Keap1/Nrf2/ARE信號通路調控腦出血后氧化應激的研究進展

盧葦 尤紅 張敏

腦出血是神經外科常見疾病之一,起病急,具有高致死率和高致殘率的特點,30 d死亡率高達50%,僅有2%的患者在6個月后能恢復生活自理能力,給社會和家庭帶來沉重負擔[1]。腦出血的原因主要系非創傷性腦實質內血管發生破裂,導致腦實質內血液聚集,引起一系列神經功能缺損,常見出血部位為基底節、小腦、腦干等部位。氧化應激可導致腦出血后嚴重的繼發性損傷,誘導大量自由基的產生并促使腦水腫的發生及脂質過氧化,損害機體神經功能。抑制氧化應激可以減輕這種損害[2]。Keap1/Nrf2/ARE信號通路是主要的抗氧化應激通路,激活該通路可促進機體抗氧化應激酶的表達,利于清除自由基,從而對機體產生保護作用?，F就Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/核因子紅系2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/抗氧化反應元件(ARE)信號通路調控腦出血后氧化應激相關研究進展進行綜述,以期為其臨床研究提供參考。

1 腦出血后繼發性腦損傷機制

除腦出血后的腫塊效應引起腦組織原發性損傷外,腦出血引起的氧化應激等還可引起繼發性腦損傷[3]。腦出血最常見的病因是高血壓,長期高血壓導致血管壁發生玻璃樣變性,血管痙攣后破裂出血,隨后發生氧化應激、小膠質細胞激活、紅細胞溶解并釋放細胞毒性物質、興奮性谷氨酸毒性、線粒體功能障礙及炎癥反應等導致自由基大量產生[4]。同時,人體存在抗氧化系統,當自由基大量生成超過機體抗氧化能力時,將啟動Keap1/Nrf2/ARE抗氧化應激信號通路,并激活其下游抗氧化酶的表達,以減少自由基的產生,減輕出血后繼發性損傷。繼發性腦損傷將通過以下多種機制促使神經元凋亡及壞死,引起神經功能嚴重障礙。

1.1 氧化應激氧化應激可引起神經元大量壞死,其原因主要為自由基的產生超過抗氧化防御系統的清除能力[5],即活性氧(ROS)和活性氮產生過多。ROS是由氧自由基和非自由基氧化劑組成的分子[6],在生理條件下受抗氧化體系的調節并保持在低水平。ROS既可以通過調節激酶、磷酸酶、氧化還原酶敏感轉錄因子等參與細胞信號通路,以調節細胞生長、分化、增殖和凋亡,又可通過調節免疫系統殺死病原體而維持機體正?；顒覽7];另外ROS還可增加機體抗氧化能力和細胞信號轉導[8]。腦出血后,ROS釋放進一步增多,過量的ROS超過機體抗氧化防御系統的能力時,不但可直接氧化脂質、蛋白質和DNA并參與細胞死亡信號通路而損傷細胞[9],還可破壞血腦屏障、引起神經元凋亡和神經炎癥等,對大腦產生損傷?；钚缘橇硪环N重要的自由基,主要由一氧化氮(NO)及其衍生物組成[6],NO由NO合酶在神經元、內皮細胞和活化的星形膠質細胞中產生。在生理條件下,NO介導神經傳遞,調節神經元的生存、增殖和分化。但在病理條件下,NO常引起毛細血管通透性改變、血腦屏障功能障礙,進而促使神經細胞損傷,過量的NO可通過多種機制導致氧化應激,另外,NO與過氧亞硝基陰離子發生反應可引起蛋白質中酪氨酸殘基的氧化和硝化[3]。腦組織易發生氧化應激損傷,其原因為腦組織富含脂類和鐵,相對缺乏抗氧化劑[10],如Nrf2、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)、血紅素加氧酶1(HO-1)等。研究表明,腦出血后大腦中的ROS水平隨著抗氧化酶的減少而增加[11],提示抗氧化應激可改善腦出血后神經功能缺損癥狀,減輕炎癥反應并降低脂質過氧化。

1.2 小膠質細胞激活小膠質細胞是腦內廣泛分布的固有免疫細胞,可促進血腫吸收并誘導神經和血管生成,主要維持中樞神經系統的細胞穩態并識別炎癥刺激的應激信號[12]。小膠質細胞包括兩種亞型,即促炎型(M1型)和抗炎型(M2型)。腦出血后在凝血酶等的刺激下,M1型小膠質細胞過度活化[13],使超氧化物高表達并生成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶,進而釋放大量的ROS和活性氮,誘導氧化應激和線粒體功能障礙[14],導致腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)等多種促炎細胞毒性因子產生,導致神經毒性誘導的神經功能缺損。

1.3 紅細胞釋放細胞毒性物質腦出血后,紅細胞降解產物血紅蛋白、血紅素、膽紅素等在周圍實質中積累[15],血紅蛋白是引起氧化應激損傷的主要調節物,而血紅蛋白氧化損傷的主要途徑是促使自由基的產生[10]。血紅素作為一種親脂性物質,通過脂蛋白受體相關蛋白運輸到細胞內,細胞內的氯化血紅素(hemin)被降解成Fe2+、膽紅素和一氧化碳,Fe2+通過芬頓反應生成羥基自由基,造成ROS含量明顯增加[16],破壞生物膜的穩定性,降低細胞對氧化損傷的耐受性,進而導致血管內皮細胞發生氧化性死亡;此外,血紅素還具有促炎作用。膽紅素濃度升高時可導致神經毒性。

1.4 興奮性氨基酸毒性腦出血后,谷氨酸生成增多,過多的谷氨酸聚集將激活腦內N-甲基-D-天冬氨酸受體[17],促進Ca2+內流和細胞內Ca2+超載,Ca2+內流可激活神經元NO合酶促使NO生成,Ca2+超載可激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOXs)促進超氧化物的生成[18],且NO與超氧化物聚合可形成過氧亞硝酸鹽,均會對DNA產生損傷。

1.5 炎癥反應腦出血后氧化應激誘導的組織損傷還可觸發炎癥反應并釋放炎癥介質,炎癥介質又可直接誘導氧化應激。氧化應激可激活氧化還原敏感的轉錄因子,如激活蛋白1和核因子kappaB(NF-κB)[19],并將炎癥細胞召集到損傷部位,導致促炎因子大量釋放,如NADPH氧化酶等。有研究證實,Nrf2相關信號通路可以下調NF-κB使小膠質細胞向抗炎表型轉化[20]。

1.6 線粒體功能障礙線粒體主要負責能量代謝并調節氧化還原狀態。腦出血后,線粒體內膜陰離子通道(IMAC)打開并伴隨通透性過渡孔(MPTP)的開放[21],導致氧化環境的改變,并觸發ROS的釋放,高水平的ROS結合持續激活的線粒體通透性過渡孔,導致ROS爆發[22],加劇線粒體損傷,形成嚴重的惡性循環,另外還可使ATP生成減少[23],引起神經元損傷及機體穩態失調,導致嚴重的神經功能障礙。

綜上所述,腦出血后ROS增多超過機體抗氧化能力由多種原因引起,ROS增多時不僅會引起氧化應激損傷,還會激活ATM/ATR-p53通路,導致細胞衰老或細胞死亡;此外,還可激活凋亡信號調節激酶1(ASK1)-p38/c-Jun N端激酶(JNK)通路[24],導致細胞死亡,對神經細胞造成嚴重損害。因此,減少ROS的生成是降低出血后氧化應激并保護神經細胞的一種重要方法。

2 Keap1/Nrf2/ARE通路作用機制

腦出血后,大腦中的ROS水平隨著抗氧化酶的減少而增加[11],而抗氧化應激可改善腦出血后神經功能并降低炎癥反應。Keap1/Nrf2/ARE信號通路對中樞神經系統具有重要的調控作用[25],通過調節細胞防御酶對抗氧化應激和/或親電應激[26],是重要的抗氧化應激通路。

2.1 Keap1-Nrf2-ARE概況1999年Itoh等通過酵母雙雜交技術篩選分離出一種新的富硫蛋白和Nrf2的負調控因子[27],并將其命名為Keap1。Keap1至少含有27個半胱氨酸殘基,且具有不同的反應性水平,是Nrf2的氧化應激傳感器和負調控因子[28]。Nrf2是一種具有亮氨酸拉鏈結構域的轉錄因子[29],是內源性抗氧化防御系統的主要調節劑,主要通過轉移到細胞核并介導細胞保護基因的表達而發揮作用,這些基因在其啟動子區域中攜帶一種被稱為ARE的特定序列。在生理狀態下,Nrf2在細胞質中被錨定在Keap1上,與Keap1偶聯形成二聚體,Nrf2/Keap1二聚體與泛素連接酶Clu3形成復合物,介導Nrf2泛素化蛋白酶途徑降解,使胞內Nrf2呈低水平負調控狀態[30]。Keap1可將Nrf2隔離并阻止其轉錄活性[31],并通過Keap1的BTB(Broad complex,Tramtrack和Bric-à-Brac)結構域被泛素蛋白酶體系統快速降解致Nrf2泛素化[32]。

2.2 Keap1/Nrf2/ARE信號通路抗氧化應激機制當發生氧化應激時,Keap1作為氧化還原敏感的開關,被ROS和活性氮等修飾半胱氨酸殘基并使其構象發生改變[33],抑制Nrf2泛素化、促進磷酸化可使Nrf2-Keap1二聚體解偶聯后促使Nrf2進入細胞核,Nrf2穩定增加并與ARE結合,啟動下游醌NADH脫氫酶(NQO-1)、HO-1等抗氧化應激基因的轉錄[34],進而調節抗氧化酶(過氧化氫酶等)和炎癥損傷蛋白的表達[35],發揮清除ROS和活性氮、抑制炎癥和氧化應激反應的作用。

2.3 腦出血后Keap1/Nrf2/ARE信號通路作用機制腦出血后,機體通過氧化應激、小膠質細胞激活、紅細胞釋放細胞毒性物質等途徑產生大量自由基,隨后激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路,Nrf2作為氧化反應途徑的守護者,可以保護細胞免受氧化應激介導的細胞死亡[36],該信號通路在保護大腦免受出血引起的氧化損傷中發揮重要作用[37]。有研究結果顯示,虎杖苷、白藜蘆醇均可通過調節Nrf2/ARE通路和下游基因表達,減少氧化應激反應,在大鼠腦出血模型中發揮神經保護作用[38]。葛花、枳椇子及其配伍組合通過調控Keap1/Nrf2/ARE信號通路,在急性酒精性肝損傷小鼠中發揮抗氧化應激作用[39]。另外,鞣花酸可抑制Keap1導致Nrf2在細胞核內積聚,以減少氧化應激對帕金森病患者神經元細胞的影響[40]。因此,Keap1/Nrf2/ARE信號通路作為最重要的抗氧化應激通路,被激活后可對抗氧化應激,改善神經功能。

綜上所述,腦出血后繼發性損傷是一個復雜的過程,氧化應激在此過程中起重要作用。Keap1/Nrf2/ARE信號通路是體內最重要的抗氧化應激通路,Nrf2可調節機體自由基的平衡及炎癥反應,并保護炎癥損傷后的細胞和組織,在調節腦出血后氧化應激損傷方面發揮非常重要的作用。腦出血后自由基釋放增多,激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路后,可啟動下游抗氧化基因的轉錄,調節抗氧化酶的表達,促進自由基的清除,以抵抗氧化應激損傷。因此,Keap1/Nrf2/ARE信號通路可作為治療腦出血后降低氧化應激并發揮神經保護作用的方法;此外,Nrf2作為一個靶點,可能為改善腦出血后神經功能障礙提供新的治療方向。