自噬在干眼病中的作用及調節自噬藥物的研究進展

張迪,梁琦,胡凱

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 眼科,江蘇 南京 210008)

干眼病是一種以淚膜穩態喪失為特征,伴有眼部不適癥狀的多因素眼表疾病,其中淚膜不穩定、淚液高滲、眼表炎癥損傷和神經感覺異常是主要的病理因素[1]。據統計,干眼病全球患病率為5%～50%,我國為21%～30%[2-3],且有患病率逐年增長和患病人群低齡化的趨勢。干眼病的臨床癥狀如眼表干燥、異物感、燒灼感、瘙癢感等嚴重影響患者的工作和生活質量,甚至導致抑郁癥等心理問題[4]。干眼病核心的發病機制是淚液高滲促進眼表細胞產生腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素1β(Interleukin-1β, IL-1β)等炎癥因子,并招募免疫細胞如輔助性T細胞1和17至眼表,過度的炎癥和氧化應激造成眼表細胞凋亡以及腺體和角膜神經損傷,加重淚膜不穩定和淚液高滲,從而形成惡性循環。眼表穩態失衡以及炎癥、氧化應激等損傷是干眼病疾病進展的關鍵因素[5]。

自噬是細胞收到應激信號時重要的防御過程,在維持眼部細胞穩態中發揮著重要作用[6]。自噬主要包括3種形式:巨自噬、伴侶介導的自噬和微自噬。其中,巨自噬(以下簡稱“自噬”)是自噬的主要形式,是指胞質內容物被脂質雙層膜包裹形成自噬小體,隨即與溶酶體結合,被其中蛋白酶降解的過程[7]。線粒體自噬是一種特殊的自噬形式,其過程是靶向功能障礙的線粒體進行清除,從而抵御氧化應激損傷,近年成為眼科疾病機制研究的新方向[8]。除此之外,自噬也是一種細胞死亡方式,在受到刺激時自噬過程加重細胞損傷[9]。Lin等[10]用印跡細胞學的新型冷凍切片技術觀察自噬標記物微管相關蛋白1輕鏈3(MAP1LC3,LC3),發現臨床缺水性干眼患者細胞中的自噬應激程度高于正常人,且淚液中自噬相關蛋白5(autophagy related protein 5, ATG5)也被證明可作為干燥綜合征型干眼有潛力的診斷標志物[11],表明自噬可能參與了干眼病的發病機制。此外,靶向調節自噬治療干眼病的相關藥物研究也越來越多,我們對相關研究進行總結,以期通過探究自噬機制為干眼病的臨床治療提供新角度。

1 自噬在干眼病發病機制中的作用

自噬對干眼病的作用具有雙面性,一方面,激活自噬可以幫助恢復眼表代謝穩態并減輕炎癥及氧化應激損傷;另一方面,自噬也可介導細胞死亡,加重眼表細胞的損傷,從而促進疾病的進展。

1.1 自噬在眼表的保護作用

1.1.1 自噬在眼表代謝穩態中的保護作用 淚膜是眼表的重要屏障,由脂質、水樣液和黏蛋白構成,起著潤滑、抗菌、屈光等多種作用[12]。在眼表的黏蛋白中,催淚蛋白(Lacritin)是一種由淚腺和瞼板腺分泌的保護性蛋白,在眼表起著穩定淚膜、促進淚液分泌、維持上皮穩態的重要作用[13-14],在干眼病患者的淚液中Lacritin含量下降[15]。在Wang等[16]的研究中,在體外使用炎癥因子刺激角膜上皮細胞以模擬干眼眼表的炎癥環境,發現Lacritin可通過快速觸發叉形頭轉錄因子O亞型3蛋白蛋白乙?；捌渑c自噬相關蛋白101偶聯來誘導角膜上皮的自噬,從而維持眼表上皮的穩態。

最近有研究提出了干眼疾病進展中“副炎癥”的概念,這是一種介于基礎和慢性炎癥之間的狀態。在干眼病的初期,副炎癥響應外部和內部刺激因素的應激信號,幫助恢復和維持眼表穩態;當刺激長久存在,副炎癥轉變為慢性炎癥,激活適應性免疫反應,干眼病發展為慢性的損害性疾病。由此,學者提出自噬作為一種細胞內的清潔機制,可在干眼病副反應時期消除炎性小體或功能障礙的線粒體,阻斷疾病進展,是極具價值的疾病治療靶點[17]。胰島素樣生長因子結合蛋白3(insulin like growth factor binding protein 3, IGFBP-3)是一種由角膜上皮細胞分泌的蛋白。Stuard等[18]發現,干眼病中淚液高滲的刺激會破壞眼表的代謝穩態,具體表現為角膜上皮糖酵解活動抑制、線粒體功能障礙、炎癥反應加劇。而IGFBP-3在高滲應激條件下,起著調控代謝穩態、恢復平衡的關鍵作用。隨后,他們團隊進一步研究[19]表明,IGFBP-3在角膜上皮中的保護作用與BNIP3L/NIX和MFN2介導的線粒體自噬有著密切聯系,并且這一結論在結膜上皮細胞中也得到了驗證。

1.1.2 自噬在眼表炎癥中的保護作用 眼表免疫炎癥被認為是干眼發病過程中的核心[20],自噬在調節免疫炎癥過程中的作用已被廣泛研究,TNF-α、γ干擾素等炎癥因子也可以反向調節自噬水平[21]。

眼表炎癥引起角膜細胞的損傷,尤其是角膜上皮細胞。有學者在體外使用高滲培養基處理角膜上皮細胞后觀察到炎癥介質(TNF-α、IL-1β等)以及自噬標志物Atg5、LC3、Unc-51樣激酶1(ULK1)和Beclin1表達量的增加,且自噬激活劑雷帕霉素的應用可以抑制炎癥并促進細胞存活,對干眼病有保護作用[22]。Ma等[23]在干眼小鼠角膜中觀察到自噬水平的輕微上升,并在使用自噬激活劑(LYN-1604)和抑制劑(3-甲基腺嘌呤)之后觀察小鼠角膜的炎癥因子水平以及臨床指標(淚液分泌水平和角膜熒光素鈉染色評分),結果表明激活自噬可以降低小鼠眼表炎癥水平并改善干眼病的臨床癥狀,抑制自噬則效果相反。

眼表炎癥也可導致淚腺細胞的損傷,而白細胞介素1(interleukin-1, IL-1)家族成員在其中的作用最為顯著,Zoukhri等[24]發現向小鼠眶外淚腺注射IL-1α,早期會導致淚腺腺泡和導管上皮細胞的丟失,加重淚液分泌減少的癥狀,但在注射7 d之后,炎癥反應消退,淚液分泌恢復到正常水平,表明淚腺有針對炎癥的自我修復反應。隨后該團隊對淚腺修復的機制進行了深入探究,結果發現,注射早期小鼠淚腺腺泡細胞中自噬泡數量增加,LC3和溶酶體相關膜蛋白1的含量升高,表明炎癥發生后自噬參與了淚腺的修復過程[25]。在此基礎上,有團隊對淚腺修復中自噬激活的具體機制進行了研究,結果表明缺氧誘導因子1α信號的增強可上調自噬水平以防止腺泡細胞損傷并維持正常的淚腺功能[26]。

1.1.3 自噬在眼表氧化應激中的保護作用 氧化應激是干眼病病理過程中的重要環節。淚液高滲會增加眼表活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生,破壞氧化還原平衡,最終誘發氧化應激反應[27]。氧化應激一方面可引起細胞內脂質過氧化和DNA損傷[28],另一方面激活核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)炎癥信號通路,加重眼表炎癥,促進干眼病的疾病進展[29]。

有研究團隊在體外用過氧化氫對人角膜上皮細胞進行處理,發現可加重氧化應激損傷導致細胞死亡,并抑制了細胞的自噬活性[30]。隨后他們發現雷帕霉素可以上調自噬水平以抵抗氧化損傷,在體外初步驗證了干眼病中氧化應激與自噬過程的聯系。香煙煙霧等環境污染已被證明可引發眼表氧化應激,導致淚液不穩定和眼表上皮損傷,成為干眼病的危險因素。Miao等[31]用香煙煙霧暴露作為人角膜上皮細胞和小鼠的病理條件,結果顯示,煙霧通過損傷自噬正常清除受損蛋白質的過程,導致氧化應激反應加劇,而半胱胺可以通過增加自噬活性來減輕相關損傷并改善小鼠角膜上皮細胞的狀態。在此基礎上,Wang等[32]探究了眼表氧化應激損傷自噬的機制,結果表明眼表DNA損傷誘導轉錄物4(DNA damage inducible transcript 4,DDIT4)的表達升高會引發氧化應激,進而導致角膜上皮細胞的自噬受損和細胞活力降低,敲低DDIT4的表達可恢復正常自噬過程并減輕相關損傷。這些研究共同驗證了眼表自噬受損是氧化應激造成病理損傷的重要環節,增強自噬活性對于改善干眼病的癥狀十分重要。

1.2 自噬在眼表損傷中的作用

1.2.1 自噬在淚腺和瞼板腺損傷中的作用 在干眼病的疾病進展中,自噬作為一種細胞死亡方式,可造成淚腺損傷。有研究表明,機體血液中血清素含量持續下降會導致淚腺自噬性細胞死亡和腺泡萎縮,阻礙淚液的分泌[33]。

眼表炎癥誘導的瞼板腺功能障礙可造成淚液脂質缺少,破壞淚膜穩定性,增加淚液蒸發,是干眼病最常見的原因[34]。臨床證據顯示使用碳酸酐酶抑制劑類的青光眼藥物可誘發瞼板腺功能障礙[35],成為干眼病的危險因素。Han等[36]用碳酸酐酶抑制劑多佐胺處理人瞼板腺上皮細胞,發現多佐胺可通過提升細胞中溶酶體數量和自噬體輕鏈標志物表達來影響細胞分化,進一步導致瞼板腺的功能受損,促進干眼病的進展。

1.2.2 自噬在角膜神經損傷中的作用 角膜神經數量減少和敏感性增加會影響疼痛信號的傳遞和處理,這是干眼病患者眼部慢性疼痛癥狀的主要原因[37]。CD25是白細胞介素2受體的重要組成部分,與調節性T細胞的免疫調節作用有關[38]。有研究表明,缺乏CD25的小鼠更容易患干眼病,表現為眼表細胞凋亡和炎癥浸潤[39]。Stepp等[40]在此基礎上探究了CD25缺失導致干眼病的機制,研究結果顯示,在CD25敲除的干眼病小鼠中觀察到自噬蛋白(LC3、Beclin1等)表達增加,表明CD25缺失通過上調感覺神經自噬性死亡的水平導致其形態改變和功能降低,加速了干眼病的疾病進程。

2 靶向調節自噬治療干眼病的藥物

2.1 靶向激活自噬的藥物

2.1.1 雷帕霉素 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)可以通過阻止自噬起始分子ULK1的激活,從而抑制自噬啟動,是自噬負調控的主要靶點。雷帕霉素是靶向抑制mTOR的自噬激活劑[41]。有研究[42]表明,靜脈注射納米顆粒包裹的雷帕霉素結合蛋白聚合物可顯著改善小鼠淚腺中炎癥細胞浸潤的情況,在此過程中自噬調控基因ULK1和ULK2的表達顯著升高。內質網應激是干眼病發病機制研究的新方向,衣霉素可誘導內質網應激造成淚腺毛細血管脫落和腺泡萎縮,最終引發干眼病。因此,有團隊以此為疾病模型研究[43]顯示,腹腔注射雷帕霉素可增加LC3B的含量,從而保護淚腺血管和腺泡細胞來改善干眼病。但雷帕霉素的注射給藥有生物利用度低、副作用大、流程繁瑣等缺點。所以,有團隊嘗試使用聚乙二醇等材料包裹雷帕霉素制成滴眼液進行治療,發現雷帕霉素滴眼治療可通過上調ULK1的表達而發揮緩解淚腺炎癥、增加淚液分泌并改善眼表狀態的作用[44]。衰老也是干眼病重要的危險因素,眼表組織的老化可導致淚腺萎縮和纖維化以及瞼板腺功能障礙等病理變化。Trujillo-Vargas等[45]對衰老小鼠進行雷帕霉素滴眼治療,結果也顯示了雷帕霉素對衰老所致的眼表炎癥和杯狀細胞丟失等癥狀的改善效果。這些結果表明了雷帕霉素調節自噬活性在干眼病中的治療潛力,有望成為干眼病治療的新選擇。

2.1.2 海藻糖 海藻糖是一種天然的雙糖,早在2002年,海藻糖已經成為治療中重度干眼病有效且安全的藥物[46]。一項臨床研究招募了9名干眼病患者,用海藻糖和羧甲基纖維素進行對比治療,發現海藻糖能更好緩解干眼病的癥狀,對其機制進行深入探究發現,海藻糖通過自噬激活和對絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)炎癥通路的抑制來緩解眼表的炎癥[47]。而另一項臨床研究顯示,與單獨使用透明質酸鈉(一種常用人工淚液的成分)治療干眼病相比,在其中加入海藻糖可使治療效果更顯著[48]。這些臨床試驗顯示了海藻糖治療干眼病的臨床價值。關于海藻糖調控自噬的機制研究發現,與雷帕霉素不同的是,海藻糖激活自噬不依賴于mTOR通路,而是作用于轉錄因子EB(transcription factor EB, TFEB),它的功能為調節細胞內的自噬-溶酶體途徑,海藻糖通過促進TFEB入核以提高自噬通量來緩解干眼病的炎癥反應[49-50]。如今,海藻糖已成為市售滴眼液的主要成分,也有研究證明了這類滴眼液可通過激活自噬的方式來發揮對干眼病的治療效果[51]。

2.1.3 褪黑素 褪黑素是一種由松果體分泌的主要成分為吲哚胺的激素,具有抗氧化和抗炎的顯著特性[52],大量研究證明了褪黑素對自噬尤其是線粒體自噬的調控,對神經退行性疾病、缺血再灌注損傷以及癌癥等疾病起有益作用[53]。Wang等[54]先在體外用叔丁基過氧化氫處理人角膜上皮細胞的模型中進行驗證,結果表明褪黑素通過激活血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)通路來挽救角膜上皮細胞受損的自噬通量以顯著改善線粒體功能,減少ROS的累積并抑制細胞凋亡,隨后在干眼小鼠模型中發現腹腔注射褪黑素明顯改善了臨床癥狀。Xu等[55]用共聚膠束的材料負載褪黑素以提高藥物在水溶液中的溶解度和生物活性,結果表明,褪黑素共聚膠束可通過激活PINK分子介導的線粒體自噬來改善干眼病相關的眼表損傷。

2.1.4 骨化三醇 骨化三醇是維生素D3的活性代謝物,具有抗炎和抗凋亡的作用,已被證明具有治療干眼病的潛力[56]。Lyu等[57]研究表明,用骨化三醇治療可以通過激活維生素D受體(VDR)信號通路以增加自噬通量,從而減輕干眼病中細胞凋亡引起的病理損傷。

2.2 靶向抑制自噬的藥物

隨著研究深入,更多的藥物被證明通過靶向調節自噬來緩解干眼病,但調節自噬的機制不同。α-黑素細胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH)是一種具有免疫調節和抗炎功能的神經肽,Chu等[58]研究表明,在干眼病的應激刺激下,自噬過度激活可以促進炎癥增強和細胞凋亡,而α-MSH的治療通過作用于酪氨酸激酶JAK-STAT信號通路中的上皮生長因子受體而降低自噬水平,從而改善病變并保證眼表正常的功能。有研究[59]表明,長期服用抑郁癥的主要藥物選擇性5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine, 5-HT)會加重干眼病中的眼表炎癥和上皮細胞凋亡。因此,有學者猜測5-HT1A受體抑制劑(WAY-100635)可以改善干眼病的癥狀,結果表明WAY-100635通過抑制ROS的累積來抑制自噬水平從而在干眼病中發揮保護作用[60]。

3 結 語

干眼病的公認機制是淚膜不穩定和眼表免疫失衡,隨著研究的深入,我們對疾病的病理變化不斷有著新的認知。自噬作為細胞內重要的代謝過程,在干眼病的疾病進展中起著雙重的作用。一方面,自噬幫助清除多余或有害的細胞成分,起到維持穩態和減輕損傷的作用;另一方面,過度的自我降解可促進細胞損傷,推進干眼病的進程。然而總體來看,自噬在干眼病中的保護作用更加顯著,關于激活自噬延緩疾病進展的分子機制和靶向激活自噬的藥物可能是該研究領域的熱點,相關研究可幫助我們進一步認識和治療干眼病。