哈茨木霉對商洛煙區植煙土壤細菌多樣性的影響

穆耀輝　任志超　李淑娥　張永峰　任天寶　張松濤　姬小明　王景　殷全玉　劉國順

摘要：探究哈茨木霉對植煙土壤細菌多樣性與群落結構的影響，為優化輪作煙草根際土壤的細菌群落結構、物種組成及土壤的可持續發展奠定了一定的基礎。采用大田試驗方法，設置CK（常規施肥）和T1（常規施肥+哈茨木霉菌劑7.5 kg/hm2）2個處理，通過高通量測序技術探究施用哈茨木霉對各處理土壤細菌多樣性、菌落結構及理化指標的影響。結果表明，哈茨木霉菌劑的施用降低了土壤細菌群落結構的α多樣性指數，與常規施肥相比，增加了放線菌門（11.06％）的豐度，減少了變形菌門（4.03％）、綠彎菌門（2.28％）及酸桿菌門（1.71％）的豐度，土壤全氮和速效鉀含量顯著提高，分別提高14.2％和37.1％。表明在植煙土壤中施加哈茨木霉菌肥可進一步優化植煙土壤細菌群落結構，提高土壤肥力。

關鍵詞：木霉；根際土壤；細菌群落；多樣性；土壤理化性質；高通量測序

中圖分類號S154.3文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）06-0152-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.037

Effects of Trichoderma harzianum on Bacterial Diversity in Tobacco Growing Soil in Shangluo Tobacco Area

MU Yaohui1，REN Zhichao2，LI Shue1? et al

（1.Shangluo Company of Shaanxi Tobacco Company，Shangluo，Shaanxi? 726000;2.Tobacco College of Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan? 450000）

AbstractThe effects of Trichoderma harzianum on bacterial diversity and community structure in tobaccoplanting soil were studied，which laid a foundation for optimizing the bacterial community structure，species composition and sustainable development of soil in tobacco rhizosphere soil.A field experiment was conducted to investigate the effects of Trichoderma harzianum on soil bacterial diversity，colony structure and physical and chemical indexes by using highthroughput sequencing technology in CK （conventional fertilization） and T1 （conventional fertilization+Trichoderma harzianum 7.5 kg/hm2）.The application of Trichoderma harzianum decreased the α diversity index of soil bacterial community structure.Compared with conventional fertilization，Trichoderma harzianum increased the abundance of Actinobacteriota （11.06%），decreased the abundance of Proteobacteria （4.03%），Chloroflexi （2.28%） and Acidobacterioa （1.71%），and significantly increased soil total nitrogen and available potassium content by 14.2% and 37.1%，respectively.Studies have shown that the application of Trichoderma harzianum fertilizer in tobaccogrowing soil can further optimize the bacterial community structure in tobaccogrowing soil and improve soil fertility.

Key wordsTrichoderma;Rhizosphere soil;Bacterial community;Diversity;Soil physicochemical properties;Highthroughput sequencing

植物從土壤中汲取養分來完成各種生命活動，意味著土壤是影響甚至決定植物生長發育狀況的重要因素，但土壤本身必須發育到一定程度才能滿足植物的生長發育需要［1］。土壤微生物作為植物與土壤的橋梁，有促進土壤養分循環、凈化土壤污染、調節土壤生態系統穩定等作用［2-5］。人們通過研究土壤微生物的功能多樣性、群落結構及物種種類多樣性來闡釋土壤生態系統與土壤微生物的關系。由于作物多年連作，生產管理措施不當導致土壤營養流失、土壤微生物群落結構破壞、煙草植株發育不良等，成為制約我國煙草行業發展的重要因素。

木霉是自然界中的一類有益生防菌，據統計，木霉對18個屬30種的植物病原菌具有良好的生防效果，且具有分布廣、適應性強及繁殖快等特點［6-8］，不僅對多種植物病原菌具有拮抗作用，還可以改善作物根際土壤微生物群落結構［9-10］。張麗榮等［11］在西瓜根際土壤中施加木霉制劑可顯著提高土壤中有益微生物的含量，有效改善了土壤根際微生態效應。劉正洋等［12］通過施用木霉生物有機肥發現土壤微生物群落結構和組成發生改變，白菜-甘藍連作體系產量明顯提高。扈進冬等［13］通過對小麥與哈茨木霉拌種處理發現土壤中病原真菌的相對豐度顯著降低。王義坤等［14］通過在連作土壤中施加哈茨木霉發現土壤根系酶活性及活力明顯提高，土壤鐮孢菌豐度顯著降低，對蘋果連作障礙的防控具有良好效果。目前，木霉在小麥、香蕉、棉花等［15-17］土壤微生物多樣性方面的研究已有不少報道，而對于煙草土壤微生物多樣性方面的研究鮮見報道。鑒于此，筆者通過高通量測序的方法對施用哈茨木霉菌劑及未施用哈茨木霉菌劑煙株的土壤微生物群落結構及多樣性進行分析，探究哈茨木霉菌劑對商洛市植煙土壤微生物多樣性的影響，對煙草的生長發育及土壤的可持續發展具有重大意義。

1材料與方法

1.1試驗材料供試煙草品種為云煙99，供試土壤類型為黏壤土，取自陜西省商洛市洛南縣，哈茨木霉Z-19菌劑由河南農業大學煙草科教園區微生物實驗室制備、保存。

1.2試驗設計采用隨機區組排列方法，設2個處理，重復5次。

處理①常規施肥；處理②常規施肥+哈茨木霉菌劑7.5 kg/hm2；常規施肥為煙草專用肥（N∶P∶K=12∶10∶23）7.5 kg/hm2+蚯蚓糞1 t/hm2+西洋復合肥（N∶P∶K=16∶6∶23）150 kg/hm2。

試驗于2020年2—10月在陜西省商洛市洛南縣進行，試驗田地勢平坦，排灌方便。所用哈茨木霉菌劑的質量要求為活菌數≥20億mL，移栽時使用，與移栽水混勻后灌根即可。

1.3土壤取樣

在煙草移栽75 d時，避開雨天和過度干旱期。取樣方法參照文獻［18］，按照5點取樣法在每個處理選取10個取樣點，即每個重復2個取樣點，利用鏟子將煙株周圍10 cm的土壤挖至30 cm深，切割土壤中煙株的任何側根并挖出煙株的整個根部放于盆中，搖動根部用鏟子從根部去除土壤，采集2份盆中的土壤，一部分除去各種雜質后混勻過2 mm篩并取5 g于10 mL無菌離心管中直接干冰運送到上海美吉生物醫藥科技有限公司進行土壤微生物多樣性檢測，剩余部分土壤放于密封袋內快速運回實驗室-80 ℃保存并進行理化性質分析。

1.4土壤理化性質分析

測定方法參照文獻［19］，土壤全氮、全碳用全自動CN分析儀（vario MAX CN，德國）測定;硝態氮和銨態氮用全自動化學分析儀（Smartchem140，意大利）測定;土壤pH用電位法測定;速效磷采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定;速效鉀采用1 mol/L乙酸銨浸提-火焰光度計法測定。

1.5土壤微生物測定分析方法

使用土壤基因組DNA快速抽提試劑盒對土壤微生物群落進行DNA的提取，并利用上海美吉生物醫藥科技有限公司進行高通量測序。測序流程分為PCR擴增、PCR產物的混樣與純化、文庫的構建3部分。對細菌V3～V4可變區進行PCR擴增，其引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。擴增程序：95 ℃預變性3 min，27個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），之后72 ℃穩定延伸10 min，最后在4 ℃保存。

1.6數據分析采用 DPS 7.0 軟件分析處理數據，用R語言工具制圖。

2結果與分析

2.1哈茨木霉菌劑對土壤化學性質的影響由表1可知，與CK相比，T1土壤的全碳、銨態氮和速效磷含量分別提高了10.8％、3.3％、2.1％且不存在顯著差異，T1土壤的全氮、硝態氮及速效鉀含量分別提高了16.7％、91.3％、59.0％且與CK存在顯著差異。說明哈茨木霉菌劑的施用可顯著提高土壤全氮、硝態氮及速效鉀的含量，雖未顯著提高土壤全碳、銨態氮和速效磷的含量，但也稍有提高。

2.2哈茨木霉菌劑對土壤微生物群落結構的影響

2.2.1樣本測序結果。

Veen圖表示土壤樣本中的相同物種及差異物種，抽平后檢測到土壤樣本的微生物總OTUs數為2 293。由圖1可知，CK和T1共有的OTUs總數為1 958，各處理所含的特有OTUs總數分別為171和164，分別占土壤樣本OTUs總數2 293的7.46％和7.15％?？傮w來看，施加哈茨木霉后煙株根際土壤的 OTUs 總數比未施加哈茨木霉的有所降低。

稀釋曲線在細菌群落結構多樣性的調查中常用來分析所取樣本量是否足夠及估計樣本群落結構的豐富度。即隨機抽取一定數量的序列作為橫坐標，α多樣性指數值為縱坐標，通過觀察曲線的平穩程度來判斷序列數量是否符合該試驗。隨著土壤樣品量的增加，可能出現測序檢測到的物種種類隨之增加的狀況，由圖2可知，當序列數達5 000時，各土壤樣本曲線均居于平緩，并不隨著土壤樣本量的加大而顯著增加，說明土壤樣本細菌的總DNA測序深度足夠，細菌群落結構置信度高，此次分析結果可靠。

2.2.2土壤細菌群落的α多樣性。

α多樣性指數分析是通過一些統計學指數來分析并評估細菌群落結構的豐度與多樣性，Coverage指數用來描述樣本菌落的覆蓋率，即該次測序是否代表真實狀況，Chao1指數反映了細菌群落結構的豐度，Shannon指數和Simpson指數反映了細菌群落結構的均勻性。由表2可知，各個樣本細菌的Coverage均接近100％，表明此次測序反映了細菌群落結構的真實性。Chao指數和Shannon指數表現為CK＞T1，而Simpson指數與之相反，由此可知，哈茨木霉的施用降低了植煙土壤群落結構的豐度和均勻性；從細菌群落結構的豐度來看，雖然CK和T1處理的Chao1指數不存在顯著差異，但數值上還是出現了差距，即降低了8.0％，施用哈茨木霉的土壤群落結構豐度要小于常規施肥的土壤群落結構豐度；從細菌群落結構的均勻性來看，各處理的Shannon指數和Simpson指數存在顯著差異且施用哈茨木霉的土壤群落結構均勻性顯著小于常規施肥的土壤群落結構均勻性，Shannon指數降低了11.8％，Simpson指數增加了258.8％，說明哈茨木霉菌劑的施用影響了土壤微生物群落結構。

2.2.3土壤細菌群落結構組成。

與Silva數據庫進行比對后，可以得到土壤樣本細菌在門水平下Top10的物種分布圖。由圖3可知，施用哈茨木霉的土壤與常規施肥的土壤群落結構在門水平上基本一致，但相對百分比存在差異。相對豐度較高的放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）及酸桿菌門（Acidobacteriota）為2個土壤樣本的優勢物種，相對豐度達80％以上。放線菌門（Actinobacteriota）在施用哈茨木霉的土壤樣本中的相

對含量高于常規施肥的土壤樣本，分別為42.43％和53.29％，提高了10.86百分點；對于變形菌門（Proteobacteria），T1處理相比CK處理的相對豐度明顯降低了4.03％；各個處理綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteriota）的相對豐度表現為T1＞CK，T1處理的相對豐度相比CK處理分別降低了2.28％和1.71％。

Heatmap圖根據土壤樣本間豐度進行分塊聚類，通過顏色的變化來反映土壤樣本在不同水平上的相關性，紅色越深說明在該水平上土壤細菌生長所受到的促進作用越強，相對豐度也隨之越高，藍色越深說明在該水平上土壤細菌生長所受到的促進作用越弱，相對豐度也隨之越低。由圖4可知，CK處理對變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）及酸桿菌門（Acidobacteriota）的促進作用比T1處理有所增強，對放線菌門（Actinobacteriota）的促進作用比T1處理有所減弱。

2.2.4土壤細菌群落主成分分析。

PCoA分析是一種非約束性的數據降維分析方法，用來分析土壤樣本群落組成的相關性，如果在PCoA圖中的距離越近，則土壤樣本的物種組成越相似。由圖5可知，PC1 和 PC2 解釋率分別為69.67％和12.53％，CK處理主要集中在坐標軸左側，T1處理主要集中在坐標軸右側，說明2組土壤樣本的細菌群落結構組成差異較大。由圖6可知，在 PC1 軸上 CK和T1處理之間的距離較近，說明哈茨木霉的施用改變了土壤細菌群落結構；CK和T1處理之間的箱形長度無明顯差異，說明2個處理的重復性一致。

2.2.5土壤細菌群落LEfSe分析。

LEfSe根據分類學組成對樣本按照不同的分組條件進行線性判別分析（LDA），以此找出對樣本劃分產生顯著性差異影響的群落或物種。對CK和T2組土壤樣本進行LEfSe多級物種差異判別分析來檢測具有顯著差異的微生物，并采用LDA線性判斷分析來評估每個物種對差異效果影響的程度。由圖7可知，在CK土壤樣本中，變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、Sumerlaeota、Abditibacteriota及Bdellovibrionota顯著富集；在T1土壤樣本中，放線菌門（Actinobacteriota）、Dependentiae及脫硫菌門（Desulfobacterota）發生顯著富集。由圖8可知，變形菌門（Proteobacteria）對CK組土壤的群落結構影響最大，而放線菌門（Actinobacteriota）對T1組的土壤群落結構影響最大。

2.2.6優勢菌門與土壤化學指標的相關性分析。優勢菌門與土壤化學指標的相關系數用來表明環境因子與物種之間的相關程度，挑選相對豐度前10的物種與土壤理化指標進行相關性分析，結果見表3。由表3可知，放線菌門與全氮和速效鉀的正相關程度最明顯為0.38；變形菌門與速效鉀的負相關程度最明顯為-0.62；綠彎菌門和酸桿菌門與銨態氮的負相關程度最明顯分別為-0.60和-0.67。

3討論

土壤細菌的物種多樣性指數可反映土壤細菌群落結構的豐富度和多樣性［20］。該研究結果發現，施用哈茨木霉菌劑的土壤樣本的Shannon指數和Simpson指數均存在顯著差異，Chao1指數不存在顯著差異，但數值上還是出現了差距，說明哈茨木霉菌劑的施用降低了土壤細菌群落的豐富度和多樣性。從土壤細菌群落結構的組成可以看出，施用哈茨木霉的土壤與常規施肥的土壤群落結構在門水平上基本一致，相對豐度較高的放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）及酸桿菌門（Acidobacterioa）為2個土壤樣本的優勢物種，這與楊菁等［21］研究結果一致。放線菌是一類抗生素生產菌，通過寄生于植物體內來讓植物產生抑菌物質，從而提高植物的抗病性［22］。同時，放線菌門常以孢子形態共存于土壤之中，對植物供給養分，促進植物生長發育［23］。該研究表明，施用哈茨木霉會導致土壤肥力不同程度的提高，其中施用哈茨木霉的土壤中放線菌門（Actinobacteriota）的相對豐度顯著提高，通過分析表明放線菌門（Actinobacteriota）與土壤全氮和速效鉀的含量呈正相關關系，從而導致土壤全氮和速效鉀含量的顯著提高；放線菌門（Actinobacteriota）會產生抑菌物質來提高煙株的抗病性且供給更多的養分來促進煙株生長發育。變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）及酸桿菌門（Acidobacteriota）在土壤群落結構中相對豐度減少可能是因為放線菌門（Actinobacteriota）相對豐度的增加導致土壤中部分養分被競爭，從而相對豐度減少［24］。施用哈茨木霉也會使其他土壤肥力指標的含量不同程度的增加，這是因為施用哈茨木霉可促進土壤中有機質的形成與轉化從而提高土壤肥力［25］。

4結論

該研究結果表明，施用哈茨木霉菌劑可顯著改變土壤的細菌群落結構，施加哈茨木霉后植煙土壤細菌群落物種多樣性降低，在門水平上的優勢菌群中放線菌門（Actinobacteriota）的含量顯著增加，變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）及酸桿菌門（Acidobacteriota）的含量降低，土壤全氮和速效鉀含量顯著提高。哈茨木霉的施用優化了植煙土壤的細菌群落結構，提高了土壤肥力。研究結果揭示了哈茨木霉菌劑對商洛市植煙土壤微生物多樣性的影響，這為優化輪作煙草根際土壤的細菌群落結構、細菌群落物種組成及土壤的可持續發展奠定了一定的基礎。

參考文獻

［1］馮林，申濤，徐一飛，等.土壤微生物對植物生長的作用［J］.種子科技，2019，37（15）：110，112.

［2］王寶榮，楊佳佳，安韶山，等.黃土丘陵區植被與地形特征對土壤和土壤微生物生物量生態化學計量特征的影響［J］.應用生態學報，2018，29（1）：247-259.

［3］宋長青，吳金水，陸雅海，等.中國土壤微生物學研究10年回顧［J］.地球科學進展，2013，28（10）：1087-1105.

［4］吳小虎.氟磺胺草醚對土壤微生物多樣性的影響［D］.北京：中國農業科學院，2014.

［5］康萍芝，張麗榮，沈瑞清，等.哈茨木霉制劑對設施連作番茄根際土壤微生物的生態效應及防病作用［J］.農藥，2013，52（2）：128-131.

［6］孫虎，楊麗榮，全鑫，等.木霉生防機制及應用的研究進展［J］.中國農學通報，2011，27（3）：242-246.

［7］陳捷，朱潔偉，張婷，等.木霉菌生物防治作用機理與應用研究進展［J］.中國生物防治學報，2011，27（2）：145-151.

［8］杜嬋娟，晏衛紅，潘連富，等.木霉制劑對茉莉白絹病和土壤微生物數量的影響［J］.中國農學通報，2014，30（1）：169-173．

［9］李淼，產祝龍，檀根甲，等.木霉菌防治植物真菌病害研究進展［J］.生物技術通訊，2009，20（2）：286-290.

［10］郭成瑾.騰格里沙漠固沙植物根際土壤真菌多樣性及生防木霉抑菌作用機制研究［D］.蘭州：甘肅農業大學，2020.

［11］張麗榮，陳杭，康萍芝，等.木霉制劑在西瓜土壤中定殖能力及其對根際土壤微生物區系的影響［J］.北方園藝，2018（21）：49-53.

［12］劉正洋，王若斐，喬策策，等.木霉生物有機肥對白菜和甘藍產量及土壤微生物區系的影響［J］.南京農業大學學報，2020，43（4）：650-657.

［13］扈進冬，楊在東，吳遠征，等.哈茨木霉拌種對冬小麥生長、土傳病害及根際真菌群落的影響［J］.植物保護，2021，47（5）：35-40.

［14］王義坤，蘇厚文，段亞楠，等.三種菌肥對連作平邑甜茶根系生長和土壤真菌群落多樣性的促進效應［J］.植物營養與肥料學報，2020，26（2）：316-324.

［15］黃遠迪.木霉生物有機肥在不同抗病性香蕉品種中應用的微生態效應研究［D］.?？冢汉Ｄ洗髮W，2020.

［16］隋麗娜.木霉防治小麥莖基腐病及對小麥土壤微生物群落的影響［D］.濟南：齊魯工業大學，2021.

［17］李銳.有機替代下綠洲棉田土壤特性與微生物多樣性［D］.石河子：石河子大學，2017.

［18］馮慧琳，徐辰生，何歡輝，等.生物炭對土壤酶活和細菌群落的影響及其作用機制［J］.環境科學，2021，42（1）：422-432.

［19］魯如坤.土壤農業化學分析方法［M］.北京：中國農業科技出版社，2000.

［20］胡瑞文，劉勇軍，周清明，等.生物炭對烤煙根際土壤微生物群落碳代謝的影響［J］.中國農業科技導報，2018，20（9）：49-56.

［21］楊菁，周國英，田媛媛，等.降香黃檀不同混交林土壤細菌多樣性差異分析［J］.生態學報，2015，35（24）：8117-8127.

［22］劉金釗.基于固體廢棄物的益生菌混合發酵及其對土壤微生態的作用機制研究［D］.濟南：齊魯工業大學，2017.

［23］殷全玉，劉健豪，方明，等.高碳基肥配施菌劑對植煙土壤化學性質及微生物的影響［J］.湖南農業大學學報（自然科學版），2019，45（5）：501-506.

［24］康捷，章淑艷，韓韜，等.麻山藥不同生長時期根際土壤微生物多樣性及群落結構特征［J］.生物技術通報， 2019，35（9）：99-106.

［25］康林玉，劉周斌，歐立軍，等.土壤微生物促進作物生長發育研究進展［J］.湖南農業科學，2017（3）：113-116.

基金項目中國煙草總公司陜西省公司科技項目（2021611000270042）。

作者簡介穆耀輝（1970—），男，陜西商洛人，高級農藝師，碩士，從事煙草生產管理技術研究。*通信作者，副教授，博士，從事煙草資源微生物利用與土壤保育研究。

收稿日期2022-05-16