幾種藥食兩用類物質對酒精性胃黏膜損傷的保護及其抑制幽門螺旋桿菌作用

王雨陽　楊焱　吳迪　李文　陳萬超　張忠

摘要：通過體外抑制幽門螺旋桿菌和抗炎試驗，考察了猴頭菌、茯苓、甘草、黃芪、葛根、蒲公英、陳皮幾種藥食兩用類物質的提取物對幽門螺旋桿菌的抑制作用以及緩解炎癥的效果，結果表明：黃芪提取物、甘草提取物具有良好的體外抑制幽門螺旋桿菌的作用；葛根提取物、甘草提取物具有較好的緩解炎癥的效果。通過構建人胃黏膜上皮細胞GES-1損傷模型，明確了猴頭菌和茯苓的提取物對酒精損傷的人胃黏膜上皮細胞GES-1增殖具有促進作用。根據試驗結果，篩選出猴頭菌、茯苓、黃芪和甘草4種藥食兩用物質的提取物，將其按照一定比例混合，制成3種組方，考察其對大鼠急性酒精性胃黏膜損傷的保護作用，結果表明：3種組方對胃黏膜損傷均具有一定的保護作用，組方2（猴頭菌43.0%、茯苓35.5%、黃芪15.9%、甘草5.6%）在0.375 g/kg時對大鼠急性酒精性胃黏膜損傷具有更好的保護作用。

關鍵詞：藥食兩用；胃黏膜損傷；幽門螺旋桿菌；抑菌；抗炎

中圖分類號R285文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）06-0157-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.038

Protective Effects of Several Dualpurpose Substances on Alcoholic Gastric Mucosal Injury and Inhibition of Helicobacter pylori

WANG Yuyang1，2，YANG Yan1，WU Di1 et al

（1.Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization （South）/Ministry of Agriculture，National Engineering Research Center of Edible Fungi/Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai??? 201403;2.College of Food Sciences & Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai? 201306）

AbstractIn vitro inhibition of Helicobacter pylori and antiinflammatory experiments were conducted to investigate the inhibitory effects and relief of Hericium erinaceus，Wolfiporia cocos，Glycyrrhiza uralensic，Astragalus membrahaceus，Pueraria lobata，Taraxacum mongolicum，tangerine peel and other medicinal and edible substances on Helicobacter pylori.The results show that Astragalus membranceus extract and Glycyrrhiza uralensic extract had a good effect of inhibiting Helicobacter pylori in vitro;Pueraria lobata extract and Glycyrhiza uralensis extract have a good effect of relieving inflammation.By constructing a GES1 injury model of human gastric mucosal epithelial cells，it is clear that the extracts of Hericium erinaceus and wolfiporia cocos can promote the proliferation of human gastric mucosal epithelial cells GES1 damaged by ethanol.According to the experimental results，four medicinal and edible extracts of Hericium erinaceus，Wolfiporia cocos，Astragalus membranaceus and Glycyrrhiza uralensic were screened out，and they were mixed according to a certain ratio to make 3 kinds of prescriptions to investigate their effects on the acute alcoholic gastric mucosa of rats.Tthe results show that the three prescriptions have a certain protective effect on gastric mucosal injury，and the prescription 2 （Hericium erinaceus 3.0%，Wolfiporia cocos 35.5%，Astragalus membranaceus 15.9%，Glycyrrhiza uralensic 5.6%） is 0.375 g/kg It has a better protective effect on acute alcoholic gastric mucosal injury in rats.

Key wordsMedicine and food;Gastric mucosal injury;Helicobacter pylori;Antibacterial;Antiinflammatory

近年來，隨著人們生活節奏的加快，過度飲酒、刺激性食物等外源性損傷因素引起的胃損傷逐漸增多，特別是飲酒引起的急性胃黏膜損傷病變臨床日益常見［1］。人們飲酒后，高濃度酒精在胃內滯留，侵蝕胃黏膜組織，使胃黏膜屏障受損，直接引起胃黏膜急性炎癥，黏膜出現充血、水腫、出血、糜爛及潰瘍形成等癥狀［2］。隨著飲酒人數的增加，酒精性胃黏膜損傷相關疾病的發病率呈逐年上升趨勢［3］。幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori） 是一種革蘭氏陰性微需氧桿菌，也是胃黏膜損傷、慢性胃炎和胃十二指腸潰瘍發生的主要因素之一［4］?，F有臨床治療胃黏膜損傷的藥物還存在一些弊端，如副作用大、易復發和需長期使用等［5］。因此，從營養預防的角度出發，尋找安全、有效、能保護胃黏膜免受損傷的有效產品，具有重要的實際應用價值。

在胃黏膜保護方面，已有研究表明，猴頭菌、茯苓、黃芪和陳皮等藥食兩用類物質對胃黏膜損傷具有一定的保護作用［6-11］。楊行堂等［12-14］研究發現，甘草、葛根和蒲公英具有預防幽門螺旋桿菌感染及降低胃癌發病危險性的作用。Raish等［15］研究發現，苦瓜多糖可以通過抗炎作用機制對胃黏膜損傷起保護作用，這一機制與炎性細胞因子介導的抗氧化能力有關。關于利用猴頭菌和茯苓、黃芪、甘草等組方進行胃黏膜損傷方面的研究鮮見報道，因此，筆者通過體外抗炎，抗幽門螺旋桿菌和酒精損傷的人胃黏膜上皮細胞GES-1增殖模型，探討猴頭菌等幾種藥食兩用類物質潛在的胃黏膜損傷修復活性，篩選出幾種藥食兩用類物質制成組方，建立無水乙醇誘導的大鼠胃黏膜損傷模型，探討組方對大鼠胃黏膜損傷的保護作用，為胃黏膜損傷類疾病的防治提供理論和試驗依據，也為猴頭菌、茯苓等藥食兩用類物質應用于胃黏膜保護類功能食品的開發利用提供科學依據。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

細菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）、Alamar Blue? 美國Sigma公司；DMEM 培養基、RPMI1640培養基、胎牛血清，美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素，美國Amersco公司；葡萄糖、氯化鈉、磷酸等，國藥集團藥業股份有限公司； 腦心浸液粉、哥倫比亞瓊脂，上海信裕生物科技有限公司；脫纖維羊血，上海源葉生物科技有限公司。AL104 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；水套式三氣培養箱，美國Thermo Fisher Scientific 公司；JJ-CJ-2FD 金凈潔凈操作臺，吳江市凈化設備總廠；Synergy HT96 孔板酶標儀，美國Bio-Tek公司。

1.2供試細胞與菌株

RAW264.7細胞株（小鼠巨噬細胞株）購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。用含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的DMEM培養基，在37 ℃ 5% CO2條件下培養，取對數生長期細胞，用無色RPMI1640培養基將細胞稀釋到5×105個/mL。

幽門螺旋桿菌標準菌株Helicobacter pylori。ATCC43504和臨床標準菌株Helicobacter pylori SS1 購自廣東省微生物菌種保藏中心。幽門螺旋桿菌培養基：腦心浸液粉9.6 g、哥倫比亞瓊脂23.4 g、蒸餾水780 mL，121 ℃高壓滅菌20 min后降至46 ℃后加入33～40 mL去纖維羊血。腦心浸液肉湯：蛋白胨10.0 g、腦心浸液粉17.5 g、氯化鈉5.0 g、葡萄糖2.0 g、磷酸氫二鈉2.5 g、蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min，備用。

1.3樣品制備

稱取猴頭菌、茯苓、黃芪、蒲公英、陳皮、甘草、葛根，分別按照重量比加10倍的蒸餾水浸泡0.5 h后，用文火煎煮1.0 h，倒出藥液，藥渣再加等量蒸餾水煎煮1.0 h，2次藥液合并，8 000 r/min離心15 min，倒出上清液，蒸發濃縮后凍干。將凍干后的各類藥液破碎成粉即為提取物。

精確稱取猴頭菌、茯苓、黃芪、蒲公英、陳皮、甘草、葛根提取物各50 mg溶于5 mL蒸餾水中，沸水浴30 min，冷卻至室溫，13 000 r/min離心15 min，過0.22 μm濾膜備用。

1.4不同提取物抑制幽門螺旋桿菌的活性試驗

1.4.1幽門螺旋桿菌菌懸液制備。

將保存的菌株活化后轉接到培養基上，37? ℃、10% CO2，5% O2孵育72 h。用腦心浸液肉湯洗下菌落，收集菌液。以腦心浸液肉湯校正菌懸液濃度，測量抑菌圈所用菌懸液濃度約2×108 CFU/mL，測定最小抑制濃度用1×108 CFU/mL菌懸液。

1.4.2抑菌圈的測定。

采用牛津杯法對抑菌圈進行測定。取直徑9 cm，培養基厚度約4 mm的羊血培養基的平板，每塊平板加入約100? μL 幽門螺旋桿菌ATCC43504/SS1的菌懸液，立即用涂布棒涂布均勻。然后，每個培養皿放置4個牛津杯，呈均勻分布。往每個杯中加入100 μL不同的樣品溶液。37? ℃，10% CO2，5% O2培養5? d，觀察抑菌圈，測量其直徑，每個樣品重復3次。

1.4.3最小抑菌濃度的測定方法。

采用96孔板法測定最小抑菌濃度。配置樣品濃度梯度為10.000 000、5.000 000、2.500 000、1.250 000、0.625 000、0.312 500、0.156 250和0.078 125 mg/mL。依次加入96孔板中，每個樣品3組平行。趁熱加入羊血培養基，混合均勻。待培養基凝固后，每個孔中加入10? μL ATCC43504或者SS1的菌懸液。37 ℃，10% CO2，5% O2培養5 d。觀察細菌狀態，確定最小抑菌濃度［16］。

1.5不同提取物對LPS刺激巨噬細胞RAW264.7釋放NO的影響

1.5.1

Griess試劑的配制。在燒杯中加入6.25 mL H3PO4，加入蒸餾水250 mL，分別加入2.50 g sulfanilamide和0.25 g naphthylethyylenedia mine dihydrochloride，用磁力攪拌器攪拌至全部溶解，4? ℃避光保存。

1.5.2樣品的配制。將樣品分別用PBS配制成5.0、2.0、0.5 mg/mL 待測樣品。

1.5.3標準曲線的繪制。配成不同濃度的亞硝酸鈉溶液，濃度梯度為0、5、10、15、20、25、30、35、40 μmol/L共9個，取100 μL 于96孔板，加入50 μL Griess試劑，反應10 min，測定543 nm吸光值，每個濃度3個平行，根據吸光值繪制標準曲線。

1.5.4對LPS刺激巨噬細胞RAW264.7釋放NO的影響。計算細胞個數，將RAW264.7用無色1640培養液稀釋成5×105個/mL 的細胞懸液，每組160 μL于96孔板中，37? ℃培養4～6 h至細胞完全貼壁后，樣品組加入20 μL LPS（作用濃度10 μg/mL）和20 μL待測液（作用濃度50、200、500 μg/mL）。LPS組每孔加入20 μL LPS和20 μL PBS，PBS組每孔加入40 μL PBS，37? ℃培養48 h后吸取上清液100 μL加入50 μL Griess試劑，反應10 min，酶標儀測定吸光值，根據標準曲線計算NO釋放量［17-19］。

1.6不同提取物對胃黏膜上皮細胞GES-1的損傷修復研究

1.6.1細胞毒性試驗。

將人胃黏膜上皮細胞GES-1用無色1640培養液稀釋成1×105個/mL的細胞懸液，每組160 μL于96孔板中，37 ℃培養細胞12 h，分別加入上述配制的不同濃度待測樣品液20 μL，37 ℃培養24 h后，每孔加入20? μL Alamar Blue試劑繼續培養，以Alamar Blue法測定所選作用濃度范圍內不同樣品對GES-1細胞活力的影響，每個樣品設置3個重復。

1.6.2乙醇處理及細胞損傷模型的構建。

將處于對數生長期的GES-1細胞以1×105個/mL的密度培養12 h。加入不同濃度的樣品（作用濃度分別為50、200、500 μg/mL）預保護24 h，然后去除培養液，使用5%乙醇損傷GES-1細胞6 h。對照組細胞用相同的培養液處理，但不加乙醇。每孔加入20 μL Alamar Blue試劑繼續培養，以Alamar Blue法測定所選作用濃度范圍內不同樣品對GES-1細胞活力的影響，每個樣品設置3個重復。將樣品組與對照組和模型組進行比較。所有結果均以GES-1細胞增殖抑制率表示。

1.7不同提取物組方對乙醇損傷的大鼠胃潰瘍的抑制作用研究

1.7.1動物模型建立及試驗分組。

根據以上試驗結果，將猴頭菌提取物、茯苓提取物、黃芪提取物和甘草提取物按照藥典和相關保健產品的要求，以一定比例均勻混合制成3種組方（表1）。

通過急性乙醇誘導胃黏膜損傷模型評價其預保護作用。將SD大鼠隨機分為11組（n=10）。胃潰瘍模型（模型組）和正常對照組（對照組）給予生理鹽水（0.9%），其余組分別給予組方1、組方2和組方3，各組方分為低劑量（0.188 g/kg）、中劑量（0.375 g/kg）和高劑量（0.75 g/kg），分別對應于L組、M組和H組。生理鹽水和樣品均通過灌胃給藥，每天2? mL，持續14 d。用不同濃度的組方1、組方2和組方3灌胃預保護14 d后，除對照組大鼠外，其余大鼠在最后一次給藥前禁食并自由飲用自來水24 h，然后每只大鼠給予1.0 mL無水乙醇誘導胃潰瘍。1 h后，將大鼠頸椎脫臼處死，取出胃。每組大鼠的胃隨機分為2個亞組。一個亞組中的樣品立即用5 mL 10%磷酸鹽緩沖福爾馬林（pH 7.0）填充，并浸沒在相同的溶液中30 min，用于組織學研究［20-23］。

1.7.2胃潰瘍評價。大鼠胃沿大彎切開，用生理鹽水清洗，仔細觀察胃黏膜層潰瘍的發生情況。同時記錄出血斑數，用游標卡尺測量潰瘍條紋的長度和寬度。潰瘍程度宏觀評價得分按中國食品藥品監督管理局標準（CFDA出版物第107號，2012年修訂）計算：

潰瘍抑制率=（損傷組潰瘍面積-給藥組潰瘍面積）/損傷組潰瘍面積×100%

2結果與分析

2.1不同提取物抑制幽門螺旋桿菌的活性差異

2.1.1抑菌圈的測定。

以幽門螺旋桿菌ATCC43504和SS1為試驗菌株，測定各提取物溶液抑菌圈直徑大小，結果見表2。由表2可知，黃芪提取物、甘草提取物的抑菌圈直徑均大于10.00 mm，對幽門螺旋桿菌ATCC43504和SS1抑菌作用強，說明黃芪提取物和甘草提取物具有較強的抗幽門螺旋桿菌活性。對ATCC43504而言，蒲公英提取物、陳皮提取物、葛根提取物抑菌圈均為9.00 mm，抗菌活性弱；對SS1而言，陳皮提取物、葛根提取物的抑菌圈大于10.00 mm，表現出一定的抗菌活性。

2.1.2最小抑制濃度的測定。

由表3可知，甘草提取物對幽門螺旋桿菌的抑制濃度最小，為1.25～2.50 mg/mL，抑菌作用強；葛根提取物對幽門螺旋桿菌的抑制濃度較小，為2.50～5.00 mg/mL，抑菌作用較強。黃芪提取物、蒲公英提取物、陳皮提取物對ATCC43504和SS1最小抑制濃度均大于5.00 mg/mL，抑菌活性弱。

2.2不同提取物的體外抗炎活性分析

通過典型的Greiss法檢測不同濃度提取物對LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應模型中降低NO釋放量的效果，結果如圖1所示。從圖1可見，RAW264.7細胞經過LPS刺激后，NO含量相對于對照組（PBS）明顯升高。黃芪提取物、蒲公英提取物、陳皮提取物、甘草提取物在低濃度時抗炎效果不明顯，濃度達到500 μg/mL 時甘草提取物、葛根提取物表現出較強的抗炎活性，其中葛根提取物緩解炎癥的效果最好。

2.3不同提取物對胃黏膜上皮細胞的損傷修復分析分別考察了不同樣品的作用濃度（50、200、500 μg/mL）對GES-1細胞活力的影響，結果如圖2所示。從圖2可見，在設置濃度范圍內，細胞的增

殖率均在50%附近，表現出明顯的促進細胞生長的作用。猴頭菌提取物對細胞增殖的促進作用具有濃度依賴性，隨濃度的增大效果越好；茯苓提取物在200 μg/mL時的增殖率低于50和500 μg/mL，其中500 μg/mL時增殖率最高。

2.4不同提取物對酒精損傷大鼠胃潰瘍的抑制作用為觀察各組方的胃保護作用，對胃黏膜病變進行了顯微觀察。如圖3所示，對照組未見病變條帶，模型組大鼠胃黏膜有明顯的充血或壞死。與模型組相比，各組方處理組胃黏膜損傷明顯減輕。

潰瘍抑制率如圖4所示，結果表明，組方1在低濃度和高濃度時對胃黏膜上皮細胞的保護作用不明顯。組方2和組方3在低濃度和高濃度時也具有較好的保護作用，各組方均在中濃度時（0.375 g/kg）時抑制效果最好，均能明顯保護胃黏膜上皮細胞，抑制胃潰瘍的形成，其中，組方2對大鼠胃潰瘍抑制率最為明顯。

為檢測胃組織的病理狀態，采用HE染色和組織學評分法觀察胃組織的組織學變化。胃黏膜組織HE染色結果顯示（圖5），對照組胃黏膜組織結構完整，無上皮細胞脫落壞死，未見明顯炎性細胞浸潤。模型組胃黏膜組織腺體結構紊亂，上皮細胞脫落嚴重，可見多處壞死灶，

伴有廣泛的血細胞浸潤，且炎癥細胞浸潤明顯。組方1～3預處理后，上述癥狀均有不同程度的緩解。病理切片結果表明，組方1～3具有保護胃黏

膜上皮免受酒精損傷和預防潰瘍的作用。值得注意的是組方2中0.375 g/kg組胃黏膜基本光滑，未見明顯的腺結構紊亂，黏膜充血、炎癥細胞浸潤。組織病理評分結果如圖 6所示，組方3對胃黏膜具有顯著的劑量依賴性保護作用，高濃度時，病理評分較低，說明組方3可能通過降低炎癥反應起到胃黏膜保護作用。

3討論

胃黏膜類疾病，包括消化性潰瘍、急慢性胃炎等，是臨床常見及多發疾病。隨著現代社會生活節奏的加快，該病的發與工作壓力過大、創傷、幽門螺旋桿菌感染、大量飲酒、胃酸分泌過多等多種因素引起的胃黏膜防御與攻擊因素平衡的破壞密切相關［24-25］。急性胃黏膜損傷病變的機制比較復雜，包括乙醇、細菌等侵襲因素對胃黏膜的直接損傷、促進炎癥介質的釋放、誘導細胞凋亡等，目前認為炎癥是胃黏膜抵御內源性和外源性損傷因子的重要病理過程，炎癥損害可以導致胃黏膜的損傷和修復過程的受損［26-28］。

該研究首先通過幽門螺旋桿菌抑菌試驗考察了幾種藥食兩用類物質的提取物對幽門螺旋桿菌的抑制作用，結果表明，黃芪、甘草提取物具有良好的抑菌作用，如果作為胃黏膜損傷修復類產品，能抑制細菌的生長，防止細胞滋生，從而在胃黏膜恢復的過程中減少細菌損害；通過體外抗炎試驗，發現葛根、甘草提取物具有較好的緩解炎癥的效果。通過構建乙醇處理的胃黏膜上皮細胞GES-1的損傷修復模型，明確了猴頭菌、茯苓提取物對損傷的胃上皮細胞增殖具有促進作用［29-30］。篩選出猴頭菌、茯苓、黃芪和甘草提取物按照一定比例混合，制成3種組方，利用體內動物試驗考察其對急性胃黏膜損傷的修復作用，結果表明組方2（猴頭菇43.0%、茯苓35.5%、黃芪15.9%、甘草5.6%）在0.375 g/kg時對胃急性胃黏膜損傷的修復效果最好。

綜上所述，筆者利用體外抗幽門螺旋桿菌和抗炎活性試驗及體外胃黏膜上皮細胞GES-1的損傷修復試驗，以及大鼠體內胃黏膜損傷試驗評估了不同藥食兩用類物質提取物組成的組方的胃黏膜損傷保護作用，該研究結果可為開發具有胃黏膜損傷保護作用的功能食品、保健食品及藥品提供科學的理論依據和參考價值。

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作者簡介王雨陽（1998—），男，江蘇連云港人，碩士研究生，研究方向：食藥用菌的功能營養。*通信作者，副研究員，碩士，從事食藥用菌的研究與開發。

收稿日期2022-02-20