接種褐環乳牛肝菌對樟子松及油松根際土壤細菌群落的影響

包潤澤　張星　姚慶智*

摘要：［目的］探究褐環乳牛肝菌（Suillus luteus）對樟子松（Pinus sylvestris var.mongolica）和油松（P.tabulaeformis）根際土壤細菌群落結構的影響。［方法］利用Illumina MiSeq高通量測序技術，分析2種松樹的根際土壤在接種S.luteus與未接種處理下的細菌群落結構，同時結合土壤有機碳（C）、含水量（WC）、速效磷（P）和速效氮（N）進行相關研究。［結果］接種S.luteus后2種松樹根際土壤中的有機碳、含水量、速效磷和速效氮含量均大于對照組。綜合細菌Alpha多樣性指數及OTU-Venn發現，接種S.luteus后的樟子松和油松根際土壤細菌相對豐度與對照組存在顯著差異（P<0.05）。統計學分析顯示，接種S.luteus顯著影響了根際土壤細菌的豐富度，且有機質和物種數量、Shannon指數、ACE指數呈顯著正相關；此外，土壤含水量也與土壤細菌數量呈正相關關系。與對照組相比，接種S.luteus后根際土壤中變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度均顯著提高，優勢屬由原來的假節桿菌屬（Pseudarthrobacter）轉變為酸桿菌屬（bacterium RB41）。接種S.luteus后土壤細菌豐度上升的屬與其所對應的pH均呈負相關，表明樟子松和油松的生長喜好更偏向酸性環境。［結論］接種S.luteus不僅影響了根際土壤細菌群落結構，且有效改善土壤中養分的供應能力，為后續研究樟子松和油松退化機理提供理論基礎。

關鍵詞：褐環乳牛肝菌；土壤細菌；樟子松；油松

中圖分類號Q939.96文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）06-0148-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.036

Effects of Inoculation with Suillus luteus on Rhizosphere Soil Bacterial Communities of Pinus sylvestris var.mongolica and P.tabulaeformis

BAO? Runze，ZHANG Xing，YAO Qingzhi

（College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia? 010018）

Abstract［Objective］To investigate the effect of inoculation with the Suillus luteus on the interrhizosphere soil bacterial community structure of Pinus sylvestris var.mongolica and P.tabulaeformis.［Method］Using Illumina MiSeq highthroughput sequencing technology，we compared the bacterial community structure of the interroot soil of two pine trees under inoculation with S.luteus and without inoculation treatment，and also correlated with soil organic carbon （C），water content （WC），available phosphorus （P），and available nitrogen （N）.［Result］The contents of organic carbon （C），water content （WC），available phosphorus （P），and available nitrogen （N） in the rhizosphere soil of the two pine trees after inoculation with S.luteus were higher than those of the uninoculated control.Inoculation of S.luteus significantly affected the abundance of rhizosphere soil bacteria.The organic matter in the rhizosphere soil of the two pines was significantly positively correlated with the number of bacterial species，Shannon index，and ACE index in the rhizosphere soil，and the soil water content was also positively correlated with the number of soil microorganisms.The relative abundances of Proteobacteria，Bacteroidetes，Firmicutes，and Verrucomicrobia were significantly increased in the rhizosphere soils of the two pines after inoculation with S.luteus.The dominant genus changed from Pseudarthrobacter to bacterium RB41.The genus of increased abundance after inoculation with S.luteus was negatively correlated with its corresponding pH value.［Conclusion］Inoculation with S.luteus not only affected the bacterial community structure of rhizosphere soil，but also effectively improved the nutrient supply capacity of soil，which provided a theoretical basis for the subsequent study of degradation mechanism of P.sylvestris and P.tabulaeformis.

Key wordsSuillus luteus;Soil bacteria;Pinus sylvestris var.mongolica;Pinus tabulaeformis

根際作為植物根系與土壤間進行能量和物質交換的直接界面，是微生物棲息的主要區域，被認為是地球上最活躍的界面之一［1-4］。近年來，根際微生物組有關能促進植物宿主營養吸收、病蟲害抵抗及脅迫適應的巨大潛力在相關研究中得到證實。根際微生物組內及與其他微生物組間的互作也影響微生物組的組裝［5］。微生物間互作方式包括營養依賴（nutritional interdependencies）、協助擴散（enhanced dispersal）及群體感應（quorum sensing）等類型。其中特定細菌以真菌菌絲作為媒介，即利用所謂的“真菌高速公路（fungal highway）”來提高其在土壤環境中的遷移速度，是微生物間協助擴散的典型形式［6-8］。這一互作策略在構建土壤微生物網絡中發揮重要作用。同時研究發現菌根輔助細菌（mycorrhiza helper bacteria，MHB）可以通過影響真菌菌絲的肌動蛋白細胞骨架進而導致菌絲形態的改變并提高菌絲延伸速度以達到提高侵染率的效果［9］。另外Kataoka等［10］利用5種外生菌根真菌（ectomycorrhizal fungi，EMF）對2種MHB的選擇性輔助效應進行研究，發現MHB具有真菌選擇性且作用機制存在差異。

隨著生態建設的逐步深入，常綠針葉樹種成為內蒙古地區造林、園林綠化的主要樹種，在生態建設和環境恢復中發揮重要作用。樟子松（P.sylvestris var.mongolica）、油松（P.tabulaeformis）屬深根性樹種，其適應性強，耐旱、耐寒、抗瘠薄，是我國特有樹種，也是內蒙古西部地區優良綠化樹種［11］，且在干旱及半干旱地區對水源涵養和水土保持的意義重大［12-13］，隨著苗木樹齡增長和環境因子影響，目前油松和樟子松人工林面臨林分環境變差、土壤肥力下降、林地生產力衰退等問題［14-15］，嚴重影響城市綠化觀賞價值和防護林的生態價值。

EMF在改善植物根際微環境及促進宿主植物生長等方面發揮重要作用［16］。因此，筆者以接種S.luteus 5年后的樟子松和油松根際土壤為研究對象，利用分子生物學技術研究接種EMF對針葉樹根際土壤細菌群落結構和多樣性的影響，旨在為保障樟子松林和油松林的健康生長提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗地概況

研究區域位于內蒙古呼和浩特市和林格爾縣，該地區地處陰山山脈，大青山南部（115°56′～115°60′E，42°25′～42°33′N），海拔為1 023～1 035 m。年平均降水量為410 mm，屬于半干旱地區。

1.2樣品的采集與處理

供試菌株Suillus luteus L22（GenBank登錄號：OL872261）由筆者所在實驗室前期分離自樟子松根系，菌株接種于PDA液體培養基培養20 d后制備成液體菌劑備用；供試苗木選自2012年內蒙古盛樂國際生態示范區苗圃，2年生的裸根苗，采用蘸根法接種S.luteus菌劑，共4種處理方式：接種S.luteus菌劑的樟子松bTZD；接種S.luteus菌劑的油松bTYD；不接種S.luteus菌劑的樟子松bTZM；不接種S.luteus菌劑的油松bTYM。于2017年5月上旬在每個處理樣地設計3個樣方（20 m×20 m），每個樣方中選取5棵樟子松和油松作為重復（胸徑為15 cm左右），每棵樟子松和油松選取3個方位，用無菌刷輕刷樣品根系，并收集根際土于無菌塑封袋，將每個樣方的5份根際土壤樣品均勻混合成1份樣品，最終得到12份土樣。新鮮土樣過10目鋼篩后立即貯藏于-80 ℃冰箱內備用，用于后續檢測。

1.3試驗方法

1.3.1土壤DNA的提取與高通量測序。土壤DNA提取和測序分析在諾禾致源公司Illumina MiSeq PE250平臺進行。

1.3.2土壤理化性質的測定。土壤含水量、有機質、速效氮和速效磷測定參考《土壤理化分析與剖面描述》［17］。

1.4數據分析

使用FLASH、Qiime及Mothur軟件對原始數據進行過濾得到有效序列?；赨parse在相似水平為97%的OTU進行聚類分析。用Mothur軟件分析樣品的Alpha多樣性。利用SPSS 20.0分析群落結構與環境因子的相關性，利用CANOCO 5.0分析環境因子對細菌群落的影響；利用Praphpad Prism 8對試驗數據進行可視化處理。

2結果與分析

2.1接種S.luteus對樟子松和油松根際土壤理化性質的影響

與未接種菌劑的樟子松和油松相比，bTYD、bTZD處理的根際土壤含水量、有機碳、速效磷、速效氮含量較高，此外，接種菌劑后的樟子松和油松根際土pH有所降低。表明S.luteus在樟子松和油松根際土壤的能量流動和養分循環中發揮了重要作用，同時也極大地促進了養分循環和關鍵元素的利用率（表1）。

2.2接種S.luteus對樟子松和油松根際土細菌群落的影響

不同處理下根際土壤細菌的分析（圖1）表明，4個樣品共獲得7 853個細菌OTU，bTYD、bTZD、bTZM和bTYM細菌特有OTU數分別為304、262、795和202，表明接種后的油松根際土特有細菌OTU數大于對照組，而接種前的樟子松特有細菌OTU數遠大于接種后，說明接種菌劑前后的細菌豐度有較大差異。

2.3Alpha多樣性

對4種處理下的根際土壤樣品進行了

16S rDNA多樣性分析，各土樣的細菌Coverage指數均高達

98%以上，說明該研究樣品文庫測序數據量合理，可以反映樣本中微生物的真實情況。對照組的Simpson指數無顯著變化（P>0.05）。從圖2可以看出，有機質和物種數量、Shannon指數和ACE指數呈顯著正相關（P<0.05），根際土壤含水量也與土壤微生物數量呈正相關關系。表明接種S.luteus顯著影響了根際土壤細菌的豐富度（P<0.05）。

2.4土壤細菌群落結構分析

在門分類水平上，與對照組相比，bTYD、bTZD處理組根際土壤中擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度均顯著增加（P<0.05）；而絲狀菌門（Actinomycota）、酸桿菌門（Acidobacteria）、古細菌門（Archaea）、綠彎菌門（Chloroflexi）和浮霉菌門（Planctomycetes）的相對豐度顯明顯降低（P<0.05）（圖3）。

在屬水平上，在bTYD、bTZD處理組中，孢菌屬（Sphingomonas）、擬桿菌屬（Bacteroides）、貪噬菌屬（Variovorax）、地桿菌屬（Pedobacter）、假單孢菌屬（Pseudomonas）、單孢菌屬（Terrimonas）、馬賽菌屬（Massilia）、溶桿菌屬（Lysobacter）、根瘤菌屬（Rhizobium）的相對豐度顯著增大，而亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、隱蓋氏菌屬（Gaiella）和微枝形桿菌屬（Microvirga）的相對豐度明顯降低。此外，水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）只有在bTZD處理組的根際土壤樣品中被檢測到，相對豐度為0.69%。瘤胃球菌（Ruminococcaceae UCG-005）只在bTYD處理組的根際土壤樣品中被檢測到，相對豐度為0.36%（圖4）。

2.5bTYD、bTZD主要屬與理化性質相關性

總體來看，接種后的油松根際土壤細菌群落中，G55、Bacillu、Streptomyces、RB41、Microvirga和Solirubrobacter與含水量（WC）、速效磷（AP）、有機質（SOC）、速效氮（AN）呈正相關，其中RB41與AP、Solirubrobacter和SOC及AN之間呈極顯著關系（P<0.01）（圖5）。而Pseudomonas、Lysobacter、Ramlibacter和Teeeimonas的豐度在接種S.luteus后呈下降趨勢。此外，豐度上升的屬與pH呈負相關。

由圖6可知，Steroidobacter、Mesorhizobium、Tardiphaga、Rhizomicrobium、Aquicella、Pseudohongiella、Hirschia、Terrimonas、Niastella與SOC、WC、AN和AP呈顯著正相關（P<0.01）。而unidentified Planctomycetaceae在處理組bTYD、bTZD中的豐度呈下降趨勢。豐度上升的屬與pH呈負相關，綜合以上結果猜測樟子松可能更適應在酸性環境下生長。

2.6環境因素相關分析（RDA分析）

物種多樣性指數與土壤理化因子的RDA（redundancy analysis）分析結果顯示，軸1（RDA1）和軸2（RDA2）對土壤細菌豐度與土壤理化因子關系的累計解釋量為64.05%，能真實有效地反映土壤細菌群落和5個土壤理化因子的梯度變化。由圖7可知，64.05%的群落結構信息可由這5個環境因子解釋，土壤理化因子對細菌群落變異的解釋率分別為77%、79%、77%、33%、14%，其中pH、WC、SOC的解釋率為極顯著（P<0.01），可見pH、有機質和土壤含水量是影響物種多樣性指數變化的主要因子。此外，與bTYD、bTZD處理組根際土壤細菌群落結構組成高度相關的環境因子是AP，且為正相關。結果表明主要環境因素影響了微生物群落結構。

3討論

土壤速效養分能夠很好地反映土壤養分的存在狀況。該研究結果表明，接種S.luteus能夠提高速效養分在土壤中的積累，樟子松和油松根際土壤中速效氮較對照分別增加了54.76%和54.40%，速效磷較對照分別增加了58.49%和55.56%，土壤中速效氮、速效磷與土壤肥力的相關性較大，同時在保障植株正常生長發育方面起到重要作用。速效氮、速效磷含量顯著提升是因為EMF能夠直接或間接地活化土壤中的固定養分，促進土壤中難溶性磷、鉀的溶解和釋放，促進土壤中營養元素轉化為植物可吸收的形態，從而顯著提高了速效氮和速效磷的含量，提高了土壤速效養分的供應能力，改善了土壤中養分的供應狀況，增加土壤肥力。且S.luteus還能產生植物激素類物質，刺激和調節作物生長，能激發土壤中固定的鈣、鋅等微量元素，使植物生長健壯，營養狀況得到改善［18］。與此同時，速效磷還與樟子松和油松根際土壤細菌結構具有相關性，這可能是由于大部分解磷細菌為EMF的相關輔助細菌，接種S.luteus后其與土壤中的解磷菌互利共生，在提高解磷能力的同時也對土壤細菌群落產生了影響［19］。在后續研究中，可重點關注微生物網絡互作，進一步對外生菌根的促生機理開展深入探究。

植物根際進行大量的物質交換和能量交換，而根際微生物多樣性也與土壤肥力有顯著相關性，所以根際土壤微生物群落結構和豐度是檢測土壤健康及質量變化的關鍵指標［20-21］。所以研究不同促生菌接種條件下，植物根際土壤微生物數量的變化規律，對于探索植物對土壤的作用過程和促生機理具有重要作用［22］。Deng等［23］研究發現施加微生物菌劑會顯著影響微生物數量及群落結構，這與該試驗的結果相一致，可能是接種S.luteus后其次級代謝產物對一部分細菌的生長產生了抑制作用。Chao1指數和Shannon指數是分析和說明微生物多樣性的關鍵指數，可以反映樣本微生物的群落結構差異。在該試驗中，接種S.luteus處理與根際細菌豐富度和多樣性呈正相關關系，這在一定程度上反映出接種S.luteus菌劑使得樟子松根際土壤細菌群落結構穩定性提高。土壤微生物中以細菌體量最大，種類豐富，所以生物量也高；bTYD、bTZD處理組根際土壤細菌多樣性提高，同時土壤關鍵營養元素含量升高，表明根際土壤肥力提升，其原因可能是一些植物促生菌影響了植物根系原本的代謝狀態，導致根際微環境發生改變，最終使得根際微生物群落結構發生改變。在變化過程中，根際土壤細菌群落結構發生變化，同時優勢菌群相對穩定。由此可知，促生菌在植物定殖后，可以在保證微生物群落健康穩定的情況下發生改變，進而改善土壤環境微生態和土壤肥力。此外，接種S.luteus對樟子松、油松根際微生物的影響中，變形菌門微生物反應較為敏感，而土傳致病菌的重要組成部分為變形菌門，因此推測褐環乳牛肝菌有拮抗病原菌的能力［24］。

4結論

與對照組相比，接種S.luteus后根際土壤中Proteobacteria、Verrucomicrobia、Firmicutes和Bacteroidetes的相對豐度均顯著提高，優勢屬由原來的Pseudarthrobacter轉變為bacterium RB41。土壤中的速效養分含量提高；并發現有機質和物種數量、Shannon指數、ACE指數呈顯著正相關。該試驗結果表明EMF對供試苗木的根際土壤細菌種群的多樣性和種群結構產生了影響，具體表現為一些細菌種類的增多、減少和數量上的豐富，而發生變化的細菌種類還有待進一步確定。該研究為提高人工林生態系統的穩定性，維持樟子松、油松人工林健康、穩定和可持續發展提供新思路。

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基金項目內蒙古自然科學基金項目（2020MS03044）；內蒙古自治區科技計劃項目（2019GG002）；內蒙古農業大學生命科學學院創新團隊項目（TD202103）。

作者簡介包潤澤（1998—），男，內蒙古通遼人，碩士研究生，研究方向：應用與環境微生物學。*通信作者，教授，博士，碩士生導師，從事林業土壤微生物學研究。

收稿日期2022-02-27