糖尿病合并頸動脈狹窄患者中Ang Ⅱ調節T 細胞活性的相關研究

王 凱，金 鳳

（1.內蒙古醫科大學附屬醫院神經外科，內蒙古 呼和浩特 010050；2.內蒙古醫科大學附屬醫院影像診斷科，內蒙古 呼和浩特 010050）

2 型糖尿?。═2DM）是由于各種原因導致的胰島素分泌不足和胰島素敏感性缺乏的一種疾病。T2DM 的發病率逐年上升，糖尿病及其并發癥的治療[1]是世界范圍的問題，對于家庭和社會產生的經濟負擔巨大。T2DM 與周圍血管病、腦血管病和冠狀動脈疾病的發病密切相關[2]。T2DM 中動脈粥樣硬化的發病機制仍是亟待解決的問題，對其機制的研究也是目前熱點。

免疫紊亂是引起T2DM 并發癥的主要原因，報道也較多[3]。免疫紊亂與T 淋巴細胞密切相關。T淋巴細胞分為不同亞型和類別，主要亞型有Th1、Th2和Th17，產生不同類型炎癥相關因子，從而導致感染和免疫內環境穩態破壞[4]。有證據證實特定的T細胞亞型對Ang Ⅱ誘發的高血壓和相關血管紊亂疾病有潛在的影響[4]。所以，我們考慮T 細胞亞型（Th1、Th2 和Th17）可能參與了T2DM 患者的頸動脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis stenosis，CAS）形成；T 細胞亞型可能會促發Ang Ⅱ相關T2DM 患者的頸動脈粥樣硬化的形成和發展。

為了證實我們的推測，在T2DM 患者合并或不合并CA中，研究T細胞亞型的表達。同時研究作為對照組的健康體檢者外周血單核細胞中分離出的T細胞亞型（Th1、Th2 和Th17），應用Ang Ⅱ刺激劑或Ang Ⅱ拮抗劑治療后的T 細胞的變化，進而推測Ang Ⅱ調節T 細胞變化可能促進T2DM 患者的頸動脈粥樣硬化形成?，F報道如下。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象

選取2019年9月至2021年6月診斷為2型糖尿病的患者200 例。根據頸部彩超結果，所有患者被分成兩組，CA 組（2 型糖尿病合并頸動脈狹窄組）100 例和T2DM 組100 例，另外選30 例健康體檢者。根據美國糖尿病協會標準，糖尿病的診斷基于血糖水平和糖化血紅蛋白（HbA1c）水平（血糖水平＞200mg/dL and HbA1c ＞6.5%）。納入標準：勁動脈狹窄經過我院彩超鑒定狹窄≥30%。排除標準：（1）高血壓；（2）冠心??；（3）充血性心衰；（4）急性或慢性炎癥；（5）腦卒中病史；（6）肝功能不全和或腎功能不全；（7）腫瘤和或風濕性疾??；（8）抗炎藥物史如非甾體抗炎藥物、類固醇藥物和其他等。同時，30 例健康體檢者作為對照組。對基本特征（包括年齡、性別、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、高血壓病史、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、吸煙）進行收集和記錄整理。

1.2 血樣處理

禁食情況下肘靜脈采血分裝到兩個真空采血管中，一支用肝素抗凝，離心后分離出上清液裝到無菌EP 管中，之后保存在-80 ℃，用來進行IFN-γ、IL-4 以及IL-17水平的檢測。下層細胞用來分離外周血單核細胞（PBMCs）。另外一支試管裝有乙二胺四乙酸（EDTA）酶抑制劑，在3000 r/min離心4～5 min后，分離出來的血漿裝到無菌EP管中保存在-80 ℃用來檢測Ang Ⅱ。

1.3 分離和培養PBMCs

用聚蔗糖泛影鈉的密度梯度離心法從全血細胞中分離出單核細胞（2500 r/min，10 min）。之后通過磁單元細胞用Miltenyi Biotech 工具（根據說明書）分離單核細胞。用流式細胞術檢測PBMCs 的純度。分離的PBMCs 放在RPMI1640 培養基中，培養基中包括10%牛胎兒血清（FBS）和增補的2 mm 左旋谷酰胺，100 U/mL 青霉素和100 g/mL 鏈霉素，37 ℃，5%CO2保溫箱。

與此同時，從健康體檢者分離出的PBMCs 分成8組，分別用0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L Ang Ⅱ有或沒有氯沙坦（一種Ang Ⅱ拮抗劑；默克和默沙東，英國）作用48 h。

1.4 流式細胞術測定Th1、Th2以及Th17細胞比例

分離出的PBMCs平鋪于24孔板中以2×105cells/孔培養并進行檢測。培育24 h 后，25 ng/mL 聚丙烯酸甲酯（PMA）、50 ng/mL 伊烏諾霉素以及1 μL 莫能霉素加到每個孔中并在37 ℃保存和操作，5% CO2保溫箱中保存4 h，以300 r/min離心分離10 min重懸細胞，加入兔血清封閉30 min，加入兔抗人CD4-PE抗體避光孵育20 min。用PBS液體清洗后按說明書加200 μL固定液固定10 min，用1 mL破膜液體作用10 min。細胞用鼠抗人FITC-IFN-γ、FITC-IL-4以及FITC-IL-17孵育培養，分別在黑暗條件下孵育20 min。最后通過流式細胞術檢測Th1（positive with FITCIFN-γ）、Th2（positive with FITC-IL-4）以及Th17（positive with FITC-IL-17）比例。

1.5 實時反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）

應用試劑盒從PBMCs中提取總RNA，根據說明書用cDNA 組合體（Toyobo，Japan）逆轉錄。實時熒光定量RT-PCR用綠色試劑盒（TaKaRa，Shiga，Japan）在iQ5 檢測系統（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）上進行。過程如下：95 ℃for 4 min；45 cycles of 95 ℃for 5 sec以及62 ℃for 30 sec；

引物序列（Invitrogen，Carlsbad，CA），被用來擴增如下：

基因表達的逆轉錄使得β-actin 標準化和用2-ΔΔCt方法測定。每個樣本做3次，并且每個數據驗證3次。

The fold-change of gene expression was normalized to βactin and calculated using the2-ΔΔCt method. Each sample was

repeated in triplicates and all the experiments were conducted for three times.

1.6 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

血漿中Ang Ⅱ、IFN-γ、IL-4以及IL-17的水平用ELISA 法檢測（Bender 試劑盒，Vienna，Austria），根據產品說明書操作。在溶液中反應30 min，用酶標儀（BIORAD，USA）測定，定在450 nm。

1.7 統計學方法

所有的數據均采用均數±標準差（±s）表示，應用SPSS 18.0 軟件統計分析（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）。組間比較用one-way ANOVA，組內比較LSD 檢驗。檢驗水準為α=0.05，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 所有病例的基本情況和Ang Ⅱ水平

所有參與者的基本情況如表1所示。三組患者中年齡、血糖、總膽固醇和低密度脂蛋白明顯不同，差異有統計學意義（P＜0.05）。吸煙和高血壓在CA組和T2DM組多于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。然而，三組患者中性別、甘油三酯、高密度脂蛋白、收縮壓和舒張壓組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。此外，Ang Ⅱ水平CA組（80.66±17.20）pg/mL明顯高于T2DM組（35.49±15.01）pg/mL和對照組（35.14±0.43）pg/mL，差異有統計學意義（見表1）。

TG：甘油三酯；TC：總膽固醇；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；Ang Ⅱ：血管緊張素Ⅱ。

2.2 T細胞活性的變化

不同組間外周血單核細胞中Th1、Th2 和Th17細胞比例應用流式細胞術（見圖1）。Th1 和Th17陽性細胞數在CA組明顯高于T2DM組和對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；T2DM 組和對照組，差異無統計學意義（P＞0.05）。另外，Th2 細胞比例在三組間，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 流式細胞法檢測的Th1, Th2和Th17

T-bet，GATA3 和RORγt 分別作為Th1、Th2 和Th17 的轉錄因子，也是用外周血單核細胞，應用RT-PCR 試驗檢測（圖2A）。同樣得到，T-bet 和RORγt水平在CA組明顯高于T2DM組和對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；但是GATA3 水平在三組中表達相似，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2A和圖2B 不同組間T細胞的表達因子的表達情況A 不同組間T-bet、GATA3 和RORγt mRNA 水平的表達（PCR）；B 不同組間血漿中IFN-γ、IL-4 和IL-17 表達情況（ELISA）。Column:mean,n=3 and bar:SD；**P ＜0.01 vs control group.

血漿中作為Th1、Th2和Th17的特征因子IFN-γ、IL-4 和IL-17 在CA 組、T2DM 組和對照組進行比較（圖2B）。在CA 組IFN-γ 和IL-17 的表達比T2DM 組和對照組明顯上調，然而IL-4 水平保持不變（P＞0.05）。

2.3 Ang Ⅱ水平的比較

CA 組Ang Ⅱ水平（80.66 ± 17.20）pg/mL 明顯高于對照組（35.14 ± 0.43）pg/mL 和T2DM 組（35.49±15.01）pg/mL，差異有統計學意義（P＜0.05）；后兩組組間比較差異無統計學意義（見圖3）。

圖3 三組患者血漿中Ang Ⅱ水平的比較

2.4 培養PBMCs中效應T細胞比例以及加入Ang Ⅱ和/或ARB后效應性T細胞比例變化的比較

PBMCs 從健康人外周血分離出來后分成8 組，分別加入0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L Ang Ⅱ，不加ARB 的組效應T 細胞的變化以及和分別加入0.1 μmol/L ARB作用48 h的變化，見圖4。Th1和Th17細胞的活性，隨著加入0 μmol/L，0.1 μmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L Ang Ⅱ濃度的增大而表達增高，在10 μmol/L Ang Ⅱ刺激組達到最大效應，與對照組相比，Th1細胞比例增加1倍多，Th17細胞比例增加4倍。在0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L 不同濃度Ang Ⅱ組中均設置相應濃度的氯沙坦（ARB）預處理各個亞組。我們看到的結果是，Ang Ⅱ上調Th1和Th17細胞活性的效應被氯沙坦顯著抑制。

圖4 不同濃度AngⅡ和不同濃度ARB刺激后效應性T細胞比例

我們得到的結果如圖4 所示：與對照組比較，Ang Ⅱ刺激下Th1 細胞比例隨著Ang Ⅱ濃度升高而上調，差異有統計學意義（P＜0.05）；與Ang Ⅱ刺激組比較，氯沙坦預處理+ Ang Ⅱ刺激組Th1 細胞比例下調，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，Ang Ⅱ刺激組Th17 細胞比例隨著Ang Ⅱ濃度升高而上調，差異有統計學意義（P＜0.05）；與Ang Ⅱ刺激組比較，氯沙坦預處理+Ang Ⅱ刺激組Th17細胞比例下調，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，給予Ang Ⅱ刺激和氯沙坦預處理+Ang Ⅱ刺激Th2細胞比例均無明顯變化（P＞0.05）。

3 討論

許多研究者發現大多數心腦血管疾病的發病與動脈粥樣硬化有關，而動脈粥樣硬化的形成和發展與血管炎癥有關，血管炎癥的特征是免疫和炎癥的細胞浸潤明顯呈高水平表達[5]。炎性反應激活了大量免疫T 淋巴細胞，導致免疫功能紊亂而形成正反饋循環，進而增強炎性反應，促進了動脈粥硬化的形成[5]。本研究中，Th1 和Th17 細胞比例的增高，以及mRNA 水平的T-bet 和RORγt 的轉錄因子，血漿中IFN-γ 和IL-17表達水平，這些因子在CA 組患者中相比T2DM 組患者明顯增多（P＜0.05）。本研究結果證實了T細胞活性在伴有2型糖尿病的患者形成頸動脈狹窄的過程中更多的是起著關鍵作用。同時證實假設成立，Th1 和Th17 細胞數及其表達因子和轉錄因子在CA 組中較對照組和T2DM 組明顯增加。這提示Th1和Th17細胞在CA 組患者頸動脈粥樣硬化形成中起到促進作用。

相關研究報道[6]提到Ang Ⅱ廣泛地參與動脈粥樣硬化和冠心病的形成和進展。更多的證據[7]揭示出炎癥事件和血管緊張素系統的相互影響很大。Ang Ⅱ誘導炎癥反應和增加了免疫系統的活性，在Ang Ⅱ受體缺乏的小鼠身上，T 細胞活性被抑制。這些可能說明，伴有T2DM的CA患者形成動脈粥樣硬化過程中Ang Ⅱ和T cell 活性密切相關，我們的研究也得到了相似的結論。

ARB 類藥物如科素亞（氯沙坦的商品名）能夠阻斷血管緊張素受體（AT1），避免血管緊張素Ⅱ結合到受體上，抑制炎癥細胞活性，減少細胞因子、黏附因子等的表達，從而減弱Ang Ⅱ的促炎作用，最終達到防止AS 形成的目的。近年來的研究表明[8～13]，ARB 類藥物如氯沙坦、纈沙坦、替米沙坦等還有抑制Th1 為主的免疫反應、調節免疫的作用。在本組實驗中，我們用氯沙坦預處理作為拮抗劑，不僅顯著使Th1細胞活性下調，而且下調Th17細胞的活性，但對Th2 細胞活性無影響。這提示氯沙坦通過結合T淋巴細胞表面的AT1受體從而抑制Ang Ⅱ所誘導的效應性T 細胞的活化。所以我們得出結論：通過調整T細胞活性和其表達因子，可能促進2型糖尿病的頸動脈狹窄形成和發展。Ang Ⅱ可以調節T 細胞活性及相關因子的表達，可能會促進T2DM患者發生頸動脈粥硬化。

本研究中仍有一些局限性。首先，不同組中年齡的顯著差異，歸因于CA多見于老年人。年齡相一致的對照可能更恰當和更具說服力。同時，Ang Ⅱ和T 細胞活性之間的關系的潛在機制沒有研究，這些需要更深一步的實驗研究。

由此得出結論，Th1 和Th17 細胞比例在CA 組明顯高于T2DM 組和對照組。與此一致，T-bet 、RORγt、IFN-γ和IL-17一樣，其表達都是在CA組明顯高于T2DM 組和對照組。因此，我們推測Ang Ⅱ可能會通過調整Th1、Th17 和相關促炎因子的表達促進伴有T2DM的頸動脈粥樣硬化狹窄的形成。我們的研究可能為研究伴有T2DM的心腦血管疾病新的藥物作用靶點和發病機制提供新的關注點。