臨床孤立綜合征轉歸多發性硬化的生物標志物分析

梁葉源 張瀅 丘小慧 唐玉蘭 梁軍利

臨床孤立綜合征(CIS)指單次發作的急性或亞急性中樞神經系統脫髓鞘疾病,持續時間超過24 h[1]。多數CIS患者可出現復發,常轉歸為多發性硬化(MS),少部分患者轉歸為視神經脊髓炎譜系疾病(NMOSD)等中樞神經系統免疫性疾病[2]?；贑IS和MS治療策略和預后的差異,從MS發病機制角度探索CIS的轉歸特點,可能為MS的診斷、預后以及早期干預措施提供依據。近期研究發現,維生素D通過抑制記憶T細胞分化為促炎輔助T細胞1(Th1)和Th17淋巴細胞,減少白細胞介素17A(IL-17A)、IL-23、IL-21、IL-22等因子分泌[1],從而抑制MS等疾病的炎癥反應[3]。血清維生素D及其受體(VDR)水平的降低與MS的發病相關[4]。本研究通過分析CIS患者轉歸MS前后血清維生素D〔25(OH)D2和25(OH)D3〕、VDR水平及血清和腦脊液(CSF)Th17細胞因子水平的變化,旨在探討其在MS病情演變評估及CIS轉歸中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象納入2018年1月至2020年11月廣西醫科大學第一附屬醫院及廣西醫科大學第二附屬醫院神經內科收治的CIS患者74例,其中女54例,男20例,平均年齡(31.64±8.42)歲。納入標準:(1)符合2017年McDonald診斷標準[5];(2)年齡18～60歲;(3)首次發病急性期(癥狀開始1周內);(4)發病前1個月內無免疫治療(包括靜脈/口服激素、免疫抑制劑、丙種球蛋白、血漿置換等);(5)水通道蛋白4(AQP4)抗體和抗髓鞘少突膠質細胞糖蛋白免疫球蛋白G(MOG)抗體陰性。排除標準:(1)發病前2個月內補充維生素D;(2)素食者;(3)合并顱內外感染急性期患者;(4)妊娠期及哺乳期婦女;(5)合并其他免疫相關疾病、腫瘤患者。另選取長期居住在南寧及周邊的神經系統非炎性疾病(non-inflammatory neurological disease,NIND)住院患者30例(包括緊張型頭痛9例,周期性癱瘓21例)作為對照組,其中女19例,男11例,平均年齡(31.17±5.78)歲。對照組排除標準同病例組。兩組間性別構成、年齡比較差異無統計學意義。本研究通過廣西醫科大學第二附屬醫院倫理委員會審查通過(2019-KY-0004),且入組對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1一般資料收集:記錄患者性別、年齡、擴展殘疾狀況量表評分(expanded disability status scale,EDSS)、影像學資料、血及CSF炎癥因子、血清維生素D及VDR水平、治療及隨訪轉歸等資料。比較CIS組和NIND組、CIS轉歸MS組和未轉歸MS組、轉歸MS患者轉歸前后間細胞因子、維生素D水平等差異,并進一步分析維生素D、VDR、EDSS評分與Th17細胞相關因子的相關性。

1.2.2血及CSF采集:CIS患者于入院第2天(均為急性期未經免疫治療時)、NIND患者于入院時禁食8 h后于5:00～6:00點晨起采集靜脈血5 mL,離心取上清液,置-80 ℃冰箱保存待測。采集外周血同時,進行腰椎穿刺留取CSF 3 mL保存備用。

1.2.3維生素D及VDR檢測:采用超高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)分別檢測 25(OH)D2和25(OH)D3水平。以25(OH)D2和25(OH)D3含量之和計算維生素D水平。采用ELISA法檢測血清VDR水平。所有樣品一式兩份進行測定,取均值。

1.2.4炎性因子檢測:采用全自動酶免儀檢測血清及CSF中IL-6、IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23和轉化生長因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)水平。IL-6、IL-21、IL-22、IL-23和TGF-β水平檢測的靈敏度為10 pg/mL,IL-17A水平的靈敏度為2 pg/mL。板內、板間變異系數均小于5%。操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。所有樣品一式兩份進行測定,取均值。

1.2.5影像學檢查:對所有患者進行頭和脊髓MRI檢查,觀察病灶部位、數量、強化情況、脊髓病灶長度。如CIS患者轉歸為MS時復查頭和脊髓MRI。

1.2.6CSF檢查:包括白細胞計數、總蛋白、寡克隆帶(oligoclonal band,OCB)等。

1.2.7治療與隨訪:CIS患者均給予激素治療(甲潑尼龍0.5 g×3 d、250 mg×3 d靜脈滴注,后改為潑尼松口服,1 mg/kg,遞減后1個月內停服)。同時給予抑制胃酸、補鉀治療,所有患者未給予補充維生素D治療,隨訪期間未給予其他免疫治療。入組CIS患者每個月電話隨訪1次,3個月門診隨訪1次,出現臨床復發為隨訪終點。由兩位資深神經內科醫師共同判斷患者是否出現臨床復發及是否確診為MS[5]。如出現新發癥狀或原有癥狀加重,包括轉歸為診斷MS的患者,則在1周內按照前文方法進行血清和CSF采集。

1.3 統計學處理采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析,符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示,兩組間比較采用t檢驗;計數資料比較采用卡方檢驗;相關性分析采用Pearson相關系數分析。以P<0.5為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CIS和NIND組細胞因子水平比較與NIND組比較,CIS組未治療前血清維生素D、 25(OH)D2、25(OH)D3、VDR、IL-6以及血清和CSF TGF-β水平均明顯降低(均P<0.01),血清和CSF IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23水平增高(均P<0.01)。結果見表1。

表1 CIS和NIND患者基線細胞因子水平比較

2.2 轉歸與未轉歸MS組臨床特征及CSF檢測比較74例CIS患者隨訪時間6～42個月,中位數為25個月。失訪3例,分別于隨訪9、11、22個月時各失訪1例,失訪前均未復發。最終共71例CIS患者完成隨訪,納入研究。其中轉歸為MS 43例(60.56%),未轉歸組28例(39.44%)。與未轉歸組比較,轉歸組平均年齡低(P<0.01),CSF白細胞計數增多、總蛋白升高及OCB陽性者比例均高(表2)。

表2 CIS患者轉歸與未轉歸MS組間臨床特征及CSF檢測結果比較

2.3 轉歸和未轉歸MS組患者基線細胞因子水平比較轉歸為MS的CIS患者基線CSF IL-17A、IL-23水平高于未轉歸組(P<0.01)。見表3。

表3 CIS患者轉歸與未轉歸MS組基線細胞因子水平比較

2.4 CIS患者轉歸MS前后Th17細胞相關因子水平比較與轉歸前基線水平相比,轉歸MS后血清IL-17A、IL-23、IL-6水平增高,而TGF-β水平降低(均P<0.05),CSF IL-17A、IL-23、TGF-β水平升高(均P<0.05)。結果見表4。

表4 CIS患者轉歸為MS前后Th17細胞相關因子水平比較

2.5 維生素D、VDR、EDSS與Th17細胞相關因子的相關性CIS患者EDSS評分與血清IL-17A和IL-21水平呈負相關(P<0.05),與其他細胞因子無相關性。血清維生素D、VDR與血清及CSF IL-6、IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23、TGF-β水平均無相關性(均P>0.05)。結果見表5。

表5 CIS患者維生素D、VDR、EDSS與血清和CSF Th17細胞相關因子的相關性

3 討論

有研究表明,85%的MS患者首發癥狀表現為CIS,而約45%的CIS患者2年內將轉歸為MS,偶有轉歸為NMOSD者[2]。本研究結果顯示,與未轉歸MS患者比較,轉歸為MS組CIS患者治療前CSF IL-17A、IL-23水平均升高,提示CSF IL-17A和IL-23可能是CIS轉歸為MS的生物標志物;此外,年齡低、CSF細胞數增多、CSF總蛋白增高、OCB陽性對CIS轉歸為MS有預測價值,這與既往研究結果相似。

近期研究發現,在隨訪1年期內,轉歸為MS的CIS患者血清維生素D水平顯著低于非轉歸組,提示低水平維生素D可作為預測CIS轉歸為MS的獨立預測因子[6]。本研究入組患者居住在北緯20°～26°之間亞熱帶氣候,與年齡、性別和長期居住地相匹配的NIND患者比較,CIS患者血清維生素D、VDR水平降低,維生素D的降低主要以25(OH)D3為主,這與Shaheen等[6]研究結果相似。此外,本研究發現轉歸為MS的CIS患者治療前維生素D水平較未轉歸組有降低趨勢,盡管兩組間比較無統計學差異,亦提示維生素D,尤其是25(OH)D3水平減低可能是CIS轉歸為MS的重要生物標志物。

研究發現Th17細胞相關的因子在自身免疫性疾病的炎癥組織中富集。在MS動物模型中,阻斷IL-23或其下游因子IL-17可降低炎癥反應,抑制疾病的發展[7]。IL-6、IL-17和TGF-β等炎癥細胞因子之間存在復雜的關系網絡,共同誘導中樞神經系統炎性反應,與MS發病密切相關[8],但其在CIS發病機制中的研究未見報道。本研究結果顯示,與NIND組比較,CIS組治療前血清維生素D、25(OH)D2、25(OH)D3、VDR、IL-6以及血清和CSF TGF-β水平均明顯降低,血清和CSF IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23水平增高;進一步研究發現,CIS患者向MS轉歸的過程中,其血清IL-6、IL-17A、IL-23水平增高,TGF-β水平降低,CSF IL-17A、IL-23、TGF-β水平升高,這與既往研究結果一致[9],提示IL-6、IL-17A、IL-23和TGF-β可能是預測CIS向MS轉歸的生物標志物,在CIS發病及轉歸為MS的機制中可能發揮重要作用。

目前,針對MS或CIS患者維生素D與Th17細胞相關因子相關性的研究較少。有研究發現,維生素D能夠抑制MS患者單核細胞來源的樹突狀細胞的分化和成熟,抑制IL-23分泌,最終抑制MS進展和復發[10]。對人外周血單核細胞進行體外培養,加入維生素D 72 h后,培養液上清中IL-17、IL-23和TGF-β水平明顯降低,提示維生素D可能減少促炎因子的表達和分泌[11]。本研究未發現CIS患者血清維生素D、VDR與Th17細胞相關因子存在相關性,僅發現患者EDSS評分與血清IL-17A和IL-21水平呈負相關,這與既往多數研究結論并不一致[12]。近年來Hernandez-Ledesma等研究亦發現MS患者維生素D與Th17細胞相關因子水平不存在明顯的相關性[13]。作者猜測,導致研究結論不一致的原因可能與樣本量較少有關,也可能維生素D和Th17細胞相關因子對MS具有獨立的調節作用。

本研究結果顯示,轉歸為MS的患者基線CSF OCB陽性率及細胞計數和總蛋白水平增高患者比例高于未轉歸組,提示這些指標可能成為預測MS的潛在指標。本研究轉歸為MS的CIS患者中OCB陽性達72.09%,CSF細胞數和總蛋白均為輕度增高,這與既往研究結果相似[14-15]。其原因可能為在MS患者的慢性淋巴細胞炎癥過程中,微血管內皮被激活并產生前列腺素,抑制淋巴細胞轉化,出現巨噬細胞和淋巴細胞浸潤,導致淋巴細胞在CSF中占主導地位[16]。同時血腦屏障被破壞,外周血蛋白成分進入CSF及鞘內合成免疫球蛋白,引起CSF總蛋白呈現輕度升高。

針對CIS急性期患者的治療,專家共識建議應用大劑量、短療程糖皮質激素,原則上總療程不超過3～4周[17]。越來越多的研究結果顯示疾病修正療法可延緩CIS向MS的轉歸,或可降低復發率[18]。但亦有研究指出在CIS發病后和轉化為MS之前使用疾病修正療法并無顯著的保護作用[19]。本研究納入的CIS患者急性期激素治療療程均小于1個月,絕大多數的患者癥狀達到完全緩解的程度,但3年的隨訪中復發率為58.11%,稍高既往報道的平均水平,進一步為CIS患者緩解期仍需要免疫調節治療提供證據。此外,Th17細胞相關因子變化,包括IL-6水平升高、IL-10水平降低等是NMOSD等多種自身免疫疾病的共有現象,其特異性較低[20]。后續仍需對CIS轉歸MS預測指標的特異性進行深入研究。

綜上所述,CSF IL-17A和IL-23水平增高可能是預測CIS轉歸為MS的潛在生物標志物。在臨床診療中,監測CIS患者CSFIL-17A和IL-23水平有可能預防CIS轉歸為MS,這可能為CIS患者制定新的治療方案提供科學依據。