番茄黃化曲葉病毒安徽分離物的基因組結構特征及變異分析

蔣 磊，徐世強，徐 凱，丁 菲，江 彤*

番茄黃化曲葉病毒安徽分離物的基因組結構特征及變異分析

蔣 磊1, 2, 3，徐世強1，徐 凱1，丁 菲1，江 彤1, 2, 3*

(1. 安徽農業大學植物保護學院，合肥 230036；2. 作物有害生物綜合治理安徽省重點實驗室，合肥 230036;3. 植物病蟲害生物學與綠色防控安徽省普通高校重點實驗室，合肥 230036)

利用滾環擴增（RCA）技術從安徽淮北番茄溫室表現曲葉癥狀的番茄上獲得番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）的2個分離物全基因組。 2個TYLCV DNA-A核苷酸序列全長均為2 781 nts，共編碼6個ORF。序列比對結果表明，2個TYLCV安徽分離物DNA-A核苷酸序列同源性為99.7%，與已報道的國內外其他24個TYLCV各分離物同源性高達97.8% ～ 99.9%。系統進化分析顯示，TYLCV安徽分離物與來自吉林、沈陽、天津、邯鄲和山東的5個TYLCV分離物親緣關系最近。

滾環擴增；番茄黃化曲葉病毒；序列分析

番茄黃化曲葉病是世界上普遍發生的一種番茄病害[1]，該病是由番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）引起，主要危害番茄、茄子、黃瓜和煙草等經濟作物，感病番茄植株通常表現頂部葉片皺縮、黃化、卷曲，嚴重時植株矮化，生長停止[1-2]。

番茄黃化曲葉病毒屬于雙生病毒科（）菜豆金色花葉病毒屬（）[1]。根據基因組結構的不同，TYLCV可以分為雙組分（DNA-A和DNA-B）和單組分（DNA-A）2種類型，其中DNA-A組分約2.8 kb，由病毒鏈和互補鏈共同編碼，共有6個開放閱讀框（opening reading frame, ORFs），能夠在寄主細胞核內形成雙鏈DNA復制中間體[3-4]。

20世紀中期，已有關于番茄黃化曲葉病毒病的報道，70年代末引起該病的TLYCV才被正式命名，此后迅速蔓延至非洲、中東、澳洲、美洲的中部和南部以及亞洲的南部等熱帶和亞熱帶地區[1]。2006年，TYLCV在我國上海首次報道[5]，隨后相繼在北京、天津、遼寧、江蘇、湖北、四川、新疆等省市和地區檢測到該病毒[6-7]。近年來TYLCV已擴散到我國各省市番茄種植區，每年有近20萬hm2的番茄受到TYLCV的危害，造成的經濟損失高達數十億元，嚴重危害我國番茄產業的發展[8-10]。由于番茄種苗的頻繁調運，煙粉虱已迅速成為淮北市保護地番茄的主要蟲害，煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病發生逐年加重，給淮北市的番茄生產造成嚴重損失。本研究擬采用滾環擴增（rolling circle amplification, RCA）獲得引起安徽淮北番茄黃化曲葉病的TYLCV分離物全基因組，進一步進行序列分析，了解其結構特征及與其他地區TYLCV間的進化關系，明確安徽番茄上TYLCV的起源，為選育和篩選安徽省番茄TYLCV抗病品種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病樣來源

從安徽省淮北市相山區采集疑似感染TYLCV的番茄植株，癥狀表現為葉片褪綠黃化，邊緣卷曲，樣本保存于﹣80 ℃冰箱備用。

1.2 總DNA提取

利用CTAB法[11]提取2個番茄葉片樣本總DNA。

1.3 RCA擴增、RCA-RFLP分析和PCR擴增

利用Templiphi TM Kit（GE Healthcare），按照試劑盒說明書上的步驟以獲得病毒全基因組。擴增產物用H I、d III等限制性內切酶（Promega）處理。酶切體系為：RCA產物3mL、內切酶1mL、內切酶緩沖液 5mL，總體系為50mL，在37 ℃條件下酶切3 h。酶切產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳分離。

設計DNA β特異性引物beta01（5′- GGTACCA CTACGCTACGCAGCAGCC-3′）和beta02（5′- GT ACCTACCCTCCCAGGGGTACAC - 3′）。 PCR反應條件，94 ℃預變性3 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2.5 min， 30個循環后，72 ℃延伸5 min。

1.4 序列測定和分析

割膠回收特異性條帶，構建到用同樣限制性內切酶酶切的pGEM-7zf載體上，委托安徽通用生物有限公司測序。利用軟件DNAStar（DNASTAR Inc, Madison, USA）和DNAMAN Version 5.22（Lynnon Biosoft, Quebe, Canada）進行序列分析。多序列比較采用DNAStar Clustal V方法，系統進化樹構建采用DNAMAN的鄰近相連法（Neighbor-joining）。

2 結果與分析

2.1 用RCA-RFLP分析TYLCV DNA-A

提取2個番茄樣本DNA（AH-HB1和AH-HB2）進行RCA擴增，分別得到一條5.4 kb和2.7 kb的片段（圖1）。

M：DNA marker；1：AH-HB1；2：AH-HB2。

Figure 1 Agarose gel analysis of RCA products

用H I進一步消化RCA產物，酶切后均得到一條約2.7 kb的特異性片段（圖2），克隆并測序，序列長度均為2 781 nts。

M：DNA marker；1：AH-HB1；2：AH-HB2。

Figure 2 Agarose gel analysis of RCA products digested withH I

在NCBI上比對序列發現，這2個片段確為TYLCV的DNA-A組分，二者的序列相似性為99.7%，2個病毒安徽分離物分別命名為TYLCV-AH-HB1和TYLCV-AH-HB2，其GenBank登錄號分別為FN650807和FN650808。利用DNA β特異性引物對提取的總DNA進行PCR檢測，未擴增到TYLCV-AH-HB1和TYLCV-AH-HB2的DNAβ基因組片段，說明番茄黃化曲葉病毒安徽分離物不伴隨DNA β分子。

序列測定表明，2個TYLCV安徽分離物的DNA-A均具有典型的begomoviruses結構，分別編碼6個開放讀碼框（ORFs），其中病毒鏈編碼AV1（CP）和AV2，互補鏈編碼AC1（Rep）、AC2、AC3和AC4，中間被間隔區（IR）隔開。IR區含有莖環結構和保守的九核苷酸序列TAATATTAC。

2.2 TYLCV-AH-HB1 DNA-A與其他TYLCV分離物DNA-A的相似性分析

比對TYLCV-AH-HB1與GenBank已登錄的24個其他地區的TYLCV分離物核苷酸序列性，結果發現，TYLCV-AH-HB1與其他TYLCV分離物DNA-A核苷酸序列相似性為97.8% ～ 99.9%，其中與TYLCV-Shandong（GQ352537）的序列相似性最高，為99.9%。另外，比對TYLCV-AH-HB1與其他TYLCV分離物IR區核苷酸序列相似性以及AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4氨基酸序列相似性發現，IR區核苷酸序列相似性為94.6% ～ 99.4%，AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4氨基酸序列相似性分別為96.1% ～ 100%、98.3% ～ 100%、97.5% ～ 100%、94.8% ～100%、94.0% ～ 100%和95.9% ～ 100%，TYLCV-AH-HB1 AV1、AV2、AC2和AC4均與TYLCV-Shandong相應片段的序列相似性最高，達100%（表1）。

表1 AH-HB1與其他24個TYLCV分離物序列相似性

注:a代表核苷酸序列；b代表氨基酸序列。

2.3 TYLCV-AH-HB1與其他地區TYLCV分離物的系統進化分析

構建TYLCV-AH-HB1與其他地區24個TYLCV分離物的系統進化樹，結果發現，進化樹共分成2個分支，AH-HB1與來自日本、澳大利亞、墨西哥和中國其他地區的17個分離物聚成一個分支，而來自于西班牙、荷蘭、埃及和古巴的4個分離物聚成另外一個分支。AH-HB1與來自于吉林、沈陽、天津、邯鄲和山東的5個分離物親緣關系較近，聚成一個單獨的小分支（圖3）。

3 討論與結論

擴增雙生病毒基因組一般在病毒基因組的IR區設計一對通用引物PA/PB，先擴增出一條約500 bp的片段，再根據測定的序列設計特異性引物反向擴增剩余的大片段，然后拼接獲得理論上的全長基因組。這種方法的缺點是如果一個新的雙生病毒序列變異較大，通用引物PA/PB不一定能擴增出小片段，大片段更是無法獲得。另外，這種方法無法獲得客觀存在雙生病毒全長基因組，如果要進一步構建病毒的侵染性克隆，需要在某個單酶切位點設計一對背靠背引物進行PCR擴增，獲得全長基因組再構建侵染性克隆，方法比較繁瑣。

雙生病毒的復制先以病毒鏈DNA為模板合成互補鏈，形成dsDNA復制中間體，病毒編碼的復制酶蛋白（Rep）切割dsDNA后以互補鏈為模板連續滾環復制出正義鏈DNA[12]。而滾環擴增（RCA）的原理是建立在滾環復制的基礎上，在DNA聚合酶的作用下，這種親代單鏈DNA的延伸可以一直進行下去，產生長短不一的親代DNA多拷貝長鏈，理論上任何一個酶切位點都可以切割出單拷貝全長基因組。這種方法不需要設計引物，也不需要PCR儀，擴增后用一個合適的限制性內切酶消化，將獲得的單拷貝DNA克隆到載體上，無論是測序還是構建侵染性克隆都很方便[13]。

圖3 安徽分離物與其他24個TYLCV分離物的系統進化樹

Figure 3 Phylogenetic tree of Anhui isolate and 24 isolate of TYLCV

本研究采用RCA擴增及基因克隆方法，獲得了侵染安徽淮北番茄的雙生病毒2個基因組全序列TYLCV-AH-HB1和TYLCV-AH-HB2，大小均為2 781 nts，序列相似性為99.7%，與國際上已報道的TYLCV各分離物序列相似性均在97.8%以上，其中與我國其他地區的TYLCV分離物序列相似性均在98.8%以上。利用PCR在感染TYLCV-AH-HB1和TYLCV-AH-HB2的番茄樣本中，均未檢測到DNAβ的存在，之前也有一些報道顯示TYLCV分離物檢測不到衛星分子[14-16]，說明DNA β分子對TYLCV田間分離物致病可能不是必須的。根據目前國際雙生病毒分類方案，可確定引起安徽淮北番茄黃化曲葉病的病原是TYLCV安徽分離物。本文首次對侵染安徽省番茄的TYLCV進行分子鑒定和序列分析，明確了TYLCV安徽分離物的分子特征，為構建TYLCV侵染性克隆鑒定番茄品種抗病性奠定了基礎，也將為安徽省番茄抗病品種的選育以及番茄黃化曲葉病的防控提供科學依據。

TYLCV可通過煙粉虱以持久性方式傳播。隨著皖北地區設施農業的快速發展，為煙粉虱提供越來越多的理想越冬場所，TYLCV大面積暴發的可能性也大大增加。系統進化樹分析發現，TYLCV-AH-HB1與來自東北和華北地區吉林、沈陽、天津、邯鄲和山東各個TYLCV分離物的親緣關系最近，安徽淮北屬于華北地區，山東省是臨近的蔬菜種植大省，山東濰坊和壽光是全國主要的番茄種植地區，安徽皖北部分蔬菜種苗來自于山東省，推測傳染安徽番茄黃化曲葉病的煙粉虱可能隨蔬菜種苗調運從山東傳播到安徽。

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Genomic structure characteristics and variation analysisof tomato yellow leaf curl virus Anhui isolate

JIANG Lei1, 2, 3, XU Shiqiang1, XU Kai1, DING Fei1, JIANG Tong1, 2, 3

(1. School of Plant Protection, Anhui Agricultural University, Hefei 230036; 2. Anhui Province Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops, Hefei 230036; 3. Key Laboratory of Biology and Sustainable Management of Plant Diseases and Pests of Anhui Higher Education Institutes, Hefei 230036)

The whole genomes of two isolates of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) from the tomatos exhibited curved leaf symptom in greenhouse of Huaibei, Anhui Province were obtained by rolling circle amplification (RCA). The two nucleic acid sequences of TYLCV DNA-A were both 2 781 nucleotides (nts) in length, containing six potential ORFs. The results of sequence alignment showed that the nucleic acid sequence homology of the two TYLCV Anhui isolates was 99.7%, and they shared identity of 97.8% - 99.9% with other 24 TYLCV isolates in domestic and foreign. Phylogenetic analysis showed that TYLCV Anhui isolate had the closest relationships with the other five TYLCV isolates from Jilin, Shenyang, Tianjin, Handan and Shandong.

rolling circle amplification; tomato yellow leaf curl virus; phylogenetic analysis

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230625.014

2023-06-27 10:03:22

S432.41

A

1672-352X (2023)03-0446-04

2022-05-03

安徽省重點研究與開發計劃項目（202004a06020013），大學生創新創業訓練計劃項目（dg193404）和安徽省博士后基金項目（2019B360）共同資助。

蔣 磊，講師。E-mail：jianglei062x@ahau.edu.cn 徐世強，碩士研究生。E-mail：xushiqiang1001@sina.com

通信作者:江 彤，教授。E-mail：jiangtong4650@sina.com

[URL] https://kns.cnki.net/kcms2/detail/34.1162.S.20230625.1458.028.html