液分別分散到含2.0 mL 不同pH 值的BR 緩沖液的比色皿中混合均勻。通過熒光分光光度計，掃描其發射光譜（λex=449 nm，λem=571 nm），測量并記錄不同pH 值的Fe-CDs 的熒光強度。根據pH 和Fe-CDs 熒光強度值，通過玻爾茲曼函數擬合曲線，計算pKa 值和檢測pH 的標準曲線［33］。所有測量均重復3 次。

1.6 細胞毒性測試

通過MTT 方法評估制備的Fe-CDs 對人宮頸癌HeLa 細胞的細胞毒性。首先將含細胞的96 孔細胞培養板放在37 ℃，體積分數為5.0%CO2培養箱內孵育3 h。用200 μL 含有不同濃度的Fe-CDs 和含有10%胎牛血清（FBS）的新鮮DMEM 培養基再進行孵育24 h，記為實驗組，每組至少含有6 個平行樣本。將未加入Fe-CDs 處理過細胞記為空白組，隨后在每個孔內加入20 μL，5.0 mg/mL MTT 試劑，進一步孵化5 h。移除培養基，加入150 μL DMSO 溶液，將混合物在室溫下震蕩10 min 后用酶標儀測定在490 nm 處混合物的光密度（OD）。細胞存活能力通過以下等式計算：

細胞存活率（%）=（OD 實驗組/OD 對照組）×100%

OD 實驗組為加入Fe-CDs 的細胞光密度，OD 對照組為未加入Fe-CDs 的細胞光密度。

1.7 細胞成像實驗

選用人宮頸癌HeLa 細胞為模型，將濃度為0.1 mg/mL 的不同pH 值（pH=2，5，7）的Fe-CDs 與HeLa 細胞共孵育半小時，隨后通過激光共聚焦顯微鏡對HeLa 細胞進行細胞成像實驗，觀察在不同pH 值下Fe-CDs 對細胞形態及細胞內的熒光強度的影響。

2 結果與討論

2.1 Fe-CDs的形貌結構表征

本文以含有微量鐵元素的生物分子血紅素和鄰苯二胺為前驅體，通過一步水熱法制備了黃色熒光Fe-CDs，并通過多種分析手段表征了其粒徑及結構。透射電子顯微鏡（TEM）圖顯示合成的Fe-CDs 呈均勻的球形分散（圖2a），平均粒徑約為2.92 nm（圖2b）通過高分辨率TEM 圖像（2a 插圖）可以看出Fe-CDs 的晶格間距約為0.14 nm。通過電感耦合等離子體發射光譜（ICP-OES）驗證鐵元素的摻雜量，結果表明Fe-CDs 中摻雜的Fe 元素的含量約為1.08%。由傅里葉變換紅外光譜圖（FT-IR，圖2c）表征Fe-CDs 的表面官能團結構，3384 cm-1附近明顯的吸收峰對應O-H/N-H 的伸縮振動［34］；1713 cm-1、1499 cm-1、1273 cm-1和1154 cm-1的特征峰分別對應于羧基或酰胺基團的C=O、C=C［35］、C-N［36］及Fe-N［37］的伸縮振動。Fe-CDs 的多種吸收峰表明其表面含有氨基、羧基等多種親水性能團，并且Fe-N 的吸收峰再次證明鐵元素的成功摻雜。

圖2 （a）Fe-CDs的TEM圖；（b）Fe-CDs的粒徑分布圖；（c）Fe-CDs的紅外光譜圖；（d）Fe-CDs的X射線光電子能譜Fig.2 (a) TEM image of the Fe-CDs; (b) Diameter distribution image of the Fe-CDs; (c) FT-IR spectra of the Fe-CDs;(d) XPS spectrum of the Fe-CDs

通過X 射線光電子能譜（XPS）驗證Fe-CDs 中元素組成，如圖2（d）中出現四個特征結合能峰，分別位于285.6 eV、399.1 eV、532.0 eV 和715.1 eV，表明Fe-CDs 除H 元素外還有C、N、O、Fe 四種元素。高分辨率XPS 譜顯示，C 1s 是由284.4 eV（C-C/C=C），285.6 eV（C-N），286.7 eV（C-O）和287.6 eV（C=O）四個特征峰構成的［38］（圖3a）。N 1s 譜中顯示了398.2 eV（N-Fe），399.5 eV（吡咯N）和401.2 eV（N-H）三個特征峰［39］（圖3b）。由圖3C 可以看出，O 1s 譜是由531.3 eV（C-OH）和532.4 eV（C=O）兩個特征峰構成的［40］。Fe 2p譜中顯示了碳點中Fe 的710.1 eV（Fe 2p1/2）和726.1 eV（Fe 2p3/2）兩個特征峰（圖3d）［41］。XPS 光譜結果與紅外光譜具有良好的一致性，進一步證明了鐵元素的成功摻雜。

圖3 Fe-CDs的高分辨X射線光電子能譜（a） C 1s；（b） N 1s；（c） O 1s； （d） Fe 2pFig.3 The high-resolution XPS spectra of Fe-CDs(a) C 1s; (b) N 1s; (c) O 1s and (d) Fe 2p

2.2 Fe-CDs的光譜性質

通過紫外可見吸收光譜儀和熒光光譜儀表征Fe-CDs 的光譜性能。如圖4（a）所示，在紫外可見吸收光譜中Fe-CDs 在300 nm 和425 nm 附近表現出明顯的寬吸收峰，分別歸因于Fe-CDs內核共軛體系的π→π*躍遷，及表面多種官能團的n→π*躍遷。從熒光光譜可以看出Fe-CDs 的最佳激發和發射波長分別為449 nm 和571 nm。Fe-CDs 在紫外燈照射下可以看到明亮的黃色熒光。從不同激發波長下Fe-CDs 的發射光譜數據（圖4b）可以看到，當激發波長由390 nm 增加到550 nm 時，Fe-CDs 的熒光發射波長幾乎沒有明顯的變化，熒光強度先增加后下降，表明Fe-CDs 的發光性質是激發波長獨立性的，這可能是由于Fe-CDs 的粒徑及發射中心相對均勻的原因。另外，相較于其他金屬摻雜碳點［42-47］，Fe-CDs 表現出高的熒光量子產率，以羅丹明6G（乙醇中QY=95%）為參照，其量子產率可達26.80%（表1）。

圖 4 （a）Fe-CDs的紫外-可見吸收光譜和熒光激發光譜、發射光譜；（b）在不同激發波長激發下Fe-CDs的熒光發射光譜Fig.4 (a) UV-vis absorption and Fluorescence excitation, emission spectra of Fe-CDs in aqueous solution;(b) Fluorescence emission spectrum of the Fe-CDs at various excitation wavelengths

表1 不同金屬摻雜碳點的熒光量子產率對比Table 1 Comparison of fluorescence quantum yield among the M-CDs

為了研究Fe-CDs 的熒光穩定性，考察了不同離子強度、金屬離子及氨基酸對Fe-CDs 熒光強度的影響。如圖5（a），以不同濃度NaCl 溶液模擬不同離子強度環境，當NaCl 溶液濃度高達到2.0 mol/L 時，熒光強度依然可維持原始熒光強度的90%以上，表明Fe-CDs 具有良好的離子穩定性和抗鹽能力。如圖5（b）和5（c）所示，當Fe-CDs 分別與15 種不同的金屬離子及17 種不同的氨基酸共存時，Fe-CDs 熒光強度幾乎不受各種共存物質的影響，表明Fe-CDs 有比較強的光穩定性。

圖5 （a）不同濃度的鹽溶液對Fe-CDs熒光強度的影響；（b）不同金屬離子對Fe-CDs熒光強度的影響；（c）不同氨基酸對Fe-CDs熒光強度的影響Fig.5 (a) Effects of different concentration of NaCl; (b) Effects of different metal ions;(c) Effects of different amino acids

2.3 Fe-CDs熒光探針檢測pH

pH 在很大程度上影響著機體的正常功能，開發用于監測細胞內pH 變化的新型熒光探針對于研究pH 影響的相關的疾病具有重要意義。由于Fe-CDs 表面存在豐富的活性官能團，我們探索了其在傳感器領域的潛在應用。如圖6（a）所示，Fe-CDs 在酸性環境下的熒光強度隨著pH的減小逐漸降低（λex=449 nm，λem=571 nm）。當pH 降低至2 時，Fe-CDs 95%的熒光強度被猝滅；當pH 為7 時Fe-CDs 熒光強度達到最高值。在堿性環境下，隨著pH 的逐漸增大，Fe-CDs 熒光強度變化不大。通過玻爾茲曼函數擬合曲線，得到Fe-CDs 的pKa 為5.32，且在pH 4.4～6.2 范圍內，Fe-CDs 熒光強度與pH 具有良好的線性相關性，y=4086 pH-16 800.5（圖6b）。上述實驗結果證明Fe-CDs 可作為監測酸性條件下pH 變化的新型熒光探針。

圖6 Fe-CDs隨pH值的熒光強度變化（a）pH為2～12的熒光強度變化；（b）pH為2～7范圍的熒光強度變化Fig.6 The fluorescence intensity change of Fe-CDs at pH(a) pH 2-12; (b) pH 2-7

通過檢測不同pH 下的Fe-CDs 的Zeta 電位、熒光壽命及紫外吸收光譜，研究了Fe-CDs 檢測pH 的作用機理。由Zeta 電位結果可知，pH 從7降至2 時，隨著體系中H+濃度的升高Fe-CDs 的所帶電荷由-9.39 mV 升高至16.6 mV。同時Fe-CDs 的熒光壽命由1.70 ns 升高至2.23 ns（圖7a）。從紫外吸收光譜可知，隨著pH 的逐漸減小，Fe-CDs 在425 nm 處的吸收峰逐漸紅移至450 nm（圖7b）。因此，推測Fe-CDs 表現出pH 依賴的熒光特性可能是由于pH 值的變化導致Fe-CDs 中π→π*和n→π*電子躍遷變化引起的［48-49］，Fe-CDs 表面的羧基、氨基等官能團的質子化和解質子化造成其費米能級的偏移使其表現出pH 依賴的熒光特性［50］。

圖7 （a）Fe-CDs在pH為2、7時的熒光衰減曲線；（b）在不同pH環境中Fe-CDs的紫外吸收光譜Fig.7 (a) Fluorescence lifetime of Fe-CDs at pH 2 and 7; (b) UV absorption spectra of Fe-CDs in various pH systems

2.4 Fe-CDs 的細胞毒性及其在細胞成像中的應用

通過上述研究證明，Fe-CDs 可作為監測酸性條件下pH 變化的新型熒光探針，在成像應用中具有發展潛力。首先，我們選用人宮頸癌HeLa 細胞為模型，采用MTT 標準法檢測Fe-CDs 的細胞毒性。如圖8 中所示，用不同濃度的Fe-CDs 與HeLa 細胞共孵育24 h 后，即使Fe-CDs 的濃度達到300 μg/mL，HeLa 細胞的存活率仍高于85%，說明Fe-CDs 毒性非常低，具有良好的生物相容性，可有效應用于體內細胞成像。

圖8 不同濃度Fe-CDs與HeLa細胞共孵育24 h后細胞的存活率Fig.8 The cell viability of HeLa cells incubated with Fe-CDs at different concentrations for 24 h

由于Fe-CDs 具有良好的光學性能及穩定的生物相容性，探索了其作為熒光探針在監測細胞內pH 的可能性。用人宮頸癌HeLa 細胞為模型，將濃度為0.1 mg/mL 的不同pH 值的（pH=2，5，7）Fe-CDs 與HeLa 細胞共孵育半小時進行細胞成像實驗，觀察細胞形態變化以及細胞內熒光變化。如圖9 所示，Fe-CDs 分布于細胞膜、細胞質甚至細胞核區域，說明Fe-CDs具有良好的細胞通透性。當pH 為7 時，細胞內的熒光強度最強（c 和f）；當pH 為5 時，Fe-CDs的熒光強度部分猝滅（b 和e）；當pH 為2 時，Fe-CDs 的熒光強度幾乎全部被猝滅（a 和d）。這與體外實驗結果一致，也進一步表明了Fe-CDs 可作為一種良好的pH 熒光探針用于細胞內pH 水平的監測。

3 結論

該工作以鄰苯二胺及生物分子血紅素為原料，通過一步水熱法制備得到鐵摻雜熒光碳點（Fe-CDs）。由于原料中的血紅素具有大環結構，利于碳點在合成過程形成大的共軛平面；并且微量的鐵元素摻雜有助于改變碳點的電荷分布，進而大幅提高了碳點的熒光量子產率，可達26.8%。同時，Fe-CDs 展現出良好的水溶性，穩定的光學性能，優異的抗鹽及抗干擾能力。由于其表面豐富的氨基、羧基等官能團及鐵元素的摻雜，Fe-CDs 可以作為熒光探針用于酸性環境下的pH 檢測。同時Fe-CDs 具有低毒性且易于被細胞攝取，可實現細胞內pH 的熒光成像應用。以上研究證明Fe-CDs 作為一種制備簡便、性能優異的熒光探針在生物傳感領域具有良好的應用潛力。