苦蕎蛋白水解物對腐乳理化品質及生物胺形成的影響

黃雁冰　孟凡冰　李云成　周闖　尹禮國　劉達玉

摘要：［目的］提高腐乳的品質及安全性。［方法］通過向腐乳發酵后熟過程中添加3%苦蕎蛋白水解物，探究其對腐乳理化品質和生物胺的影響。［結果］3%苦蕎蛋白水解物的添加對腐乳水分含量不會產生顯著影響，但當發酵進行到第60天，其總酸含量即可達到24.7 g/kg，接近相關行業標準的要求。0.3%苦蕎蛋白水解物的添加顯著提高了腐乳氨基酸態氮的含量，當發酵到90 d時，其氨基酸態氮含量達到13.7 g/kg，遠高于行業標準的規定，有效縮短了發酵周期。與對照組相比，3%苦蕎蛋白水解物的添加顯著降低了腐乳生物胺的生成，其總生物胺含量較對照組降低了22.92%。［結論］苦蕎蛋白水解物的添加，可以有效提高腐乳的理化品質和安全性。

關鍵詞：腐乳；苦蕎蛋白水解物；理化品質；生物胺

中圖分類號TS264.2+5文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）06-0163-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.039

Effect of Tartary Buckwheat Protein Hydrolysates on Physicochemical Properties and Biogenic Amines of Fermented Bean Curd

HUANG Yanbing，MENG Fanbing，LI Yuncheng et al

（College of Food and Biological Engineering，Chengdu University，Chengdu，Sichuan 610106）

Abstract［Objective］To improve the quality and safety of fermented bean curd.［Method］The effects of tartary buckwheat protein hydrolysates （BPH） on the physicochemical properties and biogenic amines of fermented bean curd were studied by adding 3% BPH to the post ripening process of fermented bean curd.［Result］The results showed that the addition of 3% BPH had no significant effects on the water content of fermented bean curd，but the total acid content could reach 24.7 g/kg when fermented to 60 d，which was closed to the requirements of relevant industry standards.At the same time，the addition of BPH significantly increased the content of amino acid nitrogen，and the content of amino acid nitrogen reached 13.7 g/kg after 90 d fermentation，which was much higher than that of industry standard，and the fermentation cycle was effective shorten.Compared with the control group，the BPH addition of group reduced the production of biogenic amine in fermented bean curd，and the total amine content decreased by 22.92% compared with the control group.［Conclusion］The above results indicated that the addition of BPH could effectively improve the physicochemical properties and safety of fermented bean curd.

Key wordsFermented bean curd;Tartary buckwheat protein hydrolysates;Physicochemical properties;Biogenic amines

腐乳是我國傳統的發酵豆制品，至今已有1 000多年歷史，為我國特有的發酵制品之一。腐乳是以大豆為主要原料，經過加工磨漿、制坯、培菌、發酵而制成的調味、佐餐食品［1-2］。豆腐發酵過程中霉菌產生蛋白酶、淀粉酶等酶系，將蛋白、淀粉等生物大分子分解成小分子化合物，促使豆腐坯中的淀粉轉化成乙醇和有機酸，還有輔料中的酒及香料也參與作用，共同生成了帶有香味的酯類及其他一些風味成分，從而構成腐乳所特有的風味，造就了腐乳具有鮮美的滋味、細膩的質地，且因為發酵過程中分解了豆類中的植酸，使得大豆中原本吸收率很低的鐵、鋅等礦物質也更容易被人體吸收，易于消化［3-4］。此外，經發酵的腐乳還富含生物、生理活性物質［5］，如內源性黃酮、皂苷以及發酵代謝產生的多肽等，賦予其一定的功能特性。隨著人們生活水平的提高和國民經濟的發展，人們對腐乳的質量要求越來越高，腐乳也正在向低鹽化、營養化、方便化、系列化等精加工方面發展。

在腐乳的自然發酵過程中，霉菌（特別是毛霉菌）、細菌（特別是乳酸菌）對腐乳品質起著至關重要的作用。傳統的腐乳制作方法是將豆腐培菌后加10%以上的食鹽，及五香料、辣椒粉、花椒粉等調味料進行腌制后熟［6］。高濃度的食鹽以及香辛料對后熟微生物代謝具有一定的抑制作用，因此傳統腐乳發酵時間較長。另外，這種抑制作用還會導致腐乳發酵優勢微生物生長緩慢，污染菌滋生，帶來食品安全風險。因此，如何快速促進腐乳發酵后熟優勢微生物的生長，以提高產品品質及安全性，是腐乳加工中需重點關注的問題。

利用外源添加營養基質或生物活性成分可大力提高微生物環境耐受性［7］。其中，植物蛋白水解物已被證明是改善微生物生長、發酵能力及環境耐受性的有效成分。植物蛋白水解物主要提供豐富的氮源如游離氨基酸，還可以提供一些具有促發酵功能的生物活性肽，從而促進釀造微生物的生長和代謝［8］。鑒于此，筆者探究了苦蕎蛋白水解物的添加對腐乳發酵品質的影響，旨在為改善腐乳釀造工藝提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑豆腐、食鹽、花椒、辣椒等調味料購自成都市十陵鎮好樂購超市。乙腈（HPLC級）購自美國ThermoFisher公司，丹磺酰氯（HPLC，≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司。其他試劑均購自成都市科龍化工試劑廠。

1.2儀器與設備

1260高效液相色譜儀，美國Angilent公司；BDS C18液相色譜柱（5 mm，250 mm×4.6 mm），美國ThermoFisher公司；GFL-125電熱鼓風干燥箱，天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；MJ-250-II型霉菌培養箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.3苦蕎蛋白水解物的制備

1.3.1苦蕎蛋白的提取。參照已建立的方法制備苦蕎蛋白水解液［7］，使用正己烷（1∶5，w/v）對經過100目篩過濾的苦蕎面粉進行脫脂，然后懸浮在蒸餾水中（1∶12，w/v）。使用1 mol/L NaOH將懸浮液調節至pH 11.0，然后在45 ℃下超聲提取1 h。將提取混合物在6 000 r/min下離心15 min。使用0.1 mol/L HCl將上清液調節至pH 4.5，并在6 000 r/min下離心15 min，以等電沉淀蛋白質［3］。

1.3.2苦蕎蛋白的酶解。將苦蕎蛋白粉溶解在蒸餾水中（1∶10），然后將pH調節至8.0。蛋白質溶液首先在80 ℃下預處理10 min。然后添加1%胰酶，在50 ℃下酶解24 h。所得漿液在8 500 r/min和4 ℃下離心15 min；將上清液真空冷凍干燥以獲得苦蕎蛋白水解物（BPH）［7］。

1.3.3腐乳的制備。

市場上購買同一批制作的含水量合適的新鮮豆腐坯，用無菌水清洗干凈，然后瀝干水分，再均勻切成小塊，最后均勻噴灑105 CFU/mL霉菌孢子懸浮液到處理好的豆腐上。取不銹鋼托盤清洗并消毒，鋪上經滅菌的雙層紗布。取出豆腐塊均勻擺放在托盤上，在28 ℃下培養3 d，制得毛坯。將毛坯浸酒后，在表面裹上輔料以及0.3%苦蕎蛋白水解物，然后裝入土陶壇中，在常溫下發酵90 d后即得腐乳成品。

1.4測定項目與方法

1.4.1理化指標的測定。

參照SB/T 10170—2007 《腐乳》［9］中的理化指標規定，主要考察腐乳的水分、總酸、氨基酸態氮、水溶性蛋白質指標。其中，水分含量采用直接烘干恒重法測定；總酸含量采用氫氧化鈉標準溶液滴定法，腐乳中含有多種有機酸，用氫氧化鈉標準溶液滴定，以酸度計測定終點，結果以乳酸表示；氨基酸態氮含量采用甲醛滴定法測定，利用氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定后定量，以酸度計測定終點。

1.4.2生物胺的測定。

利用高效液相色譜法（HPLC）檢測腐乳中常見的8種生物胺，生物胺提取方法參照李大偉等［10］的方法并進行修改。準確稱取2 g腐乳凍干粉，然后加入20 mL 0.1 mol/L HCl，用10 000 r/min均質分散器均質2 min（過程中每均質30 s停止5 s，再進行均質），然后4 °C 6 000 r/min離心20 min，取上清液1 mL，依次加入100 μL? 1 mol/L NaOH， 1 mL飽和NaHCO3，1 mL 10 mg/mL丹磺酰氯溶液，渦旋混勻1 min后置于60 ℃水浴鍋中水浴20 min，然后加入100 μL氨水，避光反應30 min后，用乙腈定容至5 mL，并用0.22 μm有機濾膜過濾，然后進行HPLC測定。

生物胺的HPLC測定方法參考GB 5009.208—2016《食品中生物胺的測定》［11］，紫外檢測波長254 nm，進樣量20 μL，柱溫35 ℃，流動相A為90%乙腈/10%含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液，流動相B為10%乙腈/90%含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液，流速0.8 mL/min。梯度洗脫程序：0～22.00 min，A∶B=60∶40；22.00～25.00 min，A∶B=85∶15；25.00～32.01 min，A∶B=100∶0；32.01～37.00 min，A∶B=60∶40。

2結果與討論

2.1苦蕎蛋白水解物添加對腐乳水分含量的影響

從圖1可以看出，由于腐乳發酵是在密閉壇中進行，因此隨著發酵的進行，腐乳中水分含量下降，但是降低幅度并不顯著。水分一方面是微生物生長的必備條件，同時也是腐乳口感的重要保證。如果水分含量過低，就會導致腐乳后感過硬。而腐乳水分含量過高，則不易成形且易被其他微生物污染。因此從發酵結果來看，0.3%苦蕎蛋白水解物的添加不會影響腐乳水分含量的變化。

2.2苦蕎蛋白水解物添加對腐乳總酸的影響

腐乳中的總酸主要來自前期霉菌分泌的蛋白酶、脂肪酶等酶類，作用于腐乳中的蛋白質、脂肪產生氨基酸、有機酸等，同時在腐乳發酵過程中微生物代謝也會產生有機酸等物質，因此發酵后總酸含量會升高［12］。由圖2可以看出，隨著發酵的進行，腐乳總酸整體呈升高趨勢，并且苦蕎蛋白水解物的添加有加速總酸產生的作用，特別當發酵進行到第30天時，苦蕎蛋白水解物添加組的總酸達到對照組的1.11倍。當發酵到第60天時，苦蕎蛋白水解物添加組和對照組總酸差距最大達到1.15倍?？偹峥梢云鸬秸{節腐乳口味，使之更加柔和的作用，對腐乳風味至關重要，但是如果總酸含量過高，會影響腐乳的保存，隨之出現酸腐味，因此根據行業標準SB/T 10170—2007規定，腐乳產品中的總酸不超過25.0 g/kg。根據結果可知，苦蕎蛋白水解物添加組發酵至90 d時，總酸含量達到25.8? g/kg，超過了行業標準限度，這可能是由于水解物中具有豐富的氨基酸和促發酵肽［7］，可以促進微生物的生長和代謝，加速了腐乳的成熟。故而根據總酸含量的要求，在添加苦蕎蛋白水解物發酵時，其發酵時間應控制在90 d以下，避免總酸含量超標。

2.3苦蕎蛋白水解物添加對腐乳氨基酸態氮的影響

腐乳鮮美的滋味是在后期發酵過程中，由毛霉或根霉等分泌的蛋白酶將豆腐中的蛋白質水解為多種氨基酸所形成的。因此，腐乳中的氨基酸態氮含量是腐乳質量綜合評定的重要評定指標，同時氨基酸態氮含量也是判斷腐乳發酵成熟的關鍵指標，其含量的高低可以代表原料中蛋白質被酶分解的程度［12］。氨基酸態氮越高，腐乳的鮮味越好［12-13］。從圖3可以看出，隨著發酵的進行，對照組中氨基酸態氮逐漸升高，當發酵進行到60 d后，氨基酸態氮趨于平緩。而0.3%苦蕎蛋白水解物添加組中的氨基酸態氮顯著高于對照組，當發酵到90 d時，其氨基酸態氮含量為13.7 g/kg，遠遠高于行業標準SB/T 10170—2007中對氨基酸態氮的規定。

2.4苦蕎蛋白水解物添加對腐乳生物胺含量的影響

生物胺是一類有機含氮低分子化合物，主要由氨基酸的脫羧或醛酮的轉化產生［6，14］，是傳統發酵食品（如腐乳、醬油、豆醬等）中常見的一種物質。過量攝入生物胺對人體健康具有一定的危害作用［15］。因此，在發酵食品生產過程中，如何有效控制生物胺生成是研究者們關注的重點之一。由圖4可以看出，當發酵進行到第90天時，8種常見的生物胺均在對照組樣品中檢出，其中含量最高的是組胺和精胺，組胺含量達到101.70 mg/kg，精胺達到97.60 mg/kg，總生物胺含量達到411.89 mg/kg。對于0.3%苦蕎蛋白水解物添加組樣品，除亞精胺未檢出外，其他7種生物胺均被檢出。然而，0.3%苦蕎蛋白水解物添加組中的色胺、尸胺、組胺、精胺含量顯著低于對照組；對照組中的苯乙胺、腐胺、酪胺含量均低于0.3%苦蕎蛋白水解物添加組，但并不顯著。0.3%苦蕎蛋白水解物添加組的總生物胺含量為317.50 mg/kg，較對照組含量降低了22.92%。以上結果表明，0.3%苦蕎蛋白水解物的添加，可以有效阻止腐乳中生物胺的生成。這可能是由于苦蕎蛋白水解物促進了微生物代謝，一方面使微生物產生更少的生物胺，另一方面，據報道，某些微生物（如酵母、乳酸菌等）可以降解生物胺［16］，這也可能是添加苦蕎蛋白水解物促進微生物代謝而加速這些微生物降解生物胺。

3結論

通過研究添加苦蕎蛋白水解物對腐乳發酵的影響，結果表明，添加0.3%苦蕎蛋白水解物可有效促進腐乳在不到90 d的發酵時間使氨基酸態氮超過行業標準的要求，縮短了發酵時間，且通過分析腐乳水分含量及生物胺含量，發現添加苦蕎蛋白水解物對腐乳的水分含量沒有顯著影響，并顯著降低了生物胺的生成，提高了產品的品質和安全性。因此，在腐乳發酵后熟過程中添加3%苦蕎蛋白水解物，既能加快腐乳發酵時間，又能提高腐乳產品質量安全。

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基金項目四川省重點研發項目（2020YFG0379）；固態發酵資源利用四川省重點實驗室開放基金項目（2020GTJ001）。

作者簡介黃雁冰（1998—），女，四川雅安人，碩士研究生，研究方向：食品加工與安全。*通信作者，副教授，從事發酵調味品加工研究。

收稿日期2022-05-11；修回日期2022-07-05