ATOH1相關的毛細胞再生新進展

劉宇昕 段清川 張杰

國家兒童醫學中心首都醫科大學附屬北京兒童醫院耳鼻咽喉頭頸外科(北京 100045）

兒童耳鼻咽喉頭頸外科疾病北京市重點實驗室(北京 100045）

在毛細胞體系中，非哺乳動物的毛細胞損傷死亡后可以再生，而哺乳動物的毛細胞損傷后無法再生[1]，往往會造成聽力障礙或永久性聽力缺失，對于了解耳蝸毛細胞的發育、是否可以再生、再生機制、基因調控、是否存在靶點治療途徑，成為一直以來的熱點。已有研究顯示內耳發育和毛細胞再生是由多條信號通路共同調節，Wnt 信號通路、FGF 信號通路、Notch信號通路、BMP 信號通路等交互作用[2，3]。研究發現ATOH1（Atonal homolog 1）在毛細胞損傷時表達上調[4]，受多種信號通路的轉錄調控，是其中最為活躍的基因，在多種器官中的細胞再生中都起著重要作用，但這種多通道性也使得ATOH1表達不夠專一，這種多通道調控表達模式仍需研究探討，本文就ATOH1與其他基因共同表達時的毛細胞再生進展進行討論。

1 ATOH1的多通道調控

ATOH1基因表達產物是一種螺旋-環-螺旋轉錄因子，又叫作MATH1基因，1999年研究顯示胚胎ATOH1缺失小鼠未能產生耳蝸和前庭毛細胞，因此，ATOH1基因是毛細胞發生的必須基因[5]。相關實驗表明，通過質?；蛘呦俨《镜茸鳛檩d體的ATOH1過表達可以誘導耳蝸感覺上皮和非感覺上皮的毛細胞再生[6-9]。在多個系統中，ATOH1都與細胞再生有關，結腸中Lgr5+干細胞損傷后，ATOH1分泌祖細胞不僅可以參與Lgr5+干細胞的生成來修復損傷的結腸，且能夠不依賴于Lgr5+干細胞生成途徑而促進細胞再生恢復損傷的結腸[10]；而且ATOH1在神經系統發育的過程中，在很多區域它的表達都很活躍，ATOH1缺失小鼠會缺乏某種有助于本體感覺和前庭、聽力功能以及呼吸功能的某種表達因子，可能與Shh 信號、Notch 信號與ATOH1交叉調控有關[11，12]。ATOH1在機體的表達過程中是由多通道調控的，研究ATOH1在各個系統中的作用機制有助于研究ATOH1在毛細胞的表達及作用，為毛細胞再生提示新思路。

ATOH1在毛細胞發育分化中同樣受多種信號通路調控，例如BMP 信號通路、FGF 信號通路、Wnt信號通路、Notch 信號通路等[13]。研究表明BMP 通路主要是通過調節IDS基因的表達來調控ATOH1，IDS 蛋白與ATOH1表達的b-HLH 結合阻止功能二聚體的形成從而抑制ATOH1功能作用[14，15]。Notch信號通路則是通過抑制ATOH1的表達來阻止前體細胞分化為毛細胞，轉而分化為支持細胞。研究表明Hes/Hey 結合在ATOH1啟動子上能及時抑制ATOH1的表達,前體細胞最終向支持細胞方向分化[16]。腺病毒介導的ATOH1過度表達使大鼠小上皮嵴誘導異位毛細胞再生，但毛細胞轉導率低，而當Notch 抑制劑DAPT 和ATOH1基因表達聯合應用，通過降低Hes1和Hes5水平而增加ATOH1表達水平，使毛細胞轉導率較前增加，表明抑制Notch信號通路可增加前體細胞向毛細胞轉化的轉導率[17]。Wnt信號通路和ATOH1協同作用，Wnt信號通路刺激能增加ATOH1基因的表達，當Wnt 被抑制時，ATOH1表達水平下降[18]。而β-catenin 通過與其3'增強子結合，激活ATOH1的表達，并可進一步被Wnt 途徑促進，Wnt 信號存在時，β-catenin 積聚，而Notch 通路通過降低β-catenin，也可以降低ATOH1轉錄水平[19]。FGF信號通路可以通過激活MEKK4-ERK 通路來增加ATOH1基因的表達，且有文獻推測通過抑制LSD1使FGF信號通路中的信號分子下調從而抑制毛細胞再生[19,20]，多種信號通路相互作用，共同調控，信號通路之間相互調控的還需要更深入的研究，對毛細胞再生甚至耳聾的發生機制及治療都極為重要。

2 ATOH1 的相關調控因子相互作用調控內耳毛細胞生長發育

ATOH1是毛細胞再生過程中必不可少的基因，過表達ATOH1可以產生毛細胞樣細胞，但毛細胞是一種具有接收機械信號并轉化為電信號的感覺細胞，因此，毛細胞再生需要具有機械轉導通道功能的毛束再生且存活。目前的毛細胞再生研究大多都只是通過激活相關基因表達產生毛細胞樣細胞，但卻不能接收淋巴液的機械刺激產生電信號，由于ATOH1的多通道調控機制，單一基因或途徑可以導致毛細胞的再生，但具有正常生理功能的毛細胞可能需要操縱多種基因和途徑的表達，目前對毛細胞生長和發育重要的細胞通路和基因的研究仍需不斷深入，多種基因與ATOH1互相作用共同表達，可能是未來毛細胞再生治療感應神經性耳聾的重要手段。

2.1 ATOH1與E2F轉錄因子

已知非哺乳動物在毛細胞損傷時可以產生新的毛細胞，這是由于前毛細胞Atoh1 激活再次表達[21]。之前的研究表明，ATOH1表達很大程度上依賴于兩種下游順式調節增強子，增強子A 和增強子B[22]。目前通過基因位點的比較分析，發現了之前推測的增強子C，其序列和位置在禽類中高度保守，但該序列目前未在小鼠和人類基因組中發現。通過結合生物信息學分析、EMSA 和報告基因分析，我們確定了ATOH1基因座與E2F（腺病毒早期基因2 結合因子）轉錄因子家族成員之間的新相互作用，E2F 是細胞周期的關鍵調節因子[23]。E2F1-3因子通過直接結合增強子C 內的一個調節元件來使禽類的Atoh1 表達增加，并且在耳毒性誘導的毛細胞再生過程中E2F1 的核質定位發生變化，這與Atoh1 的重新激活相一致，所以研究結果表明增強子C在毛細胞損傷后Atoh1表達重新激活毛細胞再生的過程中有著重要作用[24]?？赡苡捎诓溉閯游镏性鰪娮覥 的缺失，哺乳動物該毛細胞ATOH1自主激活再生機制已喪失，所以未來是否可以通過改變哺乳動物ATOH1激活表達的途徑來完成毛細胞再生是一可能治療方式。

2.2 ATOH1與Gfi1轉錄因子

獨立生長因子1(growth factor independent 1,Gfi1)，一種已知對造血干細胞自我更新和植入重要的鋅轉錄阻遏物。GFI1 基因是ATOH1的下游靶點，也是POU4F3的下游靶點，POU4F3是另一個ATOH1調節的基因，對毛細胞的存活和成熟起著重要作用[6，25]。研究發現在小鼠胚胎干細胞中同時過度表達Gfi1、Pou4f3和Atoh1可顯著誘導卵巢蛋白中毛細胞樣細胞的有效分化[26]。在內耳，Gfi1 因子在ATOH1表達后不久在毛細胞中產生，是毛細胞正常發育存活所必需的因子。Gfi1 基因缺陷小鼠最初形成耳蝸毛細胞，但形成的毛細胞功能障礙，并最終死亡，這表明Gfi1 因子對毛細胞的存活很重要。雖然ATOH1是毛細胞再生過程中的必須基因，但其在成年哺乳動物耳朵中的轉導率較低，且存活時間較短，所以嘗試通過補充Gfi1來促進毛細胞的再生。在成熟的Pou4f3DTR小鼠中進行體內實驗，通過注射白喉病毒進行消融完全清除其毛細胞。耳蝸支持細胞中分別使用Atoh1或Atoh1+Gfi1的腺病毒表達誘導毛細胞樣細胞的出現，與Atoh1單獨表達相比，Atoh1+Gfi1表達在4周后新的毛細胞樣細胞數量增加6.2 倍，且能夠存活至8 周，在新生兒耳蝸外植體中的數量同樣增加[27]。因此，ATOH1和GFI1聯合誘導表達的新方法可能是成年哺乳動物耳蝸毛細胞成功再生的重要進展。

2.3 ATOH1與Ikzf2調節因子

Ikzf2(Helios)是外毛細胞基因的一個候選調節因子，Ikzf2 因子在內毛細胞中的異位表達誘導了外毛細胞特異性基因的表達，降低了典型內毛細胞基因的表達，并賦予了內毛細胞外毛細胞的電性，這表明Ikzf2 因子能夠部分地將內毛細胞轉錄組向外毛細胞樣細胞轉變[28]。之前的實驗表明，可以通過分析細胞類型的特異性基因的啟動子來發現相關的轉錄調控因子，用以識別統計過度表達的轉錄因子結合基序[29]。通過對外毛細胞標記基因的轉錄因子的結合基序分析最終發現只有Ikzf2 在外毛細胞中所有時間點均富集[30]。種種數據表明Ikzf2在外毛細胞各個時期的轉錄調控中都發揮著重要作用。在之前的研究中，從耳蝸支持細胞中再生新的外毛細胞均缺乏外毛細胞運動蛋白Prestin 的表達，Prestin 運動蛋白是外毛細胞功能的結構基礎。而最新的研究報告成年小鼠耳蝸支持細胞通過同時誘導Atoh1 和Ikzf2 兩種轉錄因子的表達，成功轉化為有Prestin表達的外毛細胞樣細胞，成功建立了一種具有部分功能結構的外毛細胞再生方法[31]。

2.4 ATOH1與BARHL1 3’增強子

Barhl1是果蠅BarH 類同源框基因的小鼠同源基因，在內耳內高度表達，對調節聽覺和平衡的聽覺毛細胞的長期維持至關重要[32]。BARHL1是ATOH1的直接靶基因，而其中BARHL13'增強子中的一個E 盒（E3）對ATOH1表達的b-HLH 介導的BARHL1激活至關重要。破壞E3位點，會導致BARHL1表達顯著缺失，誘導的毛細胞樣細胞數量顯著減少，但是對早期原始外胚層樣細胞和耳祖細胞的分化并沒有影響，所以研究證明對于體外毛細胞樣細胞再生、分化，BARHL13'增強子必不可少[33]。ATOH1通過與特定E3盒結合來調節BARHL1的表達，BARHL1作為ATOH1的下游基因，當E3 盒基因突變時則會影響毛細胞的分化，研究相應的耳聾發病機制能有效推進治療研究進展。

2.5 ATOH1與TUB、ZNF532轉錄因子

研究發現耳蝸外側大上皮嵴內的Sox2+祖細胞進行電穿孔感染，對細胞損傷小，用電穿孔方法進行轉染來研究ATOH1與其他基因共同表達時的HC 轉化效果可能更好[34]。Isl1 促進HC 的轉化，而轉錄因子TUB、ZNF532是Isl1的下游靶點基因表達產物，美國一項研究將Atoh1與在HC 中高度表達的16 個轉錄因子單獨或共同進行電穿孔轉化，并在過程中不斷進行電穿孔方法的優化，測試電穿孔的電流和質粒濃度，最終發現TUB、ZNF532 轉錄因子與Atoh1 基因產物被共同表達時會提高Atoh1的表達產物轉化率，大上皮嵴細胞轉化成毛細胞樣細胞的數目明顯提升[35]。在今后的實驗中可以采用電穿孔方式來研究ATOH1與多個相關基因的再生作用，可能轉錄因子之間相互作用促進ATOH1介導的HC轉導。

3 結語與展望

人類和其他哺乳類動物均喪失了自我再生毛細胞的能力，臨床上毛細胞損傷最終會導致嚴重的聽力損傷。ATOH1是耳蝸毛細胞發育過程的一個重要基因。ATOH1與其他基因聯合表達來治療毛細胞損傷導致的感應神經性耳聾是一個值得研究的問題?？梢詮牡鞍妆磉_層面分析毛細胞產生時的活躍表達基因，但活躍基因與ATOH1共同表達未促進HC轉化也可能是因為該基因為某作用基因的下游靶點，所以可能要多個基因共同表達來研究相關基因在再生過程中的作用，然后聯合表達促進轉化基因嘗試毛細胞再生，想得到完整且具有功能的毛細胞,仍是一個漫長的研究過程。