纖維素酶的低共熔溶劑雙水相萃取研究

付玉潔,于海龍

(青島科技大學 化工學院,山東 青島 266042)

基于預處理、酶水解等過程的糖平臺轉化技術可將農林生物質資源轉化為各種燃料、化學品和材料,是我國能源發展戰略的重要內容,對國家“鄉村振興”“碳中和”等重大戰略的成功實施有積極推動作用[1-3]。然而,傳統纖維素酶水解反應是在p H=4.8的酸性緩沖液體系中進行的,這并不是酶發揮催化活性的最佳反應溶劑,并且酶在緩沖體系中存在穩定性低、易失活、難回收等問題。尋找新型綠色溶劑體系改善酶的活性、穩定性和可回收性,是突破農林生物質資源糖平臺轉化技術瓶頸,加速其工業化生產的根本舉措。

相比于傳統溶劑和離子液體,低共熔溶劑(DES)具有易制備、非揮發、低毒性、可再生、可設計、可生物降解、可循環使用等眾多優點,被認為是綠色和可持續工業中最有應用潛力的新型溶劑[4-5]。DES酶促反應技術是繼常規水溶液酶促反應和有機相酶促反應發展起來的新型酶促反應技術,具有生物相容性好、酶結構穩定的特性,有助于解決目前酶催化工業上因環境不匹配帶來的應用瓶頸,為酶催化反應提供一個真正合適的介質環境[6-7]。研究表明,DES強大的氫鍵網絡結構可以穩定蛋白質分子構象,提高酶的催化活性和穩定性[8-9],常見酶系如脂肪酶、蛋白酶和水解酶在DES中均表現出較好的反應活性[10-12],在纖維素酶水解糖化方面具有巨大的應用潛力,但相關技術亟需開發。并且利用DES作為成相劑所構建的DES雙水相體系有效地結合了DES和雙水相萃取技術的優點,在纖維素酶回收再利用方面擁有巨大潛力。因此設計DES水解體系,是解決酶水解效率低、穩定性差和酶回收難的有效措施。

本工作制備了不同的氯化膽堿基低共熔溶劑,通過對DES體系下纖維素酶活性進行測定,篩選出能夠增強纖維素酶活性的DES 體系,并構建DES雙水相系統對纖維素酶進行回收,并通過紫外光譜、熒光光譜、電導率儀和動態激光散射儀揭示萃取機理。研究結果可為尋找改善酶的活性和可回收性的新型綠色溶劑體系提供重要的理論依據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

纖維素酶1.5L,青島吉寶生物科技有限公司;氯化膽堿(Ch Cl),國藥集團化學試劑有限公司;聚乙二醇200(PEG200),國藥集團化學試劑有限公司;考馬斯亮藍G250,國藥集團化學試劑有限公司;無水磷酸氫二鉀,國藥集團化學試劑有限公司。

電熱恒溫鼓風干燥箱,DHG-9146A 型,上海精宏實驗設備有限公司;智能磁力攪拌器,ZNCL-TS型,鄭州予科儀器設備有限公司;電導率儀,DDS-307A 型,上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 低共熔溶劑的制備

將甘油、乙二醇、聚乙二醇200、乳酸、草酸或冰乙酸與氯化膽堿按一定的物質的量的比(2∶1、1∶1、1∶2、1∶3或1∶4)混合,在80℃下加熱并不斷攪拌,直至形成無色透明液體;并通過測定DES水溶液中纖維素酶活性篩選合適的溶劑。

1.3 DES體系下水解玉米秸稈

準確稱量1 g過孔徑0.4 mm 篩的玉米秸稈粉末(絕干),將其加入到含有50 mL 質量分數10%DES水溶液或0.01 mol·-1醋酸緩沖液(p H4.8)的錐形瓶中,放入恒溫震蕩搖床中在50℃和150 r·min-1下水解96 h。水解中纖維素酶用量為9 FPU·g-1,纖維二糖酶用量50 U·g-1。分別在0、3、6、9、12、24、36、48、72、96 h 時定時取樣,經5 000 r·min-1離心5 min后用0.22μm 針式過濾器過濾后通過高效液相色譜檢測葡萄糖含量。

1.4 纖維素酶的回收

取適量DES、纖維素酶和一定濃度的K2HPO4水溶液混合,混合物在500 r·min-1下攪拌使其充分混合后,在25℃下萃取30 min。記錄上下兩相的體積,并用考馬斯亮藍法測定上下兩相中的蛋白含量。萃取率計算公式如下:

其中,F代表上相萃取效率;ρt和ρb代表上下兩相中的纖維素酶濃度;Vt和Vb分別代表上下兩相的體積。

1.5 結構表征

1.5.1 DES體系下纖維素酶的構象研究

使用日立F-4600型熒光光譜儀對樣品掃描,采用1 cm 石英比色皿,狹縫寬度為10 nm,激發波長280 nm,波長掃描速度為1 200 nm·min-1,掃描波長為300～540 nm;采用英國應用光物理Chirascan Plus型圓二色譜儀掃描樣品,狹縫寬度為1 nm,掃描速度為50 nm·min-1,掃描光程為0.2 cm,掃描波長為近紫外區190～250 nm。

1.5.2 雙水相萃取纖維素酶的機理研究

通過紫外光譜及熒光光譜測試探究萃取前后纖維素酶構象的變化;并為了進一步研究纖維素酶的萃取機理,利用電導率儀和動態激光散射儀(DLS)考察低共熔溶劑富集相的微觀結構。

2 結果與討論

2.1 DES體系下纖維素酶活性

為試驗方便,選取在室溫下仍能保持液體狀態的DES進行研究,并考慮到DES黏度較高的缺陷,將其配置成10%的DES水溶液(V/V,p H=4.8)使用?？疾炝瞬煌珼ES水溶液體系對于纖維素酶活性的影響,見圖1。從圖1可以看出,n(ChCl)/n(G)=1/4和n(ChCl)/n(PEG200)=1/3對纖維素酶的活性有增強作用,分別提高了11.27%和4.64%;而其他低共熔溶劑對纖維素酶活性幾乎沒有增強作用,甚至會使纖維素酶活性明顯下降。因此,選擇n(ChCl)/n(G)=1/4和n(ChCl)/n(PEG200)=1/3進行后續研究。

圖1 DES體系下纖維素酶的活性Fig. 1 Activity of cellulase in DES system

為進一步尋找合適的DES水溶液體系,考察了DES濃度對于纖維素酶活性的影響見圖2。從圖2中可以看出,隨著DES含量的不斷增加,纖維素酶活性先增強后減弱。其原因可能是DES體積分數在10%以下時,低共熔溶劑的氫鍵網絡結構可以穩定纖維素酶分子構象,使纖維素酶的催化活性增強;而當DES體積分數超過10%以后,DES含量的增多使得體系的黏度增大,阻礙了纖維素酶與底物的接觸,從而使其活性減弱。

圖2 DES濃度對纖維素酶活性的影響Fig. 2 Effect of DES concentration on cellulase activity

DES體系下纖維素酶的水解糖化性能研究見圖3。以玉米秸稈作為底物,探究DES體系下纖維素酶水解玉米秸稈的葡萄糖產率。其中纖維素酶用量為9 FPU·g-1,纖維二糖酶用量為50 U·g-1。從圖3中可以看出,纖維素酶對玉米秸稈顯示非常低的水解糖化效率,水解96 h后葡萄糖水解得率為35.39%,說明纖維素酶的活性低,極大地抑制了酶解。DES體系下,由于DES 的氫鍵網絡結構可以穩定蛋白質分子構象,提高酶的催化活性和穩定性,酶解得到了明顯的改善。10%n(ChCl)/n(G)=1/4水溶液體系下,纖維素酶的水解葡萄糖得率最高,水解96 h達到41.14%;10%n(ChCl)/n(PEG200)=1/3水溶液體系下,水解96 h葡萄糖得率次之,為37.76%。上述結果表明,DES 水溶液體系可以有效的提高玉米秸稈的水解葡萄糖得率。

圖3 纖維素酶水解玉米秸稈的水解葡萄糖得率Fig. 3 Glucose yield from cellulase hydrolysis of corn stover

2.2 雙水相萃取條件優化

為了實現纖維素酶的回收使用,利用DES 與K2HPO4構建雙水相體系對纖維素酶進行萃取。由實驗得知,與n(ChCl)/n(G)=1/4 相比,n(Ch Cl)/n(PEG200)=1/3更易與K2HPO4溶液形成雙水相。由于萃取條件對雙水相萃取有顯著影響,從而影響雙水相體系對于纖維素酶的萃取。因此本實驗考察了鹽濃度、DES用量、纖維素酶質量、萃取時間和溫度等因素對雙水相體系萃取纖維素酶的影響。

圖4考察了K2HPO4濃度對纖維素酶萃取率的而影響。如圖4所示,隨著K2HPO4濃度的繼續增加,纖維素酶的回收率逐漸增加,在K2HPO4濃度為0.25 g·m L-1時回收率達到最大值69.53%;這主要是由于鹽析作用,下相中的鹽離子與纖維素酶之間存在結合水分子的競爭關系,因此無機鹽質量的增加會導致纖維素酶在下相的溶解度降低,使其回收率增大。但是當體系中K2HPO4的濃度超過0.25 g·L-1時,纖維素酶的回收率隨著鹽濃度的增加而迅速降低;這是因為纖維素酶表面存在水化層,且水分子與纖維素酶表面氨基酸殘基之間的氫鍵作用是蛋白質分子保持形貌和活性的重要作用力,而鹽濃度的進一步增加會引起上相含水量的降低,從而使上相中的纖維素酶含量降低,回收率下降。因此體系中K2HPO4的最佳濃度為0.25 g·m L-1,它將在后續工作中繼續使用。

圖4 K2 HPO4 濃度對纖維素酶萃取率的影響Fig. 4 Effect of K2 HPO4 concentration on extraction rate of cellulase

圖5考察了DES濃度對纖維素酶萃取率的影響。從圖5可以看出,當體系中DES的體積分數從30%增加到35%時,纖維素酶的回收率持續增加并達到最大值73.89%;這主要是隨著DES體積分數的增加,更多的DES膠束在上相中形成,有利于結合更多的纖維素酶。而當DES 的體積分數超過35%時,纖維素酶的回收率表現出下降趨勢;這是由于隨著DES的進一步增加,上相的黏度逐漸增加,阻礙了纖維素酶進入上相。因此在后續試驗中DES的體積分數為35%。

圖5 DES濃度對纖維素酶萃取率的影響Fig. 5 Effect of DES concentration on extraction rate of cellulase

溫度是纖維素酶萃取過程中一個重要的影響因素?？疾炝溯腿囟葘τ诶w維素酶萃取率的影響見圖6。從圖6可以看出,溫度低于25℃時,纖維素酶的回收率逐漸升高;這是由于隨著溫度的升高,DES富集相的黏度逐漸降低,并且兩相之間的界面阻力下降,從而能夠使纖維素酶快速進入上相。當溫度超過25℃時,纖維素酶的回收率急劇下降;這是因為溫度超過某一特定值時,纖維素酶表面氨基酸基團和水分子之間作用力減弱,不利于其結合DES進入上相。由此,確定最佳萃取溫度為25℃。

圖6 溫度對纖維素酶萃取率的影響Fig. 6 Effect of temperature on extraction rate of cellulase

圖7和圖8分別考察了萃取時間和纖維素酶濃度對于纖維素酶萃取率的影響。如圖7所示,纖維素酶的回收率隨著萃取時間的增加而逐漸增加,當萃取時間超過30 min后,回收率增加緩慢并且基本保持不變。并且隨著纖維素酶用量的不斷增加,回收率逐漸降低(圖8)。這都表明了雙水相體系萃取的容量有限,隨著纖維素酶用量的持續增加或者萃取時間的延長,上相基本達到飽和狀態后,以至于沒有更多的空間容納纖維素酶,導致其進入下相,從而使回收率下降。

圖7 時間對纖維素酶萃取率的影響Fig. 7 Effect of time on extraction rate of cellulase

圖8 酶濃度對纖維素酶萃取率的影響Fig. 8 Effect of enzyme concentration on extraction rate of cellulase

總之,當雙水相體系中的K2HPO4濃度為0.25 g·m L-1、DES體積分數為35%,在25℃下對較少纖維素酶萃取30 min時,可以對纖維素酶獲得良好的萃取效果。

為了實現纖維素酶水解后的重復使用,利用DES雙水相體系對水解液中的纖維素酶進行回收。最優條件下對水解液中纖維素酶的回收效果見表1。從表1中可以看出,水解液中94.24%的纖維素酶被萃取上相,而僅有27.82%的葡萄糖隨之進入。這表明雙水相體系可以有效的將纖維素酶與葡萄糖分離,實現對纖維素酶的回收利用;并且回收后纖維素酶的活性仍能保持90%以上,這也表明了雙水相體系萃取能夠為纖維素酶提供一個溫和的環境。

表1 雙水相萃取結果Table 1 Aqueous two-phase extraction results

2.3 結構表征

2.3.1 DES體系下纖維素酶構象的測定

為探究DES體系為何有利于纖維素酶活性的增強,通過熒光光譜和圓二色譜對纖維素酶構象進行表征。

在天然蛋白質中,能產生熒光的芳香氨基酸殘基包括色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)。它們通常位于蛋白質的三維結構內,被各種非極性氨基酸殘基所包圍。因此,它們所處的局部環境比蛋白質分子外的水溶液的極性小。如果將它們移到蛋白質的外部,暴露在外部極性很強的水溶液中,就會發生熒光猝滅現象。色氨酸,酪氨酸和苯丙氨酸相對熒光強度之比為100∶9∶0.5。色氨酸的熒光強度最高,在熒光光譜中會覆蓋其他氨基酸殘基的吸收峰,表現為一寬峰。圖9所示為DES體系下纖維素酶的熒光光譜。在340 nm 處的熒光峰為3種芳香族氨基酸殘基的復合峰。酶在DES水溶液中產生熒光猝滅效應(熒光強度降低),并發生藍移。表明Trp、Tyr和phe向纖維素酶表面移動,有利于其與底物的接觸,從而使得其水解糖化能力增強。

圖9 DES體系下纖維素酶的熒光光譜Fig. 9 Fluorescence spectra of cellulase in DES system

圓二色譜(CD)被廣泛應用于測量蛋白質的二級結構和推測蛋白質的三級結構。天然纖維素酶和修飾纖維素酶的CD 光譜如圖10所示。天然纖維素酶在210 nm 處有一個寬峰,表明其三級結構符合“α+β”型[13]。處于DES水溶液環境中的纖維素酶樣品的CD 峰吸收強度增加并發生紅移,說明DES水溶液體系改變了二級結構的相對濃度,從而增強了蛋白質的空間結構。根據CD 光譜,通過CRDATA 和SELCON3 計算α-螺 旋、β-折疊、β-轉角、無規則卷曲等二級結構的相對含量,見表2。傳統緩沖溶劑中纖維素酶的α-螺旋和β-折疊相對含量分別為26.00%和27.30%,再次證實了天然纖維素酶具有“α+β”型的三級結構特征。DES 水溶液體系提高了α-螺旋和β-轉角結構的相對含量,降低了β-折疊和無規則卷曲結構的相對含量。特別是,α-螺旋含量的增加意味著纖維素酶的空間結構具有較高的穩定性。

表2 DES體系下纖維素酶的二級結構含量Table 2 Secondary structure contents of cellulase in DES system

圖10 DES體系下纖維素酶的圓二色譜Fig. 10 Circular dichroism of cellulase in DES system

總的來說,DES強大的氫鍵網絡結構可以穩定蛋白質分子構象,并使得纖維素酶的活性氨基酸殘基向纖維素酶表面移動,從而使得纖維素酶的活性和穩定性增強。

2.3.2 DES雙水相萃取機理研究

紫外光譜可以通過測定蛋白質的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基的紫外吸收峰,進而分析蛋白質三級結構的變化。圖11為萃取前后纖維素酶的紫外光譜。從圖11可以看出萃取前后纖維素酶的紫外光譜相似,并且其最大吸收峰的位置沒有變化。這表明DES與纖維素酶之間沒有化學鍵的形成,即DES雙水相體系可以為纖維素酶的萃取提供一個溫和的環境,不會改變纖維素酶的構象。

圖11 回收前后纖維素酶的紫外光譜Fig. 11 UV spectra of cellulase before and after recovery

熒光光譜可以通過測定蛋白質以及反應體系的熒光強度,從而研究蛋白質在變性或復性過程中整體空間構象的變化。圖12為萃取前后纖維素酶的熒光光譜。從圖12可以看出,萃取前后的纖維素酶的激發波長位置沒有發生改變,進一步證實了DES與纖維素酶之間沒有化學鍵的形成,與紫外光譜分析結果保持一致。

圖12 回收前后纖維素酶的熒光光譜Fig. 12 Fluorescence spectra of cellulase before and after recovery

為了進一步研究纖維素酶的萃取機理,本實驗利用電導率、動態光散射分析儀考察了DES富集相的微觀結構。

不同濃度DES水溶液的電導率測定,見圖13。從圖13可以看到,根據電導率的變化曲線繪制了兩條線性片段,與這兩條線性片段的交點對應的濃度為臨界聚集濃度(CAC)。DES 的CAC 值為14%(體積分數),在雙水相體系中使用的DES濃度均高于此值,因此在DES富集相中均有DES聚集體生成,這也可能是DES雙水相體系萃取纖維素酶的主要作用力。

圖13 不同濃度DES水溶液的電導率Fig. 13 Conductivity of aqueous solutions of DES with different concentrations

圖14為動態光散射分析儀測定的纖維素酶溶液、無酶的DES富集相和含酶的DES富集相中粒子的尺寸分布圖。從圖14可以看出纖維素酶的粒徑在230.1 nm 左右,無酶的DES富集相的粒徑在956.3 nm 左右,而含有纖維素酶的DES富集相的粒徑在1 233.0 nm 左右,較之以前尺寸明顯增大。這證明了在萃取過程中,DES聚集體可能將纖維素酶包裹,形成了新的簇集體。

圖14 粒子大小分布圖Fig. 14 Size distribution of porticles

萃取機理研究表明:DES的簇集作用是DES雙水相體系萃取纖維素酶的主要作用力。在萃取過程中,DES通過簇集作用將纖維素酶包裹,形成新的聚集體,進而將纖維素酶攜帶進入上相,實現對纖維素酶的回收。并且DES雙水相體系為纖維素酶的萃取提供了溫和的環境,不會導致酶的結構發生變化。

3 結論

研究了低共熔溶劑體系下纖維素酶的活性,并以此構建雙水相體系對纖維素酶進行回收。通過單因素實驗確定了最佳萃取條件,并指出DES的簇集作用是雙水相體系萃取纖維素酶的主要作用力。纖維素酶的紫外光譜以及熒光光譜證實,雙水相體系為纖維素酶提供了一個溫和的環境,不會導致酶結構發生變化。電導率和DLS研究表明,纖維素酶的提取可能是因為DES聚集體將其包裹,形成了新的聚集體。本工作首次將DES雙水相體系應用于纖維素酶的回收利用,當雙水相體系中K2HPO4濃度為0.25 g·m L-1,DES體積分數35%,在25℃下對較少纖維素酶萃取30 min時,達到了94.29%的回收率。此實驗可為尋找改善纖維素酶的活性和可回收性的新型綠色溶劑體系提供重要的理論依據。遺憾的是,DES雙水相萃取仍不能完全將纖維素酶與糖類分開。但在未來的研究中,將考慮到纖維素酶的構象,并努力設計出具有特定蛋白質鑒定能力的低共熔溶劑。