熒光淬滅劑TrueBlack Lipofuscin對珊瑚自體熒光的消除及其在免疫熒光標記中的應用

賴慶娜,王 路,陳建明

(閩江學院、福建省海洋生物多樣性保護與永續利用重點實驗室,福建 福州 350108)

免疫熒光標記技術(Immunofluorescence Labeling Technology)是抗原-抗體反應與熒光素標記技術結合,用于檢測抗原或抗體的方法,在熒光顯微鏡下,可以直接觀察呈現特異熒光的抗原-抗體復合物及其存在的位置[1]。為了能夠更加完好的保存抗原的免疫活性,常采用冰凍切片的方法對組織進行切片處理[2]。目前免疫熒光標記與冷凍切片技術的聯合使用已經較為廣泛和成熟,尤其是應用在活體熒光、脂質的表達和細胞膜抗原等方面[3]。然而,在組織切片中,自體熒光(autofluorescence,AF)常常干擾特定熒光信號的檢測,已成為干擾免疫熒光染色和數據分析的常見問題。自體熒光是由于內部組織成分或外部處理導致組織在廣泛的激發和發射光譜中自然發出的熒光,是組織或細胞樣本在熒光檢測過程中產生的與目的信號無關的背景熒光信號[4]。有些機體能夠自然發出多個波長的熒光,跨越許多常用熒光報告物的發射光譜和激發光譜,包括抗體、染料、著色劑、探針和轉基因蛋白質,使得特異性熒光和自體熒光很難被區分[5]。

珊瑚綱作為腔腸動物中最大的一個綱,具備先天免疫能力,對環境變化和壓力脅迫具有一定的抗逆性,可通過復雜的細胞識別系統識別非自我組分并啟動下游信號通路,最終產生免疫反應,如吞噬作用、凝血反應和抗菌防御等[6]。因此珊瑚是研究腔腸動物乃至無脊椎動物對環境應激反應的良好研究對象。珊瑚自體熒光來源主要包括共生蟲黃藻(Symbiodinium)葉綠素、自身攜帶的熒光蛋白及其他衍生物產生的背景熒光[7-8]。蟲黃藻葉綠素的激發光譜為488 nm,發射光譜為650～690 nm[9],較易激發自體熒光,這顯著影響了珊瑚在免疫熒光標記實驗中對特異性熒光的判斷,而最簡單有效的方法是通過避免激發自體熒光來減少非特異熒光的產生[10],但是目前在免疫熒光標記實驗中很少有體外熒光基團能夠提供與自發熒光基團完全不同的發射光譜[11]。這就限制了珊瑚冰凍切片免疫熒光實驗效果,干擾抗體標記的目的蛋白熒光的觀察[12]。

圍繞這個問題,本研究以花傘軟珊瑚(Xeniasp.)為研究對象,此種珊瑚因其快速的生長能力及高質量的基因組而廣受關注,被認為是研究生態環境的良好模式生物[13]。此種珊瑚據研究并不含有熒光蛋白[14],但是仍存在明顯的自體熒光,并且目前針對軟珊瑚自體熒光的淬滅尚未查找到相關報道。已有的珊瑚免疫熒光實驗中常采用酒精脫水的方法去除自體熒光[15],不僅費時費力,而且對于花傘軟珊瑚自體熒光淬滅效果較差。本研究首次嘗試在花傘軟珊瑚冰凍切片免疫熒光染色中,使用一種在小鼠和人體組織切片中常用的TrueBlack Lipofuscin自體熒光淬滅劑[16-17](下文簡稱TrueBlack),并與已有研究中的酒精梯度脫水法進行比較,發現TrueBlack可以去除花傘軟珊瑚自身以及蟲黃藻葉綠素在內所產生的自發熒光,有效消除免疫熒光實驗中的自體熒光干擾。本研究可為珊瑚后續的機理研究以及腔腸動物的研究提供新的技術支持。

1 材料與方法

1.1 珊瑚的培養

將花傘軟珊瑚培養于循環海水水族箱中,設置水族箱中的海水溫度為(25±1) ℃,鹽度為32～35,pH=8.1。珊瑚養殖使用HQI-10000K金屬鹵化物燈(BLV-Nepturion)提供有效光輻射強度(PAR)180 μmol/(m2·s),光暗周期為12 h∶12 h[18]。

1.2 免疫組化切片染色

將珊瑚水螅體置于4%(體積分數,下同)的多聚甲醛中4 ℃過夜固定,PBST緩沖液清洗3次。將珊瑚組織塊置于OTC中包埋,然后用冰凍切片機切片,切片厚度為6 μm。冰凍切片由PBS緩沖液清洗3次。0.25%Triton-X滲透10 min后再用PBS緩沖液清洗3次。用70%酒精將TrueBlack(cat：23007,Biotium)稀釋成20×的工作液,將組織切片放置于TrueBlack工作液中孵育2～5 min后用PBS緩沖液清洗3次。組織切片在常溫下用GB緩沖液封閉1 h[GB緩沖液：PBS;10%山羊血清;10% BSA;10 mmol/L NaN3]后,一抗[包括Lamp2a(cat：18528,abcam)、DM1a(cat：7291,abcam)、Tgn38(cat：166594,santacruze),使用GB緩沖液按1∶500(體積比,下同)稀釋]4 ℃下避光孵育24 h。再用PBS緩沖液清洗3次。二抗[包括鼠抗(cat：S0100,蘭博利德)和兔抗(cat：S0101,蘭博利德)]使用TBS按1∶1 000稀釋。常溫孵育1 h后再用PBS緩沖液清洗3次。DAPI(工作液濃度為0.5 μg/ml)染色10 min,用PBS緩沖液清洗3次。最后用80%甘油封片,激光共聚焦顯微鏡SP8(Leica,德國)拍片。

1.3 酒精梯度脫水法

切片滲透處理后進行逐步洗脫,洗脫步驟和順序如下：首先用50%酒精浸泡2 h,然后用70%酒精4 ℃過夜,再用95%酒精浸泡20 min,最后用100%酒精浸泡20 min。酒精脫水后用PBS緩沖液清洗后封片拍片[13]。

1.4 蛋白提取

用液氮研磨樣品至粉末狀(樣品重量約0.1～0.2 g),用1 mL TRIzol快速覆蓋冷粉末,添加研磨珠并在4 ℃下漩渦10～20 min。向樣品中加入總體積1/5的氯仿,用力搖晃樣品1 min,室溫下靜置5 min。4 ℃下,10 000 r/min旋轉樣品15 min。去除剩余的RNA水相。向剩余的有機層中添加0.3 mL 100%酒精,混勻樣品,并在室溫下放置2～3 min。4 ℃下4 000 r/min離心樣品1 min沉淀DNA,取上清液加入1.5 mL異丙醇沉淀蛋白質,將樣品在室溫下放置10 min。在4 ℃下,將樣品10 000 r/min離心10 min。去除上清液,并用0.3 mol/L鹽酸胍溶液洗滌蛋白質顆粒兩次。然后在4 ℃下離心5 min。用95%酒精加2.5%甘油混合液洗滌蛋白質兩次。蛋白顆粒風干不超過10 min后將其溶解在樣品緩沖液[2%(質量分數) SDS、2% 2-巰基乙醇、10%甘油、0.062 5 mol/L Tris-HCl、pH=6.8]中。

1.5 Western blot方法

收集到的蛋白樣品,用BCA蛋白濃度測定試劑盒(B5000-500T,蘭博利德)測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。電泳濃縮膠時使用低電壓(80 V)恒壓電泳,而在溴酚藍進入分離膠時使用高電壓(120 V)恒壓電泳。溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳。浸潤和活化PVDF膜,設定轉膜電流為300～400 mA,轉膜30～60 min。轉膜完畢后,立即把蛋白膜放置到預先加入的Western洗滌液中,漂洗1～2 min,以洗去膜上的轉膜液。加入Western封閉液,在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60 min。去除封閉液,立即加入稀釋好的一抗,4 ℃緩慢搖動孵育過夜。去除一抗后,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4 ℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育1 h。ECL(enhanced chemiluminescence)顯影,檢測蛋白。

1.6 熒光強度計算方法和數據處理

使用萊卡SP8軟件計算每一張切片的熒光強度。P<0.05表示具有差異顯著。

2 結果與討論

2.1 TrueBlack消除自體熒光效果

本研究首先嘗試使用TrueBlack孵育,與傳統酒精脫水的方法比較兩種方法去除自體熒光的效果。圖1為本研究中所使用的花傘軟珊瑚明場下的放大圖。圖2為各熒光通道下TrueBlack法與酒精脫水法處理的珊瑚冰凍切片自體熒光去除效果比較。如圖2所示,對照組在任何通道中都存在明顯的自體熒光,在Cy5中可以清楚地觀察到蟲黃藻葉綠素產生的自發熒光。對每張切片采集5個視野,對圖片進行自發熒光強度統計,結果如圖3所示。酒精處理組和對照組相比,自體熒光有一定程度降低,酒精處理組各通道檢測到的自體熒光強度平均值比對照組低57.2%(DAPI：57%,FITC：44.5%,RHOD：52.3%,TRed：81.4 %,Cy5：50.9%),但是仍可以明顯觀察到蟲黃藻葉綠素自發熒光(圖2中箭頭指向部分)。與對照組和酒精處理組相比,TrueBlack處理組各通道檢測到的自體熒光強度平均值比酒精處理組低52.4%(DAPI：50.7%,FITC：49.5%,RHOD：50.0%,TRed：52.2%,Cy5：59.6%),檢測到的樣品自體熒光最少,并且TrueBlack處理后,在不同通道下幾乎檢查不到蟲黃藻葉綠素的熒光信號。由此判斷,現有的珊瑚免疫組化研究中常采用的酒精脫水方法,并不能高效去除花傘軟珊瑚的自體熒光,而使用TrueBlack處理樣品則可顯著消除花傘軟珊瑚冰凍切片自體熒光。

圖3 各熒光通道下TrueBlack法與酒精脫水法處理的珊瑚冰凍切片自體熒光強度統計Fig.3 Autofluorescence intensity statistics of coral frozen sections treated with TrueBlack method and alcohol dehydration method under different fluorescence channelsP<0.05。

2.2 TrueBlack對特異性免疫熒光標記的影響

冰凍切片通過熒光標記對樣品中待測抗原或抗體進行定性、定位和定量檢測,因此需要探究TrueBlack是否會影響冰凍切片特異性免疫熒光標記。由于二抗普遍存在非特異性熒光干擾的情況[19],所以首先排除二抗非特異性熒光干擾。將軟珊瑚冰凍切片滲透處理后TrueBlack孵育5 min,實驗組分別由羊抗鼠(S0100)和羊抗兔(S0101)二抗孵育處理,對照組僅用配置羊抗鼠和羊抗兔的TBS緩沖液孵育處理(圖4),對每張切片采集5個視野,對圖片進行自發熒光強度統計(圖5)。從圖4和圖5可以看出在各通道下實驗組和對照組的熒光強度無顯著差異,可排除二抗的非特異性干擾,同時在兩個信號通路中,發現Cy5通道對二抗非特異性熒光的去除效果最好。另外珊瑚熒光蛋白的發射光譜和激發光譜如表1[20]所示,Cy5通道的激發光譜波段為630～650 nm,發射光譜波段為660～670 nm,這兩個波段和表1中珊瑚熒光蛋白的激發光譜錯開,對于其他珊瑚而言,Cy5通道還可能避免珊瑚熒光蛋白自體熒光的干擾。

表1 珊瑚熒光蛋白的激發光譜和發射光譜Tab.1 Excitation and emission spectra of coral fluorescent protein

圖5 二抗對TrueBlack處理的珊瑚冰凍切片的自體熒光強度統計Fig.5 Statistics of the second antibody on the autofluorescence intensities of TrueBlack treated coral frozen sections P<0.05。

排除二抗非特異性熒光干擾后,選擇3個對花傘軟珊瑚特異性較強的一抗標記[Lamp2a、DM1a、Tgn38],對照組只做了DAPI處理,不做抗體處理,對照組和實驗組在染料或者抗體處理之前都經過TrueBlack孵育5 min。從圖6可以發現,3個實驗組背景熒光和自體熒光基本去除。對每張切片采集5個視野,對圖片進行自發熒光強度統計,其結果如圖7所示,特異性熒光信號強度平均高于對照組205.3%,其中Lamp2a高出128.6%,DM1a高出304.3%,Tgn38高出183%。為進一步驗證實驗組中一抗和二抗為特異性標記,如圖8所示,取這3種蛋白做Western blot驗證。實驗表明本研究中的抗體與抗原為特異性結合,免疫熒光信號來源于特異性標記熒光信號。

圖7 TrueBlack處理的珊瑚冰凍切片抗體特異性熒光強度統計Fig.7 Statistics of antibody specific fluorescence intensity in TrueBlack treated coral frozen sections 柱狀圖從左往右對應圖6(e)、(f)、(g)、(h)的熒光強度,P<0.05。

圖8 Western blot驗證抗體特異性Fig.8 The specificity of the antibody was examined by Western blotM：蛋白質電泳的標準蛋白 Marker,1：Lamp2a,2：DM1a,3：Tgn38。

2.3 討論

免疫熒光技術中自體熒光的干擾在生物界相當普遍,如在鞭毛蟲、腔腸動物、多毛類、甲殼類與魚類中,而對切片自體熒光的去除無疑為樣品進一步的組化研究提供了更好的保障。為了得出可靠有效的實驗數據,科學家們嘗試采用不同的方法來消除或抑制自體熒光,主要包括化學還原劑、光漂白和熒光淬滅劑。其中,化學還原劑主要針對醛與胺形成的化合物,但是化學還原劑在中性pH環境中不穩定,使得實驗結果的可重復性低[21]。光漂白方法需要將樣品長時間暴露于紫外光下,極易發生不可逆的光氧化,不能用于已經表達熒光的樣品,且實驗耗時較長,需要特定的儀器設備[22]。常用的熒光淬滅劑包括蘇丹黑B、臺盼藍和乙醇胺等,主要通過與發光成分結合吸收入射光而降低自體熒光,但是蘇丹黑B針對不同組織時,濃度及處理時間均需要摸索,較為耗時[23];臺盼藍只在488 nm激發光下才能消除自體熒光[24];乙醇胺消除自體熒光的效果較不佳[25],因此穩定可靠的成品試劑成為消除自體熒光的新選擇。

本研究中所使用的花傘軟珊瑚,已有科學家通過將其再生和單細胞RNA測序耦合,觀察到內共生細胞的動態譜系進展,這不僅有助于揭示不同珊瑚吸收或失去內共生體的共同原理[15],也預示著在組裝拼接的高質量基因組和轉錄組數據庫研究背景下,花傘軟珊瑚很可能成為研究內共生、快速生長等方面的潛在模式生物。這就急需建立成熟穩定的生物學技術以供研究使用。而TrueBlack法與酒精梯度脫水法相比,一方面保留了酒精脫水的優點,TrueBlack在使用前需要用70%的酒精溶解,所以TrueBlack工作液中含有酒精,有助于切片脫水徹底,另一方面又彌補了酒精脫水法對珊瑚自體熒光消除不顯著的不足,尤其在去除蟲黃藻葉綠素自發熒光方面,不僅簡化了實驗步驟,縮短實驗時長,同時還降低了樣品變形和細胞損失的可能性?？偠灾?TrueBlack以其高效、便捷、可重復強等優勢成為消除珊瑚自體熒光的理想選擇。

值得注意的是,在已有研究中,TrueBlack是被設計用于淬滅脂褐質產生的自體熒光,脂褐質是免疫細胞在衰老、吞噬過程中在胞質內產生的沉積物[26],TrueBlack利用其疏水性有效結合富含脂質的脂褐質,吸收入射光而減少自體熒光的產生。同時也指出這款自體熒光淬滅劑對其他組織如誘導的熒光或者膠原質或彈性蛋白的內源熒光等自體熒光的降低沒有顯著效果。珊瑚雖然脂質含量較高[27],但是目前尚未有報道稱珊瑚中含有脂褐質,且脂褐質主要存在于脊椎動物中[28]。有報道稱軟珊瑚中含有多種活性物質[29],猜測珊瑚體內可能存在與脂褐質類似的富含脂質的物質,而這種物質在免疫過程中可能扮演一定角色值得深入挖掘。TrueBlack高效去除珊瑚冰凍切片中自體熒光的能力或許可以為后續珊瑚的免疫研究提供新的思路。

3 結論

本研究發現使用熒光淬滅劑TrueBlack后,花傘軟珊瑚組織切片中的自體熒光強度是傳統的酒精梯度脫水法的52.4%,在珊瑚免疫熒光標記實驗中TrueBlack實驗組的特異性熒光強度為對照組的205.3%,并且珊瑚內蟲黃藻葉綠素自發熒光也有較好的去除效果。由此推測TrueBlack與傳統的珊瑚自體熒光去除方法相比,效果更佳。TrueBlack具有高效、便捷、可重復強等優勢,或許將成為消除珊瑚自體熒光的新手段。