基于網絡藥理學和分子對接探討銀杏葉調控鐵死亡抗帕金森病的潛在機制

馮科宇 莫圣龍 郭蘇嬋 黃珍珍 楊成敏 簡崇東

【摘要】 目的 通過網絡藥理學方法探討銀杏葉通過調控鐵死亡抗帕金森?。≒arkinsonss disease，PD）的可能靶標以及潛在的作用機制。

方法 首先，從中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫中預測銀杏葉活性成分及相關靶點，從Genecards數據庫收集PD的靶點，從鐵死亡數據庫（ferrDB）獲取調控鐵死亡的基因。隨后，取銀杏葉活性成分靶點、PD靶點及鐵死亡靶點三者的交互基因；然后，對交互基因進行蛋白質-蛋白質互作（PPI）網絡構建，運用軟件Cytoscape 3.9.1可視化并篩選出關鍵活性成分和靶基因；最后，進行基因本體論（GO）、京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。分子對接結果證明銀杏葉活性成分與關鍵靶點對接良好。

結果 經篩選共得到27種銀杏葉活性成分以及209個潛在的蛋白作用靶點，PD靶點有1827個，調控鐵死亡基因有259個，三者交集的靶點有18個。通過PPI網絡分析共得到HMOX1、TP53、EGFR、JUN、HIF1A、VEGFA、PTGS2等7個關鍵靶點。主要涉及通路有流體剪切應力和動脈粥樣硬化、化學致癌-活性氧、MAPK通路等。

結論 銀杏葉調控PD中鐵死亡途徑可能與HMOX1、TP53、EGFR、JUN、HIF1A、VEGFA、PTGS2等靶點有關，涉及化學致癌-活性氧、MAPK等信號通路。

【關鍵詞】 銀杏葉；鐵死亡；帕金森??；網絡藥理學；分子對接

中圖分類號：R285?? 文獻標志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.04.006

Exploration of the potential mechanism of Ginkgo leaf on the regularization of

ferroptosis and the confrontation of Parkinson's disease based on network pharmacology and molecular docking

FENG Keyu1，2， MO Shenglong1，2， GUO Suchan1，2， HUANG Zhenzhen1，2， YANG? Chengmin1， JIAN Chongdong1

（1.Department of Neurology， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China;

2.Graduate School， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To explore the possible targets and potential mechanisms of Ginkgo leaf on the regularization of ferroptosis and the confrontation of Parkinson's （PD） disease through network pharmacology method.

Methods Firstly， the active components and related targets of Ginkgo leaf were predicted from the Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP） database， Parkinson's disease targets were collected from the Genecards database， and the genes regulating ferroptosis were obtained through the ferroptosis database （ferrDB）.Next， interacting genes of the active components and related targets of Ginkgo leaf， the PD targets and the genes regulating ferroptosis were taken.Then， protein-protein （PPI） network was constructed for the interactive genes， and the software Cytoscape 3.9.1 was used to visualize and screen out the key activities components and target genes.Finally， Gene Onotology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analysis were performed on them.Molecular docking results proved that the active components of Ginkgo leaf the interactive genes??? were well docked with key targets.

Results A total of 27 active components of Ginkgo leafs and 209 potential protein targets were screened， including 1827 PD targets， 259 ferroptosis genes， and 18 targets that intersected with the three.7 key targets including HMOX1， TP53， EGFR， JUN， HIF1A， VEGFA and PTGS2 were obtained by PPI network analysis.The main pathways involved were fluid shear stress and atherosclerosis， chemical carcinogenesis-reactive oxygen species， and MAPK pathways， etc.

Conclusion The regulation of ferroptosis in PD by Ginkgo leaf may be related to HMOX1， TP53， EGFR， JUN， HIF1A， VEGFA， PTGS2 and other targets， which involves chemical carcinogenesis-reactive oxygen species， MAPK and other signaling pathways.

【Key words】 Ginkgo leaf; ferroptosis; Parkinson's disease（PD）; network pharmacology; molecular docking

帕金森?。≒arkinsons disease， PD）是世界上第二常見的神經退行性疾?。?］。臨床表現為靜止性震顫、肌強直、姿勢障礙、睡眠障礙、嗅覺障礙、自主神經功能障礙等，PD嚴重降低患者的生活質量，給社會及家庭帶來了沉重的負擔和極大的痛苦［2］。PD的病理特點是黑質致密部的多巴胺能神經元的死亡及丟失和α-突觸核蛋白（α-Synuclein，α-Syn）組成的路易小體的存在［2］，但其具體的發病機制仍待進一步研究。有學者發現鐵死亡是多巴胺能神經元細胞死亡和PD發生的重要途徑［3］。研究發現鐵死亡誘導劑erastin可以誘導鐵死亡，增加小鼠腦內α-突觸蛋白的異常累積，從而導致多巴胺能神經元的丟失［4］。在臨床隨機試驗中證明靶點螯合鐵可以減少患者黑質內的鐵沉積，減緩疾病的進展［5］。因此調節腦內細胞鐵死亡可能是PD的一個潛在的治療方向。

研究表明，銀杏葉及其活性成分在PD發生發展過程中起著重要作用［6］。銀杏葉可通過其抗氧化作用改善由缺氧引起的氧化應激，增加神經元的存活率［7］。盡管銀杏葉在治療PD的生理功能和潛在的分子機制已被充分報道，但銀杏葉對抗PD的藥理學機制仍不清楚，尤其是與鐵死亡相關的潛在作用機制。本文通過網絡藥理學的方法探討銀杏葉調控鐵死亡治療PD的相關機制。

1 資料與方法

1.1 銀杏葉活性化合物收集和靶點預測

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP），篩選出有高度活性的銀杏葉有效成分，篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，化合物類藥性（drug-likeness， DL）≥0.18，同時在TCMSP數據庫檢索高度活性有效成分的靶點。

1.2 注釋銀杏葉靶點的基因

將收集到的靶點導入蛋白質數據庫（UniProt，https：//www.uniprot.org/）和perl軟件，選擇已驗證的信息，限定物種為人，得到相對應的靶基因，并剔除重復和沒有靶點的有效成分，生成“有效成分-作用靶點”數據集。

1.3 PD和鐵死亡靶點的篩選

從GeneCards數據庫（http：//www.genecards.org/）中收集與PD相關的靶基因，以“parkinson”為搜索關鍵詞，score≥1為有效靶點。從FerrDB（http：//www.zhounan.org/ferrdb/）數據庫中篩選與鐵死亡相關的靶點。

1.4 銀杏葉、PD和鐵死亡的三者共同基因

利用在線網站VENNY（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將PD靶點基因、銀杏葉靶點基因和鐵死亡基因取交集，篩選出三者的共同靶點，得到銀杏葉調控鐵死亡抗PD的相關靶點基因，并制作成韋恩圖。

1.5 蛋白質互作（PPI）網絡的構建及關鍵靶點基因的篩選

為了探索目標蛋白之間的相互作用，將篩選出來的共同靶點上傳到STRING數據庫（https：//string-db.org/），篩選條件設置綜合得分為＞0.4及隱藏游離靶點，獲得PPI網絡圖；利用CytoScape對PPI網絡圖進行可視化，利用插件CytoNCA篩選得到核心基因，其度值（degree）序列均為靠前者。

1.6 構建中藥-成分-靶標網絡

基于PD、銀杏葉和鐵死亡交集靶點，利用CytoScape軟件構建中藥-成分-靶標網絡。

1.7 KEGG 和GO集合

通過DAVID在線數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）在生物過程、分子和細胞水平上進行基因本體論（GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。氣泡圖在微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）網站上獲得。利用David在線數據進行GO富集和KEGG通路的分析，P＜0.05代表有顯著性。

1.8 分子對接

活性小分子化合物結構來自PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），關鍵靶點蛋白質結構來自 PDB數據庫（https：//www.rcsb.org）。使用Auto Dock tools軟件對關鍵靶點蛋白結構進行分離蛋白質、添加非極性氫、獲取 PDBQT格式等處理，并計算和小分子化合物結合時的活性口袋數值。通過perl軟件進行分子對接，揭示結合能，然后使用 PyMOL軟件對分子對接結果進行可視化處理。當結合能值<0時，分子蛋白被認為是自發地相互結合和相互作用；當結合能≤-5 kcal/mol 時，代表結合良好，且結合能的數值越小，配體與受體結合越穩定。

2 結? 果

2.1 銀杏葉活性成分獲取和靶點的預測

從TCMSP數據庫中檢索銀杏葉的活性成分，最終收集到銀杏葉有效成分檞皮素、山柰酚、銀杏內酯B等27種（見表1）。運用perl軟件和UniProt數據庫對27種有效成分的靶點添加基因名并剔除重復之后得到209個靶基因。

2.2 靶基因的篩選與構建中藥-成分-靶點網絡

從FerrDB數據庫中下載整理后得到鐵死亡相關基因259個，從GeneCards數據庫獲取PD基因1827個。銀杏葉靶點基因、PD基因和鐵死亡相關基因三者交集共得到18個基因（見圖1），同時構建中藥活性成分-靶點的網絡（見圖2）?；钚猿煞值幕拘畔⒁姳?。

2.3 PPI網絡構建及關鍵靶點的篩選

通過STRING分析得到PPI關系網絡，包括18個節點和111條邊，將PPI網絡導入Cytoscape進行可視化，同時利用插件CytoNA通過對度中心性（degree）、接近性（closeness）、中介中心性（betweenness）、特征向量中心性（eigenvector）、局部平均連接度（LAC）、網絡（network）進行篩選后共得到7個中心基因，分別為：血紅素加氧酶1（HMOX1）、腫瘤蛋白p53（TP53）、表皮生長因子受體（EGFR）、轉錄因子AP1（JUN）、缺氧誘導因子1（HIF1A）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、前列腺素內過氧物合成酶2（PTGS2）。關鍵靶點詳細信息見圖3、圖4和表3。

2.4 GO和KEGG分析

通過GO富集分析顯示得到170條通路，結果按照顯著性排序，選取各項分析的前十項進行展示（見圖5）。GO富集分析鑒定出131個生物過程條目、24個分子功能條目和15個細胞成分條目。在biological process（BP）中，以基因表達正調控（positive regulation of gene expression）、凋亡過程的負反饋（negative regulation of apoptotic process）、對缺氧的反應（response to hypoxia）、對活性氧的反應（cellular response to reactive oxygen species）等為主。在 cellular component（CC）中，細胞質（cytoplasm）和膠質溶膠（cytosol）在細胞成分中占的比例比較大。蛋白結合（protein binding）是最豐富的molecular function（MF）條目。共得到91條KEGG通路，涉及通路包括流體剪切應力和動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、化學致癌-活性氧（chemical carcinogenesis-reactive oxygen species）、MAPK通路（MAPK signaling pathway）等，取前20條信號通路繪制氣泡圖（見圖6）。

2.5 分子對接

本研究采用度中心性（degree）排名前2的槲皮素和木犀草素與關鍵靶點HMOX1、TP53、EGFR、JUN、HIF1A、VEGFA、PTGS2進行分子對接（見表4和圖7）。其中，槲皮素與EGER、HIF1A、TP53、HMOX1的結合能分別為：-8.9 kcal/mol、-7.8 kcal/mol、-7.9 kcal/mol、-8.0 kcal/mol；木犀草素與PTGS2、JUN、VEGFA結合能分別為：-9.5 kcal/mol、-6.5 kcal/mol、-6.6 kcal/mol（見表4）?；钚猿煞峙c核心蛋白的結合能≤-5 kcal/mol，分子對接結果良好。

3 討? 論

通過網絡藥理學研究確認槲皮素和木犀草素是銀杏葉調控PD中鐵死亡的主要活性化合物。槲皮素是一種黃酮類化合物，存在于許多食用和藥用植物中。研究證明使用槲皮素可逆轉細胞外β-淀粉的變性和杏仁核中的tau病，從而保護阿爾茨海默?。ˋD）模型小鼠的認知和情緒功能［8］。槲皮素還能去除活性氧（ROS）和其他氧化物質，是一種鐵死亡細胞死亡的天然抑制劑［9］。木犀草素是一種天然存在的黃酮類化合物，研究已經證實木犀草素具有抗氧化、抗癌、抗炎和神經保護作用。木犀草素通過減輕過氧化氫酶誘導的氧化損傷和細胞內活性氧的產生，有助于治療與氧化應激有關的神經退行性疾?。?0］。

根據PPI蛋白網絡，我們發現HMOX1、EGFR、PTGS2、TP53、HIF1A、JUN 、VEGFA是銀杏葉調控PD中鐵死亡的關鍵基因。HMOX1是一種應激蛋白，可催化血紅素轉化為游離亞鐵，促進帕金森疾病模型中鐵沉積和線粒體功能障礙［11］。EGFR是一種受體絡氨酸激酶，是癌癥發展的主要調節因子，驅動EGFR可在膠質母細胞瘤中誘導鐵死亡［12］。PTGS2，也稱為環加氧酶2（Cox-2），是前列腺素生物合成中的關鍵酶，也是炎癥過程中的重要介質。PTGS2還可作為腦出血時鐵死亡的檢測指標［13］。TP53在調節癌癥鐵死亡中起著雙重作用且依賴于環境作用［14］。一方面，TP53可以通過靶向SAT1增強鐵死亡［15］；另一方面，TP53還可以通過靶向DPP4來抑制鐵死亡［16］。HIF1A是一種缺氧誘導因子，在氧化反應中發揮核心作用，在纖維瘤細胞中，HIF1A通過增加脂肪酸結合蛋白3和7的表達抑制鐵死亡［17］。JUN是一種原癌基因，在面神經損傷時，c-Jun可以抑制面神經元鐵死亡，促進神經修復［18］。VEGFA是一種血管內皮因子，在子宮內膜異位癥中，鐵死亡誘導了VEGFA和IL-8的分泌并促進鄰近病變血管的生成［19］。

GO富集分析顯示，銀杏葉可調控氧化應激、細胞凋亡及對缺氧的反應等生物學過程。KEGG結果分析顯示，化學致癌-活性氧信號通路富集了10個靶點，其中包括HMOX1、EGFR、JUN、HIF1A、VEGFA等五個關鍵靶點，提示該通路可能是銀杏葉調控PD中鐵死亡的主要途徑?；瘜W致癌-活性氧信號主要由ROS觸發，可以激活NF-κB、MAPK、PI3K-AKt等信號通路，發揮調控細胞增殖、分化、凋亡等功能［20］。銀杏葉及其相關活性成分通過活性氧相關通路發揮保護神經的作用。ZHANG等人證明高壓氧和銀杏葉提取物通過NF-κB通路改善AD大鼠模型的認知和記憶障礙［21］。也有學者發現銀杏葉提取物白果內酯對腦缺血再灌注損傷的保護作用與MAPK通路的活化有關［22］。銀杏內酯可作為新型外在調節劑激活AKt/Nrf2 和 AKt/CREB信號通路，在體內和體外防止腦缺血再灌注損傷［23］。鐵死亡的特點是細胞內聚集了脂質ROS，最終導致脂質氧化，從而引起細胞膜的損傷和細胞死亡?；瘜W致癌-活性氧信號在調節鐵死亡方面發揮著重要作用。在非小細胞癌中，激活MAPK信號通路會促進癌細胞鐵死亡［24］。相反，在呼吸窘迫綜合征中，抑制MAPK信號通路的激活可以抑制鐵死亡引起的炎癥和氧化應激［25］。在神經系統疾病中，MAPK信號通路和NF-κB可能在腦出血后誘導產生自由基，從而誘導鐵死亡和細胞凋亡［26］。先前的研究證實，鐵積累后MAPK途徑會被激活，抑制MAPK的激活可減少神經元細胞的死亡［27］。PI3K-AKt信號傳導與許多疾病中的鐵死亡相關，包括肺損傷［28］、膽囊癌［29］等。CHEN等人證明激活PI3K-AKt信號可以改善認知障礙和鐵死亡［30］。

綜上所述，銀杏葉可能通過槲皮素、木犀草素等多種成分作用于HMOX1、TP53、EGFR、JUN、HIF1A、VEGFA、PTGS2等核心蛋白，進而調控化學致癌-活性氧、MAPK等信號通路，從而調控PD中的鐵死亡。然而，需要進一步的研究來證實銀杏葉的臨床療效及其調控PD中鐵死亡的機制。

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（收稿日期：2022-06-24 修回日期：2022-09-25）

（編輯：王琳葵 梁明佩）