Galectin-1/RAMP在膿毒血癥患者中的表達及對炎性信號通路的調控分子機制研究

杜 蕊,郝麗娜,宋紹華,李棟梁 ,王 來, 趙志濤

(河北醫科大學第一醫院重癥醫學科,河北 石家莊 050000)

膿毒血癥是對感染反應失調導致的器官功能障礙綜合癥,臨床癥狀包括寒戰、發熱、心悸、氣促、精神狀態改變等,嚴重時可致器官功能及循環障礙,病死率高［1-3］。流行病學研究膿毒癥發生率高,全球每年有超過1 800萬嚴重膿毒癥病例,并且以每年1.5%～8.0%的速度上升［4-5］。半乳糖凝集素1(galactose lectin 1,Galectin-1)是半乳糖凝集素家族成員之一,在細菌和病毒感染中發揮作用,還參與神經系統發育和生殖過程,也參與免疫,炎癥,惡性腫瘤,神經系統發育,生殖,骨骼肌生長分化等諸多過程［6-8］,但Galectin-1在膿毒血癥中的作用尚不清晰。重組受體活性修飾蛋白(recombinant receptor activity modifying protein,RAMP)是調控炎癥信號通路的重要分子,研究表明RAMP-/-小鼠術后淋巴水腫加重,淋巴引流異常,心臟淋巴管異常和心力衰竭延遲發作［9-10］,但是RAMP通路分子是否在膿毒血癥患者中異常表達,并且是否受到Galectin-1的調控尚不清晰。因此本研究將于臨床收集膿毒血癥患者,分析其外周血Galectin-1及RAMP表達水平,并通過細胞學實驗探究Galectin-1在單核細胞中對ID3/RAMP信號通路的影響,為Galectin-1在膿毒血癥中發揮的作用提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取河北醫科大學第一醫院2020年5月—2022年5月門診及住院的膿毒血癥患者80例,并收集健康志愿者作為對照80例,抽取患者10 mL外周血,膿毒血癥的納入標準參考《第三版膿毒癥與感染性休克定義的國際共識(簡稱“膿毒癥3.0”)》,機體對于感染的失控反應所導致可以威脅生命的器官功能障礙,sepsis 3.0=感染+SOFA≥2。排除標準:①臨床資料嚴重缺失者。②年齡<18歲。③慢性不可逆疾病如慢性腎功能不全需腎臟替代治療者、惡性腫瘤、血液系統疾病患者。

所有患者均簽署知情同意書,本研究經過河北醫科大學第一醫院倫理委員會審核通過。

單核細胞株TCP-1購自國家實驗細胞資源共享平臺(北京)。

1.2主要試劑及儀器 真空采血管購于美國BD公司,高糖培養基DMEM,胎牛血清和青鏈霉素購于美國sigma公司;10 cm細胞培養皿、15 mL離心管購于美國corning公司;酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購于美國R&D Systems有限公司,CRISPR-Cas9質粒和gRNA及引物由上海生物生工有限公司設計并合成,7500qPCR儀購于美國ABI公司,Western blot電泳儀購于美國BIO-RAD公司。

1.3方法

1.3.1ELISA檢患者外周血血清Galectin-1和RAMP表達水平 于同一時間用真空采血管收集患者外周血10 mL,置于4 ℃離心機,3 000 r/min,離心15 min,收集上清液,分裝到1.5 mL EP管中,冷凍。檢測時嚴格按照試劑盒說明采用ELISA檢測外周血中Galectin-1和RAMP表達水平,于酶標儀下在吸光度450 nm下進行各樣本吸光度,所有樣本3個重復。

1.3.2細胞培養及轉染條件 TCP-1培養條件:DMEM培養液中含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素,CO2培養箱內培養,5% CO2,37 ℃靜置培養;轉染時嚴格按照說明書轉染NC載體和Galectin-1 CRISPR-Cas9質粒,在24孔板中,以細胞密度為30%～50%鋪板,并根據轉染后細胞檢測時間長短決定細胞中板密度,第2天每個孔轉染,方式如下:A將20 pmol SIRNA溶于50 μL Opti-mem無血清培養基中。B將1 μL lipo2000溶于50 μL Opti-mem無血清培養基中,混勻室溫放置5 min。C將AB兩管混合,放置20 min。轉染期間,將24孔板培養基換成無血清培養基,每孔400 μL。將C管mix加入24孔板對應孔中6 h候換成有血清培養基,48 h候用于各組檢測。無序siRNA轉染的細胞即為NC組,Galectin-1 CRISPR-Cas9質粒轉染存活的細胞即為敲除Galectin-1組。

1.3.3細胞上清液炎癥因子檢測 吸取單核細胞上清液,用包被液將抗體稀釋至蛋白質含量為 0.5～20 mg/L,按 100 μL/孔加入酶標板,4 ℃包被 過夜。次日棄去孔內液體,輕輕叩打以吸去殘留液體,加入洗滌液(280～300 μL/孔),漂洗2～3次,每次3～5 min;按200～250 μL/孔加入封閉液,室溫2～3 h后棄去孔內封閉液;用洗滌液或樣品稀釋液將待檢樣品稀釋至所需濃度,抗體孵育后于酶標儀下在吸光度450 nm下進行各樣本吸光度,所有樣本3個重復。

1.3.4qPCR檢測RAMP和ID3表達水平 于冰上,采用1 mL Trizol提取總RNA,嚴格按照盒逆轉錄試劑進行逆轉錄,通過qPCR儀對RAMP和ID3進行mRNA表達水平檢測,引物序列為:RAMP F,5′-CCTCGTGGAGCCAGTTATCAA-3′,R,5′-GTCTGGGATCTCCACCGTCTTC-3′;ID3,F,5′-GAGAGGCACTCAGCTTAGCC-3′,R,5′-GAGAGGCACTCAGCTTAGCC-3′;F,5′-CCC-ATGGGACAACATTCCAA-3′,R,5′-CATGGCG-ACAAGCTCGGTA-3′;GAPDHF,5′-TCTTC-TTTTGCGTCGCCAG-3′,5′-ATCTTCTTTTGC-GTCGCCAG-3′所有操作在冰上進行并避免RNA酶污染。7500Fast系統進行實時熒光定量PCR的條件為:預變性95 ℃10 min,變性95 ℃ 10 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 35 s,35個循環,以GAPDH分別作為內參,以2-△△Ct計算RAMP和ID3相對表達量。

1.3.5Western blot檢測 RAMP和ID3蛋白表達水平將各組細胞冰上RIPA蛋白裂解液在提取總蛋白,BCA法對蛋白濃度進行測定。加入5×SDS的蛋白上樣緩沖液煮沸后分裝于EP管,儲存于-80 ℃備用。濃縮膠電壓80 V 10 min,分離膠電壓120 V 2 h,轉至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉。加入特異性一抗RAMP(1∶1 500,ab72264,英國abcam公司)、ID3抗體(1∶1 000,ab236505,英國Abcam公司)和GAPDH(1∶5 000,ab181602,英國Abcam公司)于4 ℃冰箱過夜。洗膜后加入特異性的羊抗兔二抗(1∶2 000),孵育1 h。TBST洗膜3次,每次5 min,采用ECL化學發光液曝光顯影,于全自動蛋白分析儀BN ProSpec System成像并進行分析。

1.4統計學方法 應用SPSS 23.0統計軟件分析數據。計量資料采用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1膿毒血癥患者一般資料及外周血抗炎通路Galectin-1和RAMP表達水平分析 本研究中最終入組膿毒癥患者80例,年齡23～69歲,平均年齡(41.45±5.21)歲,男性45例,女性35例,革蘭陰性菌感染38例、革蘭陽性菌感染42例;生理與慢性健康評分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ)為21.16±5.72。通過ELISA法檢測膿毒血癥患者外周血抗炎通路Galectin-1和RAMP表達水平,與對照組相比,膿毒血癥患者外周血Galectin-1和RAMP表達升高,差異有統計學意義(P<0.01),見表1。

表1 膿毒血癥患者外周血Galectin-1和RAMP表達水平分析Table 1 Analysis of Galectin-1 and RAMP expression levels in peripheral blood of patients with sepsis

表1 膿毒血癥患者外周血Galectin-1和RAMP表達水平分析Table 1 Analysis of Galectin-1 and RAMP expression levels in peripheral blood of patients with sepsis

組別 Galectin-1RAMP對照組 36.251±4.83233.271±2.181膿毒血癥組51.232±3.11645.292±1.131t值 9.1639.201P值 <0.01<0.01

2.2敲除Galectin-1對單核細胞TCP-1炎癥因子代謝的影響 檢測敲除Galectin-1對單核細胞TCP-1炎癥因子代謝的影響,與對照組和NC組相比,敲除Galectin-1組細胞白細胞介素6(interleukin 6,IL-6),白細胞介素8(interleukin 8,IL-8)和白細胞介素10(interleukin 10,IL-10)均顯著增加,差異有統計學意義(P<0.01),NC組和對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 Crisper敲除Galectin-1對單核細胞TCP-1炎癥因子代謝的影響Table 2 Effect of Crisper knockdown galactin-1 on the metabolism of TCP-1 inflammatory factors in monocytes

表2 Crisper敲除Galectin-1對單核細胞TCP-1炎癥因子代謝的影響Table 2 Effect of Crisper knockdown galactin-1 on the metabolism of TCP-1 inflammatory factors in monocytes

組別IL-6IL-8IL-10對照組84.557±9.91475.258±9.42190.18±8.041NC組85.092±6.81976.094±8.04189.82±8.821敲除Galectin-1組103.810±2.031*100.410±5.102*109.41±5.012*F值98.51298.90296.007P值<0.001<0.001<0.001

*P值<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

2.3敲除Galectin-1對TCP-1單核細胞炎癥通路ID3/RAMP mRNA表達水平的影響 通過qPCR檢測各組單核細胞炎癥通路ID3/RAMP mRNA表達水平,與對照和NC組相比,敲除Galectin-1組細胞炎癥通路ID3/RAMP mRNA表達水平顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01),NC組和對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 Galectin-1對單核細胞 TCP-1細胞能量代謝分子ID3和Irisin mRNA表達水平的影響Table 3 Effect of Galectin-1 on the expression of ID3 and Irisin mRNA in monocyte TCP-1

表3 Galectin-1對單核細胞 TCP-1細胞能量代謝分子ID3和Irisin mRNA表達水平的影響Table 3 Effect of Galectin-1 on the expression of ID3 and Irisin mRNA in monocyte TCP-1

組別Id3RAMP對照組1.019±0.0191.819±0.052NC組1.007±0.0121.814±0.041敲除Galectin-1組2.211±0.101*2.911±0.311* F值98.62198.721 P值<0.001<0.001

*P值<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

2.4敲除Galectin-1對TCP-1單核細胞炎癥通路ID3/RAMP蛋白表達水平的影響 通過Western blot檢測各組細胞TCP-1單核細胞炎癥通路ID3/RAMP蛋白表達水平的影響,與對照組合NC組相比,敲除Galectin-1組細胞炎癥通路ID3和RAMP蛋白顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01),NC組和對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1,表4。

圖1 Crisper敲除Galectin-1對TCP-1單核細胞炎癥通路ID3/RAMP 蛋白表達水平的影響

表4 Crisper敲除Galectin-1對TCP-1單核細胞炎癥通路ID3/RAMP蛋白表達水平的影響Table 4 Effect of knockdown galactin-1 on the expression level of ID3/RAMP protein in inflammatory pathway of monocyte TCP-1

表4 Crisper敲除Galectin-1對TCP-1單核細胞炎癥通路ID3/RAMP蛋白表達水平的影響Table 4 Effect of knockdown galactin-1 on the expression level of ID3/RAMP protein in inflammatory pathway of monocyte TCP-1

組別ID3RAMP對照組0.194±0.0191.049±0.025NC組0.187±0.0211.044±0.014敲除Galectin-1組0.471±0.011*1.321±0.021* F值98.82098.910 P值<0.001<0.001

*P值<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

膿毒血癥是由感染引起的生理學、病理學以及生物化學異常的臨床綜合癥,嚴重膿毒常伴有器官功能障礙、組織灌注不良或低血壓,給予足量的液體復蘇后仍然伴有無法糾正的持續性低血壓,會重威脅患者生命的安全［11-13］。膿毒癥可以由任何部位的感染引起,臨床上常見于肺炎、腹膜炎、膽管炎、泌尿系統感染、蜂窩織炎、腦膜炎、膿腫等。膿毒血癥病原微生物包括細菌、真菌、病毒及寄生蟲等,發病機制尚不明確,涉及到復雜的全身炎癥網絡效應、免疫功能障礙、凝血功能異常及宿主對不同感染病原微生物及其毒素的異常反應等多個方面因素［14-15］。Galectin-1是一種機體內的穩態信號,與抗炎介質和RAMP作用參與炎癥免疫病理過程,包括抑制急性炎癥;抑制T細胞介導的自身免疫性疾病;改善移植物抗宿主病;使免疫反應的特征偏向于Th2型等。在調控T細胞、B細胞、巨噬細胞、粒細胞等多種免疫細胞,促進免疫耐受,下調先天性和適應性免疫應答中也發揮重要作用［16-18］,但Galectin-1在膿毒血癥患者中的表達和作用尚不清晰。因此本研究通過臨床試驗獲取膿毒血癥患者,通過ELISA分析其血清中Galectin-1和RAMP的表達水平,結果證實膿毒血癥患者Galectin-1和RAMP表達水平升高,提示出在膿毒血癥患者可能出現抑制炎癥因子釋放的過程,因此我們進一步通過細胞學實驗敲除Galectin-1以確認對炎癥因子釋放的影響,通過Crispr-cas9技術敲除Galectin-1后,發現炎癥因子IL-6、IL-8和IL-10表達水平降低,由此提示Galectin-1可能對的單核細胞炎癥因子釋放有關,從而提示患者血清中Galectin-1可能通過炎癥因子調控對膿毒血癥有一定的保護作用。

RAMP/ID3信號通路是炎癥信號通路的重要調控通路,可以調控發熱有關的炎癥因子如白細胞介素1、白細胞介素6、腫瘤壞死因子等,同時對以中性粒細胞為主的免疫反應具有調控作用,并且巨噬細胞或樹突細胞等單核細胞的發育具有調控作用［19］。研究表明:RAMP-/-小鼠的CD11b+細胞數量高于野生型小鼠,并且與促炎性巨噬細胞表型相關基因的表達上調和修復性巨噬細胞表型相關表達的下調有關。免疫細胞中的RAMP信號在炎癥相關淋巴管生成中起關鍵作用,是控制淋巴管生成的重要調控靶點［20］,但是Galectin-1/RAMP炎癥通路對膿毒血癥中的作用尚不清。因此通過細胞學實驗進一步探究了Galectin-1信號通路的作用,通過敲除Galectin-1,結果證實在缺乏Galectin-1的情況下,單核細胞RAMP和ID3 mRNA和蛋白的表達水平顯著上升,提示炎癥控制能力的抑制,結合ELISA炎癥因子白細胞介素6、白細胞介素8和白細胞介素10釋放顯著上升,證實Galectin-1可能通過調控RAMP和ID3的表達干預炎癥因子釋放,在膿毒血癥中發揮一定的保護作用。

綜上所述,本研究證實Galectin-1可以通過調控RAMP信號通路,參與單核細胞炎癥代謝過程,臨床發現的膿毒血癥患者Galectin-1和RAMP表達異?？赡芘c患者患病有關。本研究目前尚不能確定膿毒血癥患者Galectin-1和RAMP表達異常與膿毒血癥炎癥因子釋放的因果關系,因此后續研究可以針對健康志愿者和膿毒血癥患者進行系統性分析,明確Galectin-1在單核細胞炎癥代謝和膿毒血癥發生的因果關系。