基于生物信息學分析艾葉治療慢性蕁麻疹的分子機制

種凱艷 蘭祝飚

[摘要]?目的?運用基因表達數據庫（Gene?Expression?Omnibus，GEO）基因芯片挖掘、生物信息學及分子對接技術，分析艾葉治療慢性蕁麻疹（chronic?urticaria，CU）的分子機制。方法?從GEO數據庫下載CU的基因芯片數據集，利用R軟件篩選出差異表達靶點，從中藥系統藥理學數據庫（Traditional?Chinese?Medicine?Systems?Pharmacology?Database，TCMSP）、藥物靶標識別平臺（Pharm?Mapper）等數據庫獲取艾葉的化學成分、藥物靶點，運用GENEMANIA平臺及R軟件，對藥物–疾病交集靶點進行蛋白質互作網絡（protein-protein?interaction?networks，PPI）分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genome，KEGG）富集分析，使用AutoDock?Vina等軟件進行分子對接驗證。結果?得到CU靶點320個、藥物靶點382個，篩選出藥物–疾病交集靶點20個；PPI拓撲分析得出的核心靶點有ADAMTS4、FABP7、SRM、PDE5A、SOD2等；相關的化學成分有（2R）-5，7-二羥基-2-（4-羥苯基）、亞油酸乙酯、豆甾醇、槲皮素等；富集出涉及脂質和動脈粥樣硬化、長壽調節信號通路、過氧化物酶體增殖活化因子受體（peroxisome?proliferator-activated?receptor，PPAR）信號通路、白細胞介素（interleukin，IL）-17信號通路、趨化因子信號通路等；9種化學成分與5個核心靶點間的分子對接顯示，有40組對接具有結合活性（結合能<–4.25kcal/mol）。結論?艾葉對CU具有多靶點、多成分、多途徑的作用機制，通過文獻檢索及分子對接驗證本次分析結果具有可信性，可為后期的實驗研究提供參考依據。

[關鍵詞]?生物信息學；分子對接；慢性蕁麻疹；作用機制

[中圖分類號]?R285??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.15.006

Analyze?the?molecular?mechanism?of?Artemisia?argyi?in?the?treatment?of?chronic?urticaria?based?on?bioinformatics

CHONG?Kaiyan，?LAN?Zhubiao

Department?of?Dermatology，?Lishui?Hospital?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Lishui?323000，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?analyze?the?molecular?mechanism?of?Artemisia?argyi?in?the?treatment?of?chronic?urticaria?（CU）?by?Gene?Expression?Omnibus?（GEO）?gene?chip?mining，?bioinformatics?and?molecular?docking?techniques.?Methods?The?gene?chip?dataset?of?CU?was?downloaded?from?GEO?database，?the?differentially?expressed?targets?were?selected?using?R?software，?and?the?chemical?composition?and?drug?targets?of?Artemisia?argyi?were?obtained?from?Traditional?Chinese?Medicine?Systems?Pharmacology?Database?（TCMSP），?PharmMapper?and?other?databases.?Used?GENEMANIA?platform?and?R?software，?protein-?protein?interaction?networks?（PPI）?topology?analysis?and?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genome?（KEGG）?enrichment?analysis?were?performed?for?drug-disease?intersection?targets，?and?molecular?docking?validation?was?performed?using?AutoDock?Vina?and?other?software.?Results?320?CU?targets?and?382?drug?targets?were?obtained，?and?20?drug-disease?intersection?targets?were?selected;?The?protein-protein?interaction?networks?core?targets?obtained?by?PPI?topology?analysis?were?ADAMTS4，?FABP7，?SRM，?PDE5A，?SOD2，?etc.;?The?related?chemical?components?were?（2R）?-5，?7-dihydroxy-2-?（4-hydroxyphenyl），?ethyl?linoleate，?stigmasterol，?quercetin，?etc.;?Enriched?involving?lipids?and?atherosclerosis，?longevity?regulatory?signaling?pathway，?peroxisome?proliferator-activated?receptor?（PPAR）?signaling?pathway，?interleukin-17（IL-17）?signaling?pathway，?chemokine?signaling?pathway，?etc.;?Molecular?docking?between?9?chemical?components?and?5?core?targets?showed?that?40?groups?of?docking?had?binding?activity?（binding?energy<–4.25kcal/mol）.?Conclusion?Artemisia?argyi?has?a?mechanism?of?action?of?multiple?targets，?multiple?components，?and?multiple?pathways?on?CU，?and?the?credibility?of?the?results?of?this?analysis?is?verified?by?literature?search?and?molecular?docking，?which?can?provide?a?reference?basis?for?later?experimental?studies.

[Key?words]?Bioinformatics;?Molecular?docking;?Chronic?urticaria;?Mechanism?of?action

慢性蕁麻疹（chronic?urticaria，CU）是一種常見的皮膚過敏性疾病，臨床特征為反復發作的風團伴紅斑瘙癢[1]；其反復發作的劇烈瘙癢嚴重影響患者的生活質量，有時還可出現全身癥狀，包括關節痛、頭痛、疲勞、潮紅和胃腸道不適等[2]。CU的發病機制非常復雜，約3/4的患者找不到病因，目前認為可能是肥大細胞和嗜堿性粒細胞等被活化后所產生的一系列反應[3]。CU治療上以緩解癥狀為主，國內外指南均推薦使用二代H1抗組胺藥物作為一線藥物，但部分患者對該類藥物反應差且病情易反復[4]。越來越多的研究表明，中醫藥治療CU具有一定的優勢，中西醫協同治療可增強臨床療效、減少不良反應、降低復發率[5-7]。艾葉為我國傳統中藥材，富含多種生物活性成分，包括揮發油、甾萜類、有機酸、黃酮類和多糖等?，F代藥理研究表明，艾葉具有抗菌、抗炎、抗過敏、止血、鎮痛等藥理作用[8]。本研究運用生物信息學、分子對接等技術，分析艾葉治療CU的核心靶點、化學成分及作用通路。

1??資料與方法

1.1??挖掘GEO芯片獲取CU靶點

從基因表達數據庫（Gene?Expression?Omnibus，GEO）獲取GSE57178、GSE72540基因芯片數據集，選取其中12例健康人的皮膚組織樣本和16例CU患者的病變皮膚組織樣本，下載2個芯片的表達數據及GPL6244、GPL16699注釋文件。運用R軟件“sva”程序包消除2個數據集之間的批次效應，然后使用“limma”程序包進行差異分析，差異表達基因的篩選條件為|logFC|≥1、FDR<0.05。

1.2??收集艾葉的化學成分及作用靶點

檢索中藥系統藥理學數據庫（Traditional?Chinese?Medicine?Systems?Pharmacology?Database，TCMSP）獲取艾葉的化學成分，并根據口服生物利用度（oral?bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18進行篩選。通過PharmMapper數據庫預測各化學成分的潛在作用靶點，運用UniProt平臺匹配各靶點的GeneSymbol。

1.3??篩選共同靶點并構建蛋白質互作網絡核心網絡

運用R軟件的“venn”程序包繪制藥物–疾病靶點韋恩圖，并映射篩選出藥物–疾病交集靶點。將交集靶點提交至GENEMANIA平臺獲取蛋白質互作網絡（protein-protein?interaction?networks，PPI），通過Score值篩選出艾葉治療CU的核心靶點。

1.4??生物信息富集分析

將交集靶點導入R軟件，應用“ClusterProfiler”等程序包進行基因本體學（gene?ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genome，KEGG）富集分析，包括生物學進程（biological?process，BP）、細胞組分和分子功能（molecular?funtion，MF），對主要條目進行可視化。

1.5??分子對接驗證

選取核心靶點分別與化學成分進行分子對接驗證，共45組。將化學成分作為小分子配體、核心靶點作為蛋白受體，從TCMSP數據庫下載化學成分的MOL2文件，從蛋白質結構數據庫（Protein?Date?Bank，PDB）下載核心靶點的PDB文件，使用PyMOL軟件刪除水分子及配體，通過AutoDock?Vina軟件進行分子對接。

2??結果

2.1??收集藥物靶點和疾病靶點

通過TCMSP數據庫進行檢索、篩選，最終收集艾葉的9個化學成分并上傳至PharmMapper平臺獲得382個藥物靶點。對GSE57178、GSE72540兩個數據集進行差異分析，共鑒定出320個差異表達基因，其中在CU樣本中上調的基因256個、下調的基因64個。選取差異最顯著的40個基因繪制熱圖，構建藥物–疾病靶點韋恩圖，共篩選出20個交集靶點。

2.2??構建蛋白質互作網絡

將20個交集靶點上傳至GENEMANIA平臺構建PPI，該PPI包括20個預測靶點，下載該網絡的連接數據，通過Score值篩選出前5個靶點，分別為ADAMTS4、FABP7、SRM、PDE5A、SOD2，提示這些靶點可能在艾葉治療CU中發揮關鍵作用。

2.3??交集靶點富集分析

對20個交集靶點進行KEGG富集分析，結果顯示，富集出脂質和動脈粥樣硬化、長壽調節信號通路、過氧化物酶體增殖活化因子受體（peroxisome?proliferator-activated?receptor，PPAR）信號通路、白細胞介素（interleukin，IL）-17信號通路、趨化因子信號通路等，對主要條目進行繪圖，見圖1。

2.4??分子對接驗證

對45組主要化學成分–核心靶點進行分子對接驗證，一般認為結合能<–4.25kcal/mol則配體與靶點受體之間有結合活性，結合能<–5.0kcal/mol表明匹配活性較佳，結合能<–7.0kcal/mol提示具有強烈的對接活性[9]。分子對接結果見表1，45組分子對接平均結合能為–6.56kcal/mol，最低結合能為–3.1kcal/mol?[油酸乙酯（NF）-FABP7]，最高結合能為–9.7kcal/mol（槲皮素-ADAMTS4），45組中僅有5組無對接活性，其余均存在結合性，表明篩選出的靶點與化學成分間具有較好的匹配度。

3??討論

CU是常見的皮膚病之一，終身患病率較高。CU作為一種慢性疾病因反復發作導致治療較困難[10]。中醫藥治療CU療效確切，在常規使用脫敏藥的同時，配合中醫藥的特色療法，患者復發率低，病程縮短，作用迅速，成效顯著[11]。艾葉化學成分復雜，揮發油類是其主要活性成分?，F代藥理學研究表明，艾葉具有抗過敏、抗炎、抗氧化等多種作用。研究發現艾葉可抑制部分炎癥介質，如一氧化氮、前列腺素、活性氧、IL-6等，且抑制效果與劑量有關[12]。在抗過敏方面，艾葉能抑制由T細胞介導的遲發型變態反應，同時艾葉能促進小鼠脾臟細胞增殖，提高巨噬細胞吞噬功能，增加B細胞產生抗體能力及增強T淋巴細胞的增殖能力[13]。艾葉在抗氧化方面對羥基自由基、超氧陰離子自由基、黃嘌呤氧化酶等具有較好的抑制或清除效果[14]。侯其剛等[15]使用包含艾葉的中草藥治療蕁麻疹患者，其療效明顯優于單用西醫治療，表明艾葉對CU具有一定的治療效果，故本研究運用生物信息學等技術初步探索艾葉治療CU的作用機制。

研究發現艾葉可通過20個靶點干預CU，包括ADAMTS4、FABP7、SRM、PDE5A、SOD2、MMP1、MMP12、HCK、CA2、PIM1、PNP、HSPA8、DPP4、PLA2G2A、SELE、UAP1、RND3、S100A9、CD1A、FAP，部分靶點在CU病程或炎癥中起調節作用。如選擇蛋白E（selectin?E，SELE）是細胞黏附分子家族的相關基因，其編碼的蛋白E-選擇素是一種促炎因子，E-選擇素通過炎癥因子IL-1、脂多糖或腫瘤壞死因子-α（turmor?necrosis?factor-α，TNF-α）等介導中性粒細胞黏附血管上皮細胞，從而促進炎癥反應[16]。SELE的表達水平與蕁麻疹具有相關性，上調SELE可潛在促進肥大細胞釋放大量TNF-α、同源限制因子、IL-6和組胺，參與蕁麻疹的疾病發生和進程[17]。當SELE被沉默時，可通過抑制血管內皮細胞的細胞黏附能力抑制免疫接觸性蕁麻疹的發展[18]。

KEGG富集分析發現，艾葉對CU具有多方面的作用機制，涉及脂質和動脈粥樣硬化、長壽調節信號通路、PPAR信號通路、IL-17信號通路、趨化因子信號通路等。PPAR是PPAR信號通路中一類依賴轉錄調節因子的配體，PPAR-γ作為PPAR主要亞型之一，與多種炎癥細胞的活性和表達關系密切，具有改變巨噬細胞的轉運、增加巨噬細胞吞噬功能等作用，可促進免疫反應的發生，同時可通過不同炎癥途徑的干擾控制所涉及的基因表達，影響炎癥因子的產生和細胞募集，發揮抗炎作用[19-20]。研究發現，PPAR-γ可抑制多種皮膚病中的炎癥反應，如PPAR-γ在特應性皮炎中起負性調節作用，抑制T細胞增殖，減少促炎因子的產生，參與Th1、Th2細胞分化，從而發揮免疫調節作用，而Th1、Th2的功能失衡與CU的發病關系密切，因此推測PPAR信號通路可能在CU復雜的發病機制中發揮調控作用[21-22]。研究表明，細胞免疫失衡也在CU發病中發揮重要作用，Th17細胞可增強抗原對Th2細胞的誘導作用，進而促進Th2細胞介導的嗜酸性粒細胞的炎癥反應而參與過敏性疾病的發生。IL-17作為Th17細胞的核心因子，與部分炎癥和自身免疫疾病密切相關，可通過增強Th2反應在CU的發生、發展中發揮一定作用[23]。秦凱煒等[24]發現IL-17在CU患者中的表達水平明顯上調，且與病情嚴重程度呈正相關。研究證實IL-17是重度CU的潛在參與者和治療靶點[25]。趨化因子異常分泌、表達及分布可引起T、B淋巴細胞的異?；罨?，產生多種自身抗體，可能導致CU的發病。研究表明，趨化因子可參與包括過敏性哮喘等超敏反應，在超敏反應的各個環節均發揮重要作用，通過趨化和聚集嗜酸性粒細胞，調節以Th2細胞為主的免疫應答[26-27]。

篩選發現，艾葉中具有9種活性成分能發揮抗炎、免疫調節等多成分協同作用，如β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素[28-30]等。通過分子對接預測化學成分與核心靶點之間的結合力，也能從側面證實艾葉治療CU的可靠性，45組分子對接中有40組具有結合活性，有38組結合力較佳，有19組具有強烈的結合活性，其中（2R）-5，7-二羥基-2-（4-羥苯基）、槲皮素與核心靶點間的對接得分最高，具有重要的研究參考價值。

綜上所述，艾葉對CU具有多靶點、多成分、多途徑的作用機制，通過文獻檢索及分子對接驗證本次分析結果具有可信性，希望為后期進一步的實驗研究提供參考依據。

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