miR-488靶向NRSN2介導NF-κB信號通路在骨肉瘤增殖和侵襲中的作用

麥麥提艾力·阿不力克木 艾克白爾·吐遜 梁志林 阿力木·克熱木

骨肉瘤多發于兒童和青少年,占兒童癌癥的3%～5%和成人癌癥的1%,是臨床最常見的骨骼系統原發性惡性腫瘤[1]。雖然新輔助化療的出現使患者的5年生存率有極大地提高,保肢術也逐漸取代截肢術,但相關研究顯示,骨肉瘤仍是一種病死率及致殘率極高的腫瘤[2]。隨著對骨肉瘤認識的不斷深入,骨肉瘤的靶向治療也越來越多的成為研究的重點,探索新的骨肉瘤的生物標志物與治療靶點對于骨肉瘤的治療至關重要。環狀小RNA(microRNA,miRNA)是一種內源性高保守的非編碼小分子RNA,長度為18～24個核苷酸,可在翻譯水平上調控基因表達[3]。miRNA可以通過精確調節基因表達而廣泛調節細胞的生長、增殖、分化、代謝以及死亡等過程[4]。據報道,在骨肉瘤中存在miRNA的異常表達,表明miRNA可能參與骨肉瘤的發病機制[5]。miR-488是miRNA的一種,根據相關研究,miR-488在骨肉瘤細胞中的表達較低,如果過度表達,會抑制骨肉瘤細胞的遷移、侵襲和上皮間質轉化[6]。神經膜蛋白2(neurensin 2,NRSN2)是一種特異性的表達于脊椎動物中樞神經細胞的膜蛋白,存在于神經元囊泡中,由202個氨基酸構成,分子量為28 kDa[7]。Ma等[8]研究表明NRSN2能夠加速肝癌細胞的凋亡和衰老,結果證實NRSN2可能是肝癌的腫瘤抑制基因和長期生存的候選生物標志物。但是NRSN2與骨肉瘤的關系尚缺乏相關研究,NRSN2是否通過與miRNA相互作用調節骨肉瘤的發展也有待進一步研究。本實驗基于miRNA調控網絡,探討miRNA在骨肉瘤發展中的作用,通過miRNA-seq尋找正常癌組織與癌旁組織中的差異miRNA,并研究其與NRSN2的作用機制,為將來研究骨肉瘤的免疫療法提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2022年2月我院治療的骨肉瘤患者(32例)的腫瘤及其癌旁組織。排除標準:(1)術前接受放、化治療;(2)有糖尿病和心腦血管疾病。本研究經醫院倫理委員會批準,并取得患者知情同意。

1.2 細胞與主要試劑 MG63骨髓瘤細胞系購自中科院上海細胞庫;IKK-16(CAS 編號:873225-46-8)購自上海羽朵生物科技有限公司;TRizol購自上海翌圣生物科技股份有限公司; RPMI-1640培養基、胰酶消化液購自武漢普諾賽生命科技有限公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;Firefly Renilla螢光素酶試劑盒和熒光素酶報告載體購自美國Promega公司;PrimeScript RT Kits逆轉錄試劑盒、LipofectamineTM 2000、si-NC、si-miR-488購自美國Invitrogen公司;SYBR Green SuperMix 購自上海羅氏制藥有限公司;GAPDH、NRSN2 和miR-488由上海生工生物工程有限公司合成;Transwell小室購自上海玉博生物科技有限公司;NRSN2抗體、NF-κB(p65)抗體、GAPDH抗體與熒光標記的二抗均購自英國abcam公司;CCK8試劑、4%多聚甲醛和結晶紫購自北京索萊寶科技有限公司;RIPA裂解緩沖液、5% 脫脂牛奶和增強型ECL發光液購自北京普利萊基因技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 miRNA-seq:TRizol法提取骨肉瘤患者腫瘤組織和癌旁組織的總RNA,交給華大基因公司進行miRNA-seq。步驟如下:使用NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3將400 ng RNA進行16個PCR循環,隨機制備成Small RNA-seq文庫。測序文庫在 Illumina 的 NextSeq 500 系統上進行測序,并捕獲50 bp單端讀數。以 miRBase 20.0為參考,mirdeep2和 srna-tools-cli軟件用于獲取潛在miRNA并繪制二級結構[9]。使用 Benjamini &Hochberg方法調整P值。默認情況下,將校正的P值0.05 設置為顯著差異表達的閾值。

1.3.2 細胞培養及傳代:使用RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清與青鏈霉素混合雙抗)培養MG63骨肉瘤細胞,于37℃,5%CO2細胞培養箱中進行培養。當細胞密度達80%～90%時,棄去培養上清,PBS潤洗細胞1～2次,采用胰酶消化液進行消化,培養基終止消化,在1 000 r/min條件下離心4 min,棄去上清液,培養基重懸后傳代培養。

1.3.3 調控mRNA 的靶miRNA預測:使用在線工具ENCORI(https://starbase.sysu.edu.cn/)預測靶向NRSN2基因的miRNA。ENCORI 是一個開源平臺,可以從CLIP-seq、degradome-seq 和 RNA-RNA 相互作用組數據中研究 miRNA-ncRNA、miRNA-mRNA等的相互作用。本研究使用了其中2個功能模塊?！癿iRNA-Target”和“Pan-Cancer”。其中“miRNA-Target”平臺可以通過所有7個miRNA預測數據庫(PITA、RNA22、miRmap、microT、miRanda、PicTar、TargetScan)通過基因的mRNA預測miRNA;“Pan-Cancer”平臺的數據來源于TCGA數據庫中的32種癌癥類型。通過TargetScan數據庫(http://www.targetscan.org/vert_71/)用于預測NRSN2基因與miR-488結合位點。

1.3.4 細胞轉染和分組:將MG63細胞分為si-NC組、si-miR-488組。按照LipofectamineTM2000說明書步驟進行轉染。調整MG63數量并接種于6孔板,使用不含抗生素的完全培養基培養,使轉染時細胞達70%左右生長密度。制備si-miR-488與脂質體的復合物,同時制備無干擾作用的si-RNA (si-NC) 與脂質體復合物,將復合物加入6孔板相應si-NC組、si-miR-488組的孔內,搖動混合,5～6 h將細胞培養基倒掉,PBS洗滌細胞2次,更換為RPMI 1640培養基,48 h后進行后續實驗操作。IKK-16共孵育條件為50 nmol/L,12 h。分為si-NC組、si-miR-488組和si-miR-488+IKK-16組(轉染si-miR-488后給予IKK-16共孵育)。

1.3.5 雙熒光素酶報告基因實驗:雙熒光素酶活性檢測試劑盒(Dual-Luciferase Assay System Kit)檢測雙熒光素受體基因。擴增后,將突變型和野生型NRSN2的3’UTR插入熒光素酶報告載體(pmirGLO),并將miR-NC/miR-488模擬物與熒光素酶質粒共轉染到MG63細胞。48 h后,以海腎熒光素酶活性為標準物,用Firefly Renilla螢光素酶試劑盒測量螢光素酶活性。

1.3.6 qRT-PCR檢測miR-488和NRSN2表達:使用TRIzol收集總細胞和組織 RNA,然后以 PrimeScript RT Kits逆轉錄試劑盒將RNA制備成 cDNA。再以Mx3000P 實時PCR系統 (Thermo Fisher)檢測。PCR條件如下圖所示,94℃ 15 s,60℃ 10 s,72℃ 20 s,共40個循環。隨后,采用2-ΔΔCt方法進行數據分析,其中 GAPDH為內部參考。引物序列:GAPDH-F,5-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3,GAPDH-R,5-GCGCCCAATACGACCAAATC-3;NRSN2-F,5-GGAAAAGGACGCAGTTGGTG-3,NRSN2-R,5-CACTGCATAGCCAGTGGTCA-3;miR-488-F,5-TTCGGGTGAGAGTGAGAATCC-3,miR-488-R,5-GTCTTCTGACCAAGAAACAGCC-3。

1.3.7 CCK8檢測細胞增殖:用細胞計數板對各組細胞進行計數(1×104)后,接種于96孔細胞培養板中,分別在24 h、48 h、72 h時加入10 μl CCK8溶液,37℃繼續培養2 h,酶標儀檢測450 nmol/L的光密度(OD)值,以OD值作為細胞的相對增殖水平。

1.3.8 Transwell侵襲試驗:取各組細胞,胰酶消化后離心,后用無血清RPMI 1640培養基重懸細胞并計數,調整細胞數至2×104個/ml,將細胞鋪板至涂有基質膠的上Transwell小室中。培養箱中培養24 h后,將小室中的細胞用4%多聚甲醛固定、結晶紫染色并在顯微鏡下觀察,隨機選取10個視野進行計數。

1.3.9 Western blot檢測NRSN2和NF-κB(p65)蛋白表達:使用RIPA裂解緩沖液提取細胞蛋白,然后進行12% SDS-PAGE以分離提取的蛋白質,轉移到 PVDF膜上,使用 5%脫脂牛奶封閉膜,并分別與一抗溶液在4℃下孵育過夜,包括NRSN2抗體(稀釋比1∶1 000)、NF-κB(p65)抗體(稀釋比1∶1 000)、GAPDH抗體(稀釋比1∶5 000)。之后,使用二抗 HRP 標記的兔 IgG(1∶5 000) 進一步孵育條帶。采用增強型ECL發光液進行蛋白質可視化,Image-Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶的灰度值進行分析。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織與癌旁組織中NRSN2及miR-488表達比較 qRT-PCR結果顯示,與癌旁組織比較,腫瘤組織NRSN2 mRNA表達水平升高。根據腫瘤組織NRSN2表達水平的前1/3和后1/3,分為NRSN2高表達和NRSN2低表達腫瘤組織。miRNA-seq結果顯示,與NRSN2低表達腫瘤組織比較,NRSN2高表達腫瘤組織中有276個miRNA表達升高,294個miRNA表達降低,其中miR-488降低顯著。qRT-PCR結果顯示,與癌旁組織比較,腫瘤組織miR-488 mRNA表達水平降低(P<0.01)。Spearman相關系數分析結果顯示,miR-488表達與NRSN2表達呈負相關(R=0.4019,P<0.05)。見表1,圖1。

圖1 癌旁組織和腫瘤組織差異miRNA比較;A miRNA-seq檢測癌旁組織和腫瘤組織差異miRNA;B Spearman分析miR-488和NRSN2相關性

表1 癌旁組織和腫瘤組織NRSN2和miR-488表達比較

2.2 沉默miR-488抑制NRSN2和NF-κB信號通路 qRT-PCR結果顯示,與si-NC組比較,si-miR-488組miR-488 mRNA表達水平降低,NRSN2 mRNA表達水平升高(P<0.05)。Western blot結果顯示,與si-NC組比較,si-miR-488組NRSN2和NF-κB(p65)蛋白表達水平升高(P<0.05)。見表2,圖2。

圖2 3組細胞NRSN2和NF-κB(p65)蛋白條帶圖

表2 3組細胞miR-488和NRSN2表達比較

2.3 miR-488靶向結合NRSN2 對調控NRSN2的miRNA進行預測。結果顯示,有83個miRNA與NRSN2存在≥8個堿基互補,包括miR-488。熒光素酶報告實驗結果顯示,在野生型NRSN2中,miR-488組熒光強度低于miR-NC組[(0.48±0.03)∶(1.00±0.07),t=4.363,P<0.001];而在突變型NRSN2中,miR-488組和miR-NC組熒光強度差異無統計學意義[(0.98±0.08)∶(1.02±0.07),t=0.388,P=0.717]。見圖3。

圖3 miR-488靶向結合NRSN2;A NRSN2靶miRNA預測分析;B miR-488與NRSN2結合位點

2.4 抑制NF-κB信號通路拮抗miR-488對骨肉瘤細胞增殖和侵襲的影響 Western blot結果顯示,與si-miR-488組比較,si-miR-488+IKK-16組NF-κB(p65)蛋白表達水平降低(P<0.05)。CCK8結果顯示,與si-miR-488組比較,si-miR-488+IKK-16組細胞增殖水平降低,在72 h時表現出顯著性差異(P<0.05);與si-NC組比較,si-miR-488+IKK-16組細胞增殖水平沒有顯著性差異(P>0.05)。Transwell結果顯示,與si-NC組比較,si-miR-488組細胞24 h的侵襲水平減少,差異有統計學意義(P<0.05);與si-NC組比較,si-miR-488+IKK-16組細胞24 h的侵襲水平無顯著性差異(P>0.05)。見表2、3,圖3。

si-NC組 si-miR-488組 si-miR-488+IKK-16組

2.5 沉默miR-488促進骨肉瘤細胞增殖和侵襲 CCK8結果顯示,與si-NC組比較,si-miR-488組細胞增殖水平增加,在72 h時表現出顯著性差異(P<0.05)。Transwell結果顯示,與si-NC組比較,si-miR-488組細胞24 h的侵襲水平增加(P<0.05)。見表3,圖4。

表3 3組細胞增殖水平和侵襲能力比較

3 討論

骨肉瘤屬于常見的原發性惡性腫瘤,多發于青少年[10,11]。自20世紀70年代至今,手術切除和藥物化療一直是骨肉瘤的主要治療手段,患者總體生存率停滯于60%左右[12]。截肢手術是20世紀70年代前治療骨肉瘤的標準方法,但該種手術對患者的肢體功能影響大,帶來的心理傷害也不可估量,大部分截肢術患者死于確診后1年內,5年內生存率較低[13]。隨著科技的發展,分子靶向治療、免疫靶向治療和基因靶向治療逐漸成為研究熱點。

NRSN2依賴NRSN1微管蛋白結合運輸系統,是神經軸突生長的關鍵步驟[14]。既往研究發現,NRSN2與人類癌細胞有關,與鄰近的非腫瘤組織相比,人類乳腺癌組織中 NRSN2 基因和蛋白質的表達水平顯著上調[15]。Keremu等[16]發現,NRSN2可以通過PI3K/Akt/MTOR和Wnt/β-catenin信號通路促進骨肉瘤細胞增殖與生長,但是NRSN2影響骨肉瘤的機制仍需進一步研究。本實驗中,我們發現與癌旁組織比較,腫瘤組織NRSN2表達水平升高,這與前人的研究結果[16,17]一致,提示NRSN2參與了骨肉瘤的發生發展。

隨著生物信息技術的發展,miRNA已成為基礎醫學研究的一個重要領域,對基因的表達具有強大的調控作用,也可以作為多種疾病的生物標志物[17]。這些小的非編碼RNA可通過識別3’ UTR位點作用于mRNA,從而調節它們的穩定性,進而影響基因表達水平。miRNA表達的微小變化都可能影響對靶基因調節的程度,從而影響細胞穩態[18]。因此,miRNA 的相對水平及其靶mRNA 可能在各類疾病中發揮關鍵作用。有研究表明miRNA參與了癌癥的發展,miRNA表達的失調與各種癌癥相關,例如在骨肉瘤中,miRNA-1286軸通過誘導氧化應激來抑制細胞侵襲性表型和腫瘤生長,表明miRNA-1286可能作為一種新型的抗腫瘤藥物[19]。Sun等[20]研究發現,與正常成骨細胞系細胞和相鄰非腫瘤組織比較,miR-646在骨肉瘤細胞系和骨肉瘤組織中下調,并與腫瘤的轉移有關,而miR-646 的過表達抑制細胞增殖、遷移和侵襲。以上結果均表明miRNA在在骨肉瘤中發揮重要的調控作用。在本實驗中,通過使用miRNA-seq技術,我們發現在NRSN2高表達腫瘤組織中,有276個miRNA表達升高,其中miR-488降低顯著。通過生物信息學預測發現,與NRSN2 3’UTR存在8個堿基以上結合位點的miRNA共有83個,其中也包括miR-488。顯示miR-488可能靶向結合并調控NRSN2表達。先前的研究表明,miR-488 在多種癌癥中發揮抑癌作用[2]。而最新研究表明,miR-488在骨肉瘤中表達下調,miR-488過表達可抑制骨肉瘤細胞系的增殖、侵襲[6]。在本實驗中,我們發現沉默miR-488促進骨肉瘤細胞增殖和侵襲,這與之前的研究結論一致。

通過相關性分析,我們發現NRSN2與miR-488的表達成負相關性,進一步的熒光素酶報告實驗結果顯示NRSN2與miR-488存在靶向作用,當沉默miR-488可以抑制的表達。以上結果說明,miR-488通過靶向抑制NRSN2發揮抗腫瘤的作用。NF-κB(nuclear factor-kappaB nuclear factor-kappa B)轉錄因子家族廣泛存在于真核細胞中,調控著細胞的生存、生長和凋亡過程,參與炎癥、免疫性疾病及腫瘤等疾病的發生與發展[21]。本研究發現沉默miR-488可以激活NF-κB信號通路,而當使用NF-κB拮抗劑抑制該信號通路后,可以逆轉miR-488下調對骨肉瘤細胞增殖和侵襲的影響。以上結果說明,miR-488能夠靶向NRSN2干預NF-κB信號通路,從而抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲。

綜上所述,miR-488和NRSN2的表達在骨肉瘤患者體內呈負相關,miR-488可能通過靶向負調控NRSN2的表達抑制腫瘤發展,并且機制可能是通過NF-κB介導的。表明miR-488和NRSN2有望作為新的骨肉瘤的治療靶點,miRNA的策略可為進一步探討骨肉瘤的免疫療法提供新的思路。