微波法合成的ZnS/RGO納米材料對核黃素的電化學檢測

馬榕，張文坤，喬雅雪，范琪，李寧波，2*，喬潔，2*

（1.山西醫科大學 生物化學與分子生物學教研室 基礎醫學院，山西 太原 030001；2.山西醫科大學 基礎醫學院 化學教研室，山西 太原 030001；3.山西醫科大學 公共衛生學院 預防醫學系，山西 太原 030001）

0 引言

核黃素（Riboflavin，RF）是人體正常代謝活動所必需的水溶性維生素之一，俗稱維生素B2，在人體正常的生命活動中起著至關重要的作用。它不僅能夠調節重要的營養物質，如：碳水化合物、脂肪和蛋白質轉化為生化反應所需的直接能源ATP（腺嘌呤核苷三磷酸），還可以促進黃素單核苷酸 （Flavin mononucleotide，FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，FAD）這兩種黃素輔酶的形成，并且這兩種輔酶是組織呼吸所必需的［1-3］。當人體內缺乏核黃素時會導致皮膚瘙癢、眼睛灼燒、口腔和舌頭疼痛，嚴重的會誘發癌癥和腫瘤［4］。因此，研制快速、準確、方便、靈敏的檢測核黃素的方法尤為重要。目前，檢測核黃素方法有液相色譜法［5］、分光光度計法［6］、毛細管電泳法［7］和熒光法［8］等。然而，這些方法存在耗時長、測試過程復雜、儀器昂貴等不足。相比以上方法，電化學方法具有簡單、低成本、快速響應和高靈敏度等優點，是可依賴且具有發展前景的檢測技術。

為了提高核黃素檢測的靈敏度，研究者合成了多種電極修飾材料，有聚合物、貴金屬和金屬氧化物等。Derakhshan 等［9］合成氧化石墨烯、金納米粒子、乙烯基磺酸鈉鹽和甲基咪唑離子液體聚合物的納米復合材料（GO/Au/poly-EAmVS）用于核黃素的檢測；Sumathi 等［10］合成α-Fe2O3、多壁碳納米管和金納米粒子復合材料（α-Fe2O3/MWCNT/AuNPs）修飾玻碳電極，實現核黃素的檢測。但是上述材料大多需要使用改性劑，合成過程繁瑣，合成成本比較高。ZnS作為一種重要的半導體材料，廉價易得，而且具有良好的生物相容性，化學穩定性和光電化學性質［11］。Vinoth 等［12］以超聲法合成了包覆在還原氧化石墨烯上的硫化鋅微球 （Zn-SNPs@RGO）并成功應用于咖啡酸的電化學檢測，展現了ZnS 對酚類物質的催化能力。另外，石墨烯材料具有優良的導電性和高比表面積，其表面可以負載更多納米粒子，其組成和結構具有促進電子轉移的作用，可以有效地提高電化學傳感器的導電性和靈敏度［13-14］，是一種理想的電化學敏感材料。因此，本研究結合石墨烯和ZnS 的優良特性，通過簡單、綠色的微波法一步合成了ZnS/RGO 復合材料。該合成方法不僅避免了繁瑣的反應過程、高溫及有毒還原劑的使用，而且ZnS 納米材料有效地改善了石墨烯在還原過程中的團聚，提升了復合材料的導電性和催化性能，充分發揮出復合材料的協同作用。該復合材料構建的電化學傳感器，對核黃素表現出較高的催化能力，實現了對核黃素的靈敏檢測，并成功應用于牛奶和血清樣品中核黃素的檢測，如圖1 所示。

圖1 電化學傳感器構建用于檢測核黃素的示意圖Fig.1 Schematic diagram of electrochemical sensor construction for detection of Riboflavin

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

JEM-2100 型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社），BRUKER INVENIOS 傅里葉變換紅外光譜儀（Bruker OPTIC China service team），UH-5300 紫外分光光度計（日本Hitachi 公司），D8-X射線衍射儀（Bruker OPTIC China service team），Renishaw inVia 激光拉曼光譜儀（Renishaw 公司），G70D20CN1P-D2 微波爐（廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司），KQ-50DB 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SCIENTA-10N 鐘罩式冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司），VCX150 細胞破碎儀（SONICS& MATERIALS INC），CHI660E 工作站（上海辰華），玻碳電極GCE（Φ=3 mm）作為工作電極，Ag/AgCl 為參比電極，鉑絲為對電極。

核黃素、乙酸鋅、葉酸、葡萄糖、抗壞血酸、L-賴氨酸（阿拉丁試劑有限公司）；無水氯化鈣、氯化鈉（南京化學試劑有限公司）；硫脲（薩恩化學技術有限公司）；石墨薄片（Alfa Aesar）。實驗所用試劑均為分析純，實驗用水均為超純水（電阻率達到18.2 MΩ·cm）。

1.2 ZnS/RGO的制備

首先，采用改進的Hummers 方法［15］合成氧化石墨，再利用超聲剝離法制備氧化石墨烯（GO）。利用微波法制備ZnS/RGO 納米材料，具體步驟如下：分別稱取0.658 5 g Zn（Ac）·2H2O、0.266 4 g 硫脲與0.100 0 g 氧化石墨烯，加入50.0 mL 超純水，在室溫下磁力攪拌2 h，得到均一溶液。用量筒準確量取5.0 mL 上述溶液并轉移至坩堝中，在700 W 的微波爐中加熱30 min。待產物冷卻到室溫后，以8000 r/min 的轉速離心收集產物，用乙醇和超純水分別洗滌三次，冷凍干燥，得到黑色產品為ZnS/RGO，取一定量超聲分散在超純水中，得到濃度為1 mg/mL 的水溶液，貯存于4 °C 冰箱備用。在相同條件下分別合成ZnS 和RGO（注：合成ZnS 的時候不加入GO；合成RGO 不加入乙酸鋅和硫脲）。

1.3 ZnS/RGO/GCE傳感器的構建

為使玻碳電極能夠達到最佳修飾效果，需打磨處理，在超純水中超聲清洗，自然晾干。用移液槍移取5 μL ZnS/RGO（1 mg/mL）滴涂在電極表面，室溫干燥后，再重復滴加5 μL 修飾材料，干燥備用。

1.4 核黃素的測定

制備好的修飾電極室溫下分別浸入含有不同濃度（從低到高）核黃素的磷酸緩沖溶液（PBS，0.1 mol·L-1，pH=6.0）中，用差分脈沖伏安法（DPV）記錄對應峰電流的強弱，DPV 參數設置：振幅 50 mV，脈沖寬度 0.050 s，掃描電位窗口-0.6 ～ -0.1 V，掃描速度50 mV/ s。

1.5 實際樣品處理

選擇牛奶和血清為實際樣品，通過加標回收法測定核黃素。牛奶購自伊利，血清來自實驗室健康的志愿者。檢測前需要對樣品進行預處理：先用0.22 μm 的濾膜過濾除去雜質，以轉速8000 r/min 離心（牛奶離心10 min，血清離心30 min），取上清液做加標回收實驗。用PBS（0.1 mol·L-1，pH=6.0）為稀釋劑，將上清液稀釋50 倍。

2 結果與討論

2.1 ZnS/RGO的表征

如圖2（A）的紫外-可見吸收光譜所示，ZnS（a）在波長300 nm 左右表現出典型的吸收峰，GO （d）在230 nm 左右表現出最大吸收，在302 nm 處出的肩峰對應于GO 中芳香族C=C鍵的π-π*躍遷和C=O 鍵的n-π*躍遷。通過微波法將GO 還原后，RGO（b）在230 nm 的吸收峰紅移至258 nm，肩峰消失不見，說明GO 被還原［16］。復合物 ZnS/RGO（c）除顯示出ZnS 的紫外特征峰，在200 nm ～ 400 nm 范圍內的紫外吸收強度增強［17］。

圖2 （A） 紫外-可見吸收光譜；（B） 紅外光譜圖ZnS （a），RGO （b），ZnS/RGO （c），GO （d）Fig.2 UV-vis absorption (A) and IR spectrum (B) of ZnS (a), RGO (b), ZnS/RGO (c), GO (d)

如圖2（B）紅外譜圖所示，ZnS（a）在472 cm-1和668 cm-1處出現了特征峰，對應Zn-S 鍵的振動峰［18］，3300 cm-1和1500 cm-1左右的峰為-OH 的伸縮振動峰。GO（d）出現在 1725、1624、1394、1044 cm-1處的吸收峰［19］，分別對應羧基（-COOH）、羰基（C=O 鍵）、酚羥基（C-O-H）和環氧基團（C-O-C）的振動峰，3406 cm-1處寬且深的峰為-OH 的振動峰。通過RGO（b）和ZnS/RGO（c）可以明顯看出，在經過微波還原之后，GO 中所有含氧基團的吸收峰均有不同程度的減小，說明GO 已被還原。圖3（A）為拉曼圖，其中，ZnS/RGO 復合物的ID/IG值高于GO、RGO，說明復合物比RGO 有更多的缺陷位點，也進一步證實了RGO 的還原。

圖3 （A） 拉曼光譜GO （a），RGO （b），ZnS/RGO （c）；（B） XRD譜圖：ZnS/RGOFig.3 Raman spectrum (A) of GO (a), RGO (b), ZnS/RGO (c) and XRD spectrum (B) of ZnS/RGO

為研究復合材料晶體結構，對ZnS/RGO 樣品進行了XRD 分析。如圖3（B）所示，主要衍射峰28.71（111）、48.68（220）、57.12（311）與閃鋅礦結構的ZnS 晶面特征峰吻合［20］，證實材料中含有ZnS。

進一步通過透射電鏡圖（TEM）表征石墨烯復合物的形貌。如圖4 所示，均可以觀察到石墨烯常見的褶皺結構，圖4（a）中不規則的ZnS 納米粒子附著在石墨烯上，相比RGO（c），ZnS 也可以降低石墨烯片層的團聚。

圖4 透射電鏡圖ZnS/RGO （a），GO （b），RGO （c）Fig.4 TEM of ZnS/RGO (a), GO (b), RGO (c)

2.2 ZnS/RGO修飾電極對核黃素的電化學響應

為探究ZnS/RGO 復合材料對核黃素的電催化增強效應，分別考察了裸電極（GCE）、RGO修飾玻碳電極（RGO/GCE）、ZnS 修飾玻碳電極（ZnS/GCE）、ZnS/RGO 修飾玻碳電極（ZnS/RGO/GCE）在PBS（pH=6.0）和含RF 的PBS 溶液（1 mmol·L-1，pH=6.0）中的循環伏安（Cyclic voltammetry，CV）行為。圖5 可以看出，ZnS/RGO/GCE 對RF 的電流響應最大，證實了ZnS/RGO/GCE 具有優良的電催化性能和導電性能，同時表現出RGO 和ZnS 的協同作用。

圖5 不同修飾電極在（a）無核黃素（b）有核黃素存在下的CV圖Fig.5 CVs of different modified electrode in the absence (a) and presence of RF (b)

2.3 核黃素檢測條件的優化

研究材料滴涂量、溶液pH 及掃描速度對RF 在ZnS/RGO/GCE 上響應電流的影響。首先考察1 mg/mL ZnS/RGO 水溶液在玻碳電極上滴涂量的影響，圖6（a）中當滴涂量由6 μL增加到10 μL 時，電極在核黃素溶液中的響應電流逐漸增大，當用量超過10 μL 時，電流反而下降?？赡芤驗殡姌O表面的修飾膜太厚，阻礙了電極表面的電子轉移。因此，選擇10 μL 為最佳修飾量。接著對待測物的pH 值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）進行優化。如圖6（b）所示，隨著pH 值的增加，RF 的峰電位值逐漸負移，此現象表明在RF 的催化氧化過程中有氫離子的參與。在內插圖中可以看出當pH=6.0 時，RF 響應電流達到最高值，故pH=6.0 選為最優值。最后，測定修飾電極在不同掃描速度下的CV曲線。圖6（c）所示，在10～100 mV·s-1內，RF 的氧化還原峰電流峰隨著掃速的增加而漸漸增大，且氧化峰電位正向移動，還原峰電位負向移動。圖6d 為氧化峰（Ipa）、還原峰（Ipc）分別對掃描速度平方根（v1/2）擬合，得出Ipa=0.886 02v1/2+2.006 24、Ipc= -0.607 60v1/2-6.396 93?？膳袛喑鯮F 在ZnS/RGO/GCE 上的電化學行為是由擴散過程控制的。

圖6 （a） 材料滴涂量； （b）溶液pH；（c）掃描速度對核黃素響應電流的影響；（d） Ipa和Ipc與v1/2的線性擬合圖Fig.6 Effect of drop-coating volume (a); pH values of solution (b); scan rate (c) on the current of RF; the calibration plots of peak current vs square root of scan rates (d)

2.4 電化學傳感器對核黃素的線性檢測

在最佳實驗條件下，采用DPV 法對不同濃度的核黃素進行測定，結果顯示，在0.3～1 μmol·L-1和1～80 μmol·L-1濃度范圍內，核黃素的峰電流與濃度之間呈現良好線性關系，如圖7A，其相應的回歸方程為：y=0.875 387C-0.215 19（R2=0.992 3，圖7（b））和y=0.111 601C+0.838 596（R2=0.996 9，圖7（c））。最低檢測限（LOD）為0.029 μmol·L-1（S/N=3）。與已報道的電化學傳感器相比，本傳感器對核黃素的檢測在線性范圍、靈敏度以及檢測限方面具有較大優勢（見表1），其優良的傳感性能來源于石墨烯良好的導電性和ZnS 的催化作用。兩種材料之間的協同作用使得電極表面的電子移動空間和活性位點增大增多。

表1 測定RF的電化學方法對比Table 1 Comparison of this method with the other electrochemical methods for determination of RF

圖7 （a） ZnS/RGO/GCE在不同濃度的核黃素溶液中DPV圖；（b） 0.3 μmol·L-1～1 μmol·L-1；（c） 1 μmol·L-1～80 μmol·L-1的核黃素與電流的線性擬合圖Fig.7 (a) DPV of ZnS/RGO/GCE in PBS solution containing different RF; Calibration curves of peak current vs RF concentration for (b) 0.3-1 μmol·L-1 and (c) 1-80 μmol·L-1

2.5 電化學傳感器的重現性、穩定性和選擇性

為評估ZnS/RGO/GCE 的重現性和穩定性，將修飾好的電極在1 mmol·L-1核黃素溶液中進行CV 掃描，10 次循環測試之后，發現對于核黃素的響應電流仍能保持首次測定時還原峰電流值的97.85% （圖8（a）），10 次結果的相對標準偏差RSD 為5.77%。此外，平行修飾五支玻碳電極，對同一溶液進行CV 測定。如圖8（b）所示，RSD 為1.83%。說明該材料具有優異的重現性。在4 °C 下，將ZnS/RGO/GCE 存放10 d 后對核黃素進行測定，其電流信號仍保持原始電流的96.05%，僅下降了3.95%，說明該材料具有良好的穩定性 （圖8（c））。最后，考察在實際檢測中可能對核黃素測定存在影響的生物分子及無機離子，如：NaCl、GaCl2、Glu、FA、Lys、Vc 等。在含有1 mmol·L-1核黃素的溶液中分別添加同濃度的干擾物進行DPV 測試，結果如圖 8（d），除GaCl2產生7.25%的信號變化，其余干擾物對于核黃素的信號改變值均小于4%，表明該傳感器具有優良的選擇性。

圖8 ZnS/RGO/GCE的重現性（a）和（b）穩定性（c）和選擇性（d）的研究Fig.8 Reproducibility (a) and (b); Stability (c) and selectivity (d) of ZnS/RGO/GCE

2.6 實際樣品檢測

采用加標回收法對牛奶和血清中樣本中的核黃素進行測定。結果如表2 所示，選取一定濃度的加標樣品，每組平行測定3 次，核黃素的回收率在95.40% ～105.73%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.06%～10.69%，此方法可用于牛奶和血清中RF 的檢測（表中測定結果均為平均值）。

表2 牛奶和血清中核黃素的測定結果Table 2 Determination results of RF in milk and serum

3 結論

通過簡單綠色的微波法合成ZnS/RGO 復合材料，該材料結合了ZnS 和RGO 的優良特性，展現出協同作用，對核黃素有較高的催化能力。根據這一事實，成功構建了綠色實用的用于檢測核黃素的電化學傳感器。最終選擇修飾量10 μL，1 mg/mL 的ZnS/RGO，待測物溶劑為pH=6.0 的0.1 mol·L-1的PBS 緩沖溶液為最優檢測條件，傳感器在0.3 μmol·L-1～ 1 mol·L-1和1 μmol·L-1～80 μmol·L-1濃度范圍內，分別呈現出良好線性關系，檢出限為0.029 μmol·L-1。并用于牛奶和血清樣品中核黃素的檢測，回收率在95.40%～105.73% 之間，表明ZnS/RGO/GCE 有望成為一種檢測核黃素的新方法。